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目的:建立銅綠假單胞菌檢查法的標(biāo)準(zhǔn)操作程序,規(guī)范銅綠假單胞菌檢查法的操作。范圍:適用于銅綠假單胞菌檢查法。職責(zé):檢驗(yàn)科主管、檢驗(yàn)員。規(guī)程:1簡(jiǎn)述銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa),習(xí)稱(chēng)綠膿桿菌,為假單胞菌屬菌種,廣泛分布在土壤,水及空氣,人和動(dòng)物的皮膚、腸道、呼吸道均有存在,故可通過(guò)環(huán)境和生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)污染藥品。本菌是常見(jiàn)的化膿性感染菌,在燒傷,眼科及其他外科疾患中常引起繼發(fā)感染,由于本菌對(duì)許多抗菌藥物具有天然的耐藥性,增加了治療的難度,國(guó)內(nèi)外藥典均將銅綠假單胞菌檢查列為檢查項(xiàng)目之一。銅綠假單胞菌按增菌、分離、純培養(yǎng)、革蘭氏染色鏡檢及生化試驗(yàn)等步驟進(jìn)行檢驗(yàn)。儀器、設(shè)備和用具(見(jiàn)大腸桿菌檢驗(yàn)法2)3試液、指示液0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液或磷酸鹽緩沖液[附錄3.1,3.3]1%鹽酸二甲基對(duì)苯二胺試液[附錄2.1]鹽酸試液[附錄2.12]氯仿 [附錄1.57]4培養(yǎng)基4.1營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基[附錄5.1]4.2膽鹽乳糖(BL)培養(yǎng)基[附錄5.6]4.3營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[附錄5.2]4.4溴代十六烷基三甲胺[附錄5.14]4.5綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基(PDP瓊脂)[附錄5.26]4.6明膠培養(yǎng)基[附錄5.27]4.7硝酸鹽胨水培養(yǎng)基[附錄5.28]5對(duì)照用菌液銅綠假單胞菌〔CMCC(B)10104〕營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許,接種至5ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi),于36±1℃培養(yǎng)18~24h后,用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋至1:106,使對(duì)照菌加入量含菌50~100個(gè)(一般用量為0.1ml),菌數(shù)在做陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)的同時(shí)用營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板涂布經(jīng)培養(yǎng)后計(jì)數(shù)確定。6操作方法6.1供試品的取樣量[見(jiàn)細(xì)菌、霉菌(酵母菌)計(jì)數(shù)5.3]6.2供試液的制備,[見(jiàn)細(xì)菌、莓菌(酵母菌)計(jì)數(shù)。6.2]大腸桿菌檢查法。6.3增菌培養(yǎng)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基3瓶,每瓶100ml,2瓶分別加入1:10供試液10ml(相當(dāng)于供試品1g或1ml),其中一瓶加入對(duì)照菌50~100個(gè)作為陽(yáng)性對(duì)照。第3瓶加入與供試液等量的稀釋劑作陰性對(duì)照。于36±1℃培養(yǎng)18~24h(必要時(shí)可延至48h)。陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)生長(zhǎng)良好,陰性對(duì)照菌應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。6.4分離培養(yǎng)輕輕搖動(dòng)上述增菌培養(yǎng)液,以接種取1~2環(huán)培養(yǎng)液(如有菌膜應(yīng)挑取之),劃線接種于溴代十六烷基三甲胺瓊脂平板,于36±1℃培養(yǎng)18~24h。銅綠假單胞菌在該培養(yǎng)基平板上的典型菌落為扁平、圓形或無(wú)定形、邊緣不齊、光滑濕潤(rùn)、呈灰白色,周邊略呈擴(kuò)散現(xiàn)象,在菌落相鄰處常有融合現(xiàn)象。菌落周?chē)S兴苄运{(lán)綠色素?cái)U(kuò)散,使培養(yǎng)基顯藍(lán)綠色,但亦有不產(chǎn)色素的菌株。菌落還有粗糙型和粘液型等,應(yīng)注意挑選。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照平板呈典型菌落生長(zhǎng)時(shí),供試品平板無(wú)菌落生長(zhǎng)或無(wú)疑似菌落生長(zhǎng),可報(bào)告1g或1ml供試品未檢出銅綠假單胞菌。制備供試液,以消除供試品抑菌成分的影響。6.5純培養(yǎng)供試品分離平板生長(zhǎng)6.4所述典型菌落或呈疑似菌落時(shí),以接種針輕輕接觸單個(gè)菌落的表面中心,沾取培養(yǎng)物,應(yīng)挑取2~3個(gè)疑似菌落,分別接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面,培養(yǎng),作以下檢查。6.6革蘭氏染色鏡檢6.6.1革蘭氏染色(見(jiàn)大腸桿菌檢驗(yàn)法6.6.1)6.2.2鏡檢銅綠假單胞菌為革蘭氏陰性,無(wú)芽孢桿菌,單個(gè),成對(duì)或成短鏈排列。