基因轉(zhuǎn)染技術(shù)及其應(yīng)用簡(jiǎn)介演示文稿

基因轉(zhuǎn)染技術(shù)及其應(yīng)用簡(jiǎn)介演示文稿第一頁(yè)，共四十八頁(yè)?；蜣D(zhuǎn)染技術(shù)及其應(yīng)用簡(jiǎn)介第二頁(yè)，共四十八頁(yè)。

1.基因轉(zhuǎn)染:將具生物功能的核酸轉(zhuǎn)移或運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)并使核酸在細(xì)胞內(nèi)維持其生物功能。2.基因轉(zhuǎn)染技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因組功能研究和基因治療研究。一、基因轉(zhuǎn)染簡(jiǎn)介第三頁(yè)，共四十八頁(yè)。二、基因轉(zhuǎn)染的基本方法(一)重組子構(gòu)建(二)基因轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的基本方法第四頁(yè)，共四十八頁(yè)。(一)重組子構(gòu)建1.目的基因的制備和獲取2.哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體的選擇3.DNA片斷的重組連接4.DNA重組體的鑒定第五頁(yè)，共四十八頁(yè)。(1)目的基因

是所要研究或應(yīng)用的基因，也就是將要克隆或表達(dá)的基因或基因的一個(gè)片段(2)目的基因常用的制備方法

1.目的基因的制備和獲取第六頁(yè)，共四十八頁(yè)。A.限制酶切除

a.從原核基因組DNA制備－視原核基因組物理圖譜已知或未知，克隆方法不同。

b.從真核基因組DNA制備

c.從已克隆的DNA片段制備第七頁(yè)，共四十八頁(yè)。B.

PCR或RT/PCR方法制備目的基因a.獲取已知基因

據(jù)已發(fā)表的基因序列（或基因兩側(cè)序列已知）→設(shè)計(jì)/合成一對(duì)引物→PCR（基因組DNA為模板）/RT-PCR(mRNA為模板)→從組織或細(xì)胞制備目的基因b.

構(gòu)建RT/PCR文庫(kù)法獲取未知基因

據(jù)mRNA末端如polyA尾設(shè)計(jì)共同引物→將所用mRNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA利用工具酶在cDNA末端加尾→采用一對(duì)共用引物擴(kuò)增所有cDNA，插入適當(dāng)載體→構(gòu)成PCR－cDNA文庫(kù)篩選第八頁(yè)，共四十八頁(yè)。C.計(jì)算機(jī)克?。蠢肎enBank信息，利用不同種屬同源性設(shè)計(jì)引物，嘗試獲取未知基因片段，這有賴于各種計(jì)算機(jī)軟件的應(yīng)用。D.化學(xué)合成法制備基因片段－用DNA合成儀，對(duì)目的基因分段合成，連接，可以得到所需的目的基因。第九頁(yè)，共四十八頁(yè)。2.哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體的選擇哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體有2大類：質(zhì)粒型載體和病毒型載體（1）質(zhì)粒型載體

哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)粒型載體大多數(shù)是通過細(xì)菌質(zhì)粒而獲得的，主要是在質(zhì)粒的基礎(chǔ)上插入了一些病毒或其他一些物種及人的基因表達(dá)調(diào)控序列。A.典型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體需要以下順式作用元件:

a.啟動(dòng)子b.增強(qiáng)子c.多聚腺苷酸化信號(hào)d.藥物選擇標(biāo)記基e.報(bào)告基因f.表位標(biāo)簽第十頁(yè)，共四十八頁(yè)。B.常用的哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒載體a.pcDNA3.lb.pSIc.pCMV-HAd.pBudCE4.1e.pTRE第十一頁(yè)，共四十八頁(yè)。（2）病毒型載體

病毒型載體已被廣泛地用于將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞或替換哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的缺陷基因，這類載體將來在基因治療中將具有非常重要的價(jià)值。目前應(yīng)用的病毒類型包括：逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、牛痘病毒和桿狀病毒等。

A．逆轉(zhuǎn)錄病毒載體

逆轉(zhuǎn)錄病毒的優(yōu)點(diǎn)是，可以使外源基因整合到基因組中，因而可以被穩(wěn)定傳代和表達(dá)。但是，由于逆轉(zhuǎn)錄病毒的插入位點(diǎn)是隨機(jī)的，因而在基因組內(nèi)的整合有可能破壞一些內(nèi)源基因的結(jié)構(gòu)，尤其是當(dāng)插人到一些重要的基因位點(diǎn)時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的異常。第十二頁(yè)，共四十八頁(yè)。B.腺病毒載體

