氣相色譜和液相色譜微型化中的關(guān)鍵問(wèn)題

氣相色譜和液相色譜微型化中的關(guān)鍵問(wèn)題在色譜儀器微型化過(guò)程中,尺寸的縮小不僅要考慮材料的性質(zhì)和制造上的可能,還要從原理上考慮尺寸縮小后所帶來(lái)的一系列問(wèn)題。這些問(wèn)題包括:(1)分離系統(tǒng)中被分配的分子個(gè)數(shù)是否大于106,因?yàn)橹挥写笥?06才能得到符合統(tǒng)計(jì)結(jié)果的數(shù)據(jù);(2)因分離通道尺寸縮小,自然提高了單位柱長(zhǎng)的效率,但是總長(zhǎng)度的減少可能使總分離效能遠(yuǎn)低于常規(guī)儀器;(3)對(duì)于質(zhì)量敏感型檢測(cè)器,經(jīng)過(guò)分離柱后單位時(shí)間內(nèi)到達(dá)檢測(cè)器的分子個(gè)數(shù)是否滿(mǎn)足檢測(cè)原理所要求的最小數(shù)目;(4)對(duì)于濃度型檢測(cè)器,到達(dá)檢測(cè)池的分子數(shù)目是否能滿(mǎn)足符合統(tǒng)計(jì)規(guī)律的分子數(shù)目;(5)檢測(cè)微區(qū)內(nèi)的外加能量密度是否超過(guò)被檢測(cè)分子所能承受的極限;(6)微量流動(dòng)相的輸送與控制;(7)因材料尺寸的縮小,表面層氧化或腐蝕對(duì)器件功能的影響。最后,色譜儀器微型化所帶來(lái)的好處不僅僅是單位長(zhǎng)度分離效率的提高,而是總分離能力的保持甚至提高;不僅僅是分離系統(tǒng)或某個(gè)部件的微型化,而是整體的微型化;不僅僅是質(zhì)量靈敏度的提高,而是濃度靈敏度的保持或提高;不僅僅是能量和物質(zhì)的低消耗,而是使用的方便和友好;不僅僅是整體尺寸的縮小,更重要的是整機(jī)的穩(wěn)定性和可靠性的提高!

下面分別討論上述7個(gè)問(wèn)題。

(1)色譜分離的基本原理是有符合統(tǒng)計(jì)規(guī)律數(shù)目的分子群經(jīng)過(guò)不斷的兩相分配和分子碰撞,利用其分配系數(shù)的差異來(lái)達(dá)到分離的目的。這是一個(gè)宏觀參數(shù)。當(dāng)分子數(shù)目低于這個(gè)數(shù)目時(shí),就會(huì)偏離統(tǒng)計(jì)規(guī)律而出現(xiàn)所謂的漲落現(xiàn)象。分子數(shù)目越少,漲落現(xiàn)象越嚴(yán)重。當(dāng)分子數(shù)目低于103個(gè)時(shí),已沒(méi)有準(zhǔn)確的色譜保留規(guī)律,因此也就失去了宏觀意義下的分離規(guī)律。一般地,保證符合統(tǒng)計(jì)規(guī)律的分子數(shù)目是106個(gè)。

例如內(nèi)徑30μm的填充毛細(xì)管液相色譜(μ2HPLC)柱或毛細(xì)管電泳柱,若分別保持10萬(wàn)/m和40萬(wàn)/m的分離柱效,直接進(jìn)樣時(shí)不過(guò)載的進(jìn)樣量分別為40pL(1pL=10-12L)和115pL,分子總數(shù)分別是112×1012～112×1014和415×1010～415×1012。樣品中含量低至1～0.01μL/L(對(duì)μ2HPLC)或低至20～0.2μL/L(對(duì)CE)的組分就不能滿(mǎn)足106個(gè)分子的數(shù)目要求,分離過(guò)程中就會(huì)出現(xiàn)上述問(wèn)題。所以,上述分離系統(tǒng)對(duì)濃度高于這個(gè)指標(biāo)的樣品分離時(shí)可以有重復(fù)的保留時(shí)間。如果考慮檢測(cè)方面的限制[參見(jiàn)下述的(3)和(4)>,痕量分析中用粗內(nèi)徑的填充色譜柱總是優(yōu)于微型色譜柱。

為了能進(jìn)行痕量分析,微型分離分析系統(tǒng)往往采用樣品預(yù)濃縮技術(shù)以補(bǔ)償濃度靈敏度的不足。但為此而發(fā)展的技術(shù)也同樣適用于常規(guī)分離分析系統(tǒng),同樣可以提高常規(guī)儀器的靈敏度,除非樣品量受到嚴(yán)格限制。