6.7生化試驗(yàn)6.7.1氧化酶試驗(yàn)取一小塊白色潔凈的濾紙置平皿內(nèi),以無(wú)菌玻璃棒挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許,涂在濾紙上,隨即滴加1滴新配制的1%二鹽酸二甲基對(duì)苯二胺試液,在30s內(nèi),紙片上的培養(yǎng)物出現(xiàn)粉紅色,逐漸變?yōu)樽霞t色,即為氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)。若培養(yǎng)物不變色或僅顯粉色為陰性反應(yīng)。本試驗(yàn)應(yīng)注意(1)試驗(yàn)菌落(苔)必須新鮮,陳舊培養(yǎng)物反應(yīng)不可靠。(2)試驗(yàn)避免與鐵、鎳等金屬接觸,不可用普通接種針(環(huán))(白金材料除外)挑取菌落(苔)否則易出現(xiàn)假陽(yáng)性。宜用玻璃棒或木棒。(3)試劑宜新鮮配制,放置過(guò)久,二鹽酸二甲基對(duì)苯二胺氧化變色不可用。(4)反應(yīng)需在有氧條件進(jìn)行,勿滴加試劑過(guò)多,以免浸泡培養(yǎng)物使之與空氣隔絕,造成假陰性反應(yīng)。6.7.2綠膿菌素試驗(yàn)取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物接種于綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基(PDP)斜面上,36±1℃培養(yǎng)24h后,觀察斜面有無(wú)色素,如有色素,在試管內(nèi)加氯仿3~5ml,以無(wú)菌玻棒攪拌碎培養(yǎng)基并充分振搖。使培養(yǎng)物中的色素完全萃取在氯仿液內(nèi)。靜置片劑,待氯仿分層,用吸管將氯仿移至另一試管中,加入鹽酸試液(1mol/L)約1ml,振搖后靜置片刻,如在鹽酸液層內(nèi)出現(xiàn)粉紅色,即為陽(yáng)性反應(yīng),無(wú)粉紅色出現(xiàn)為陰性反應(yīng)。如培養(yǎng)基斜面無(wú)色素產(chǎn)生,應(yīng)于室溫培養(yǎng)1~2天再按上法試驗(yàn)。凡經(jīng)再次檢驗(yàn),綠膿菌素試驗(yàn)仍陰性者,應(yīng)繼續(xù)以下試驗(yàn)。6.7.3硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)以接種沾取少許營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物接種于硝酸鹽胨水培養(yǎng)基中,置36±1℃培養(yǎng)24h,觀察結(jié)果。如果在培養(yǎng)基內(nèi)的小倒管中有氣體產(chǎn)生,即為陽(yáng)性反應(yīng),表明該培養(yǎng)物能還原硝酸鹽,并將亞硝酸鹽分解產(chǎn)生氮?dú)?。小倒管?nèi)無(wú)氣泡者為陰性反應(yīng)。6.7.441℃生長(zhǎng)試驗(yàn)以接種環(huán)沾取少許營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物于0.9%無(wú)菌氯化鈉液中,制成菌懸液。然后將菌懸液劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上,立即置41±1℃的恒溫水浴箱內(nèi),務(wù)使整個(gè)斜面浸沒(méi)在水浴中,培養(yǎng)24~48h,斜面如有菌苔生長(zhǎng)者為陽(yáng)性反應(yīng),無(wú)菌苔生長(zhǎng)為陰性反應(yīng)。6.7.5明膠液化試驗(yàn)以接種針沾取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許,穿刺接種于明膠培養(yǎng)基中,穿刺深度應(yīng)接近培養(yǎng)基的底部,于36±1℃培養(yǎng)24h。取出入冰箱內(nèi)10~30min。如培養(yǎng)基呈溶液狀,即為明膠液化試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng);如明膠呈凝固狀,為陰性反應(yīng)。本試驗(yàn)應(yīng)注意(1)本試驗(yàn)接種前,培養(yǎng)基應(yīng)為固態(tài),否則需將培養(yǎng)基置冰箱內(nèi)使之凝固后,再穿刺接種。(2)試驗(yàn)應(yīng)同時(shí)設(shè)未接種細(xì)菌的陰性對(duì)照管,與試驗(yàn)管同時(shí)培養(yǎng)并觀察結(jié)果。7結(jié)果報(bào)告7.1供試品培養(yǎng)物經(jīng)證實(shí)為革蘭氏陰性桿菌,氧化酶試驗(yàn)及綠膿菌素試驗(yàn)皆為陽(yáng)性者,即報(bào)告1g或1ml供試品檢出銅綠假單胞菌。7.2供試品培養(yǎng)物氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性,鏡檢為革蘭氏陰性桿菌的培養(yǎng)物,綠菌素試驗(yàn)陰性時(shí),其硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)、41℃生長(zhǎng)試驗(yàn)及明膠液化試驗(yàn)皆為陽(yáng)性時(shí),亦報(bào)告1g或1ml供試品檢出銅綠假單胞菌。7.3凡與7.1與7.2結(jié)果不符時(shí)報(bào)告1g或1ml供試品未檢出銅綠假單胞菌。8注意事項(xiàng)8.1銅綠假單胞菌污染藥品后,因生產(chǎn)工藝和藥物的影響,在溴代十六烷基三甲胺平板上的菌落形態(tài)可產(chǎn)生非典型形態(tài)。為防止漏檢,在挑取疑似菌落時(shí),宜取2~3個(gè)以上菌落,分別進(jìn)行檢驗(yàn),以提高銅綠假單胞菌的檢出率。8.2綠膿菌素是銅綠假單胞菌鑒定的重要特征,但色素的產(chǎn)生受許多因素的影響,除菌株差異及變異外,培養(yǎng)條件是重要因素

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