(2)45年前的色譜柱理論已經(jīng)指出,毛細(xì)管開(kāi)口柱的內(nèi)徑越小,或填充柱的填料粒度越小,色譜柱的分離效率就越高。毛細(xì)管電泳亦然,只是理論上有些不同,如有散熱問(wèn)題和塞子流型的特點(diǎn)。微型化中普遍采用的細(xì)內(nèi)徑分離柱并不是微型儀器的專(zhuān)利,所能達(dá)到的高柱效也不是最近才認(rèn)識(shí)到的。如果在現(xiàn)有常規(guī)儀器中使用這種等效內(nèi)徑的色譜柱,再適當(dāng)改進(jìn)進(jìn)樣技術(shù)和檢測(cè)器,就會(huì)有與微型色譜或芯片電泳同樣的單位柱長(zhǎng)的柱效,同時(shí)還可以有極高的總分離效能,因?yàn)槌Ｒ?guī)儀器中分離柱的長(zhǎng)度很少受限,而高的分離效能才是真正有意義的。所以,微型色譜和芯片毛細(xì)管電泳用短分離柱而有快速分離的特點(diǎn),并不是它真正的優(yōu)點(diǎn),因?yàn)橛猛瑯映叽绲姆蛛x柱可以分別在常規(guī)色譜和毛細(xì)管電泳上實(shí)現(xiàn)同樣的效果。用現(xiàn)有的思維模式來(lái)進(jìn)行的色譜儀器微型化,導(dǎo)致了使用短分離柱,而且所有的應(yīng)用例子都是用極簡(jiǎn)單的樣品,這是因?yàn)檫@樣的微型化儀器的總分離效能太低。

(3)質(zhì)量型檢測(cè)器的響應(yīng)值與單位時(shí)間內(nèi)進(jìn)入檢測(cè)器的樣品分子數(shù)成正比。分離柱的樣品容量與柱內(nèi)徑的3次方(毛細(xì)管開(kāi)口柱)或平方(填充柱)成正比。例如氣相色譜FID檢測(cè)器,用內(nèi)徑50μm的毛細(xì)管柱只能分析樣品中含量為011%(1000ppm)以上的組分;而用內(nèi)徑530μm的毛細(xì)管柱能分析樣品中含量為3×10-7(013ppm)以上濃度的組分,相差3000倍。雖然細(xì)內(nèi)徑色譜柱的譜帶寬度(表現(xiàn)為色譜峰寬度)比粗內(nèi)徑色譜柱的窄,能增加單位時(shí)間內(nèi)的分子數(shù)目,但它是與柱徑的平方根(本質(zhì)上是柱效的平方根關(guān)系)成正比;與柱容量的減少比,仍然虧215次方。離子化檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器都是質(zhì)量型的,離子化效率一般在10-5～10-3,熒光產(chǎn)率一般在10-3,所以單位時(shí)間內(nèi)進(jìn)入檢測(cè)器的分子數(shù)目必須大于50×103～50×105,具體數(shù)值取決于檢測(cè)器的性能。用濃度型檢測(cè)器會(huì)極大地改善這種狀

況,因?yàn)轫憫?yīng)值主要與目標(biāo)組分的濃度有關(guān)。

特殊的質(zhì)量型檢測(cè)器,如具有單分子檢測(cè)能力的激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器和熱透鏡檢測(cè)器等,已用于CE和μ2HPLC。但是他們絕對(duì)不是微型化的設(shè)備,也不是一臺(tái)色譜儀或電泳儀的價(jià)格所能買(mǎi)到的。

在痕量分析中,用直接進(jìn)樣方式和質(zhì)量型檢測(cè)器時(shí),常規(guī)色譜總是優(yōu)于微型色譜。

(4)從宏觀上講,濃度型檢測(cè)器的響應(yīng)值與進(jìn)入檢測(cè)池內(nèi)樣品分子的總數(shù)無(wú)關(guān),而只與樣品分子和流動(dòng)相分子數(shù)的比值有關(guān)。例如,用50μm和530μm內(nèi)徑的毛細(xì)管柱和池體積為012μL的熱導(dǎo)檢測(cè)器(μ2TCD)檢測(cè),最小檢出濃度分別為2×10-5(體積分?jǐn)?shù))和2×10-6(體積分?jǐn)?shù)),僅差10倍。而后者單位時(shí)間內(nèi)進(jìn)入檢測(cè)池中的分子數(shù)目比前者多3×103倍。所以微型色譜和微型流動(dòng)分析儀器中用濃度型檢測(cè)器有利。但是這個(gè)理論是有限度的。如在CE和μ2HPLC中,當(dāng)分離柱內(nèi)徑≤75μm、塔板高度≤10μm時(shí),要求檢測(cè)池體積在nL級(jí)(10-8～10-9L),用吸收光譜檢測(cè)器(濃度型檢測(cè)器)時(shí),上述理論不再成立。因?yàn)閺奈⒂^看,檢測(cè)的原理是利用樣品分子的某種特性,當(dāng)分子數(shù)目不滿(mǎn)足檢測(cè)原理所要求的統(tǒng)計(jì)數(shù)目時(shí),表現(xiàn)為噪聲信號(hào)。所以在上述的微型分離系統(tǒng)中,最小檢出濃度是很高的,遠(yuǎn)不如常規(guī)分離系統(tǒng)的低。

就檢測(cè)器本身而言,微型化會(huì)影響它的響應(yīng)靈敏度。如氣相色譜用的熱導(dǎo)檢測(cè)器,由于給定氣體的熱導(dǎo)率與通道的壁間距(d)有關(guān),特別是在d≤015mm時(shí),熱導(dǎo)率隨d的減小而呈幾何增加,因此微型化使熱導(dǎo)檢測(cè)器的靈敏度有大幅度提高。所以,微型化研究應(yīng)選擇那些在原理上有利于保持或提高靈敏度的檢測(cè)器,或者研究那些有極高檢測(cè)靈敏度的檢測(cè)器微型化問(wèn)題,如激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器。

(5)檢測(cè)微區(qū)內(nèi)的外加能量問(wèn)題。任何檢測(cè)原理和技術(shù)都是依賴(lài)樣品分子與外加能量的相互作用而產(chǎn)生的物理信號(hào)。由于檢測(cè)微區(qū)達(dá)到μm級(jí),而作用到微區(qū)的光或電磁波強(qiáng)度往往比常規(guī)檢測(cè)器高幾倍到幾萬(wàn)倍,以此彌補(bǔ)因樣品分子數(shù)減少而損失的信號(hào)2噪聲比值。例如,吸收光譜檢測(cè)器或熒光光譜檢測(cè)器等常規(guī)檢測(cè)器的光斑直徑在500～1000μm,而μ2HPLC或μ2CE的檢測(cè)器光斑直徑僅有30μm,甚至5μm,但所用的光源功率往往是相同的,經(jīng)過(guò)聚焦,達(dá)到檢測(cè)區(qū)的光強(qiáng)度提高了3個(gè)數(shù)量級(jí)甚至更高。在這樣小的微區(qū)內(nèi),如此高的光強(qiáng)度會(huì)產(chǎn)生如下問(wèn)題:液體汽化、熒光物質(zhì)“漂白”、被檢測(cè)分子變性、響應(yīng)非線性等。

(6)微量流動(dòng)相的輸送與控制。在儀器的微型化中,因?yàn)闅庀嗌V的載氣流量以10mL/min到011mL/min計(jì),液相色譜流動(dòng)相流量以50μL/min到0105μL/min計(jì)。特別是液相色譜儀的微流量輸液泵,更是微型化的關(guān)鍵難題。用分流的方法解決用常規(guī)裝置實(shí)現(xiàn)微流量調(diào)控只是權(quán)宜之計(jì);同樣,通過(guò)改裝常規(guī)檢測(cè)器來(lái)適應(yīng)微型儀器也是很牽強(qiáng)的。例如,由于動(dòng)態(tài)密封的微滲漏,現(xiàn)有的機(jī)械/電子式氣體流量控制閥幾乎不能對(duì)1mL/min的流量有1%的控制精度;現(xiàn)有的液相高壓輸液系統(tǒng)也不能對(duì)015μL/min的流量有3%的控制精度。而上述精度都是微型色譜儀所需要的。所以,只有從原理上、材料上、技術(shù)工藝上和工程上都重新研究和設(shè)計(jì),才能有真正意義上的微型化。

(7)因所用材料質(zhì)量的微小,表面層氧化或腐蝕對(duì)器件功能的影響遠(yuǎn)大于常規(guī)色譜儀器。例如熱導(dǎo)檢測(cè)器(TCD)中的敏感熱絲,常規(guī)的直徑在100μm,而微型化的熱敏層厚度僅有幾個(gè)μm甚至1μm,所以必須解決熱敏層老化或腐蝕的難題。再比如微型化的電化學(xué)檢測(cè)器,電極厚度在10-1μm量級(jí),而常規(guī)的在102μm量級(jí),兩者相差幾百倍。所以,微型化的器件必須解決耐腐蝕和老化問(wèn)題,才能成為實(shí)

用化的器件,而不僅僅是展品或樣機(jī)。

此外,對(duì)于二維分離系統(tǒng),分離效率決不是簡(jiǎn)單的第1根柱效(N1)×第2根柱效(N2),而是與柱的選擇性有直接關(guān)系。當(dāng)某一對(duì)組分在其中一維上不能達(dá)到徹底分離時(shí),往往在另一維上的分離度也為零。所以真正有意義的二維分離系統(tǒng)必須是:同系列化合物的目標(biāo)組分對(duì)必須在某一維上達(dá)到徹底分離,而不同維擔(dān)當(dāng)分離不同族化合物的任務(wù)。

在設(shè)計(jì)構(gòu)思上,微型化不僅是簡(jiǎn)單尺寸的縮小,其本質(zhì)上的進(jìn)步是在解決原理性難題的過(guò)程中不斷的創(chuàng)新。

不論從科學(xué)上還是實(shí)用上,片面追求分離系統(tǒng)的微小化而忽視檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)濃度范圍的問(wèn)題;追求單位柱長(zhǎng)分離效率的提高和快速檢測(cè)而忽視實(shí)際樣品分離對(duì)總柱效的要求;追求進(jìn)樣區(qū)和分離柱的微小化而忽視其可操作性和檢測(cè)設(shè)備的微型化,是目前微型