易于培養(yǎng)、純化，在感染過程中復(fù)制與轉(zhuǎn)錄依賴于宿主細(xì)胞的聚合酶，可插入較大的外源基因片段，且腺病毒基因不會(huì)發(fā)生整合，是研究真核基因的良好模型。第十三頁(yè)，共四十八頁(yè)。3.DNA片斷的重組連接粘端連接方法要點(diǎn)平端連接方法要點(diǎn)①單酶單切點(diǎn)

防自身環(huán)化，希望定向插入；②雙酶雙切點(diǎn)

定向克隆，構(gòu)建表達(dá)載體的最好用此法；③利用同裂解酶產(chǎn)生相同粘端。①平端，平端連接；②Linker連接酶切產(chǎn)生粘端連接；③Adaptor銜接目的基因和載體；④同源同聚尾，克隆cDNA的最好方法⑤T載體，PCR產(chǎn)物T/A克隆法連接。第十四頁(yè)，共四十八頁(yè)。4.DNA重組體的鑒定

外源DNA片斷是否插入載體構(gòu)成重組DNA分子，而插入片斷大小，是否突變及插入位置，順序及方向則關(guān)系到構(gòu)建載體是否擴(kuò)增，我們所需要的基因或表達(dá)，表達(dá)相應(yīng)的產(chǎn)品，所以需要進(jìn)一步鑒定DNA重組體（1）酶切鑒定是必需的，基于下述:A.限制性圖譜個(gè)體特異性，不同的載體或DNA分子物理圖譜不同，酶切后片段大小不一樣，電泳圖譜不一樣。

B.同一載體連接不同的DNA片斷，不同的載體連接同一片段(片段上也有位點(diǎn)）酶切圖譜是不同的。

C.插入法(單酶單切點(diǎn))或替代法(雙酶雙位點(diǎn))酶切，一般來說用3種限制酶切：①可鑒定載體及②插入片段的大小,方向,切后并電泳分析,以確定是否得到預(yù)期的rDNA。第十五頁(yè)，共四十八頁(yè)。（2）若構(gòu)建DNA重組體是為了克隆某個(gè)基因，可進(jìn)行在序列測(cè)定。（3）若構(gòu)建表達(dá)載體，可進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物鑒定。第十六頁(yè)，共四十八頁(yè)。

對(duì)外源基因轉(zhuǎn)染方法的要求包括：轉(zhuǎn)移效率高，不影響細(xì)胞的正常生理活動(dòng)，低毒性，容易使用，重復(fù)性好，易獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。根據(jù)轉(zhuǎn)染的機(jī)制不同可將轉(zhuǎn)染法分為：

1.化學(xué)轉(zhuǎn)染法

2.物理轉(zhuǎn)染法

3.病毒感染法

(二)基因轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的基本方法第十七頁(yè)，共四十八頁(yè)。1.化學(xué)轉(zhuǎn)染法

化學(xué)轉(zhuǎn)染法包括DEAE一葡聚糖法、磷酸鈣法和人工脂質(zhì)體法等。目前應(yīng)用最廣泛的是人工質(zhì)體法。

1.DEAE-葡聚糖是最早應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染的試劑之一。DEAE-葡聚糖是陽(yáng)離子多聚體,它與帶負(fù)電的核酸結(jié)合后接近細(xì)胞膜而被攝取。DEAE一葡聚糖轉(zhuǎn)染已成功地應(yīng)用于瞬時(shí)開始，但用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染卻不可靠。第十八頁(yè)，共四十八頁(yè)。2.磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法

由于試劑易得、價(jià)格便宜而被廣泛用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定染的研究。方法是，先將DNA和氯化鈣混合，然后加人到PBS中慢慢形成DNA磷酸鈣沉淀，后把含有沉淀的混懸液加到培養(yǎng)的細(xì)胞上，通過胞膜的內(nèi)吞作用攝人DNA。3.人工脂質(zhì)體法

脂質(zhì)體還可以介導(dǎo)DNA和RNA轉(zhuǎn)動(dòng)物和人的體內(nèi)，用于基因治療。人工合成的陽(yáng)離子脂質(zhì)體與帶負(fù)電荷的核酸結(jié)合后形成合物，當(dāng)復(fù)合物接近細(xì)胞膜時(shí)被內(nèi)吞成為內(nèi)體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，隨后DNA復(fù)合物被釋放進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。第十九頁(yè)，共四十八頁(yè)。2.物理方法

包括電穿孔、顯微注射及基因槍等方法。（1）電穿孔法利用高壓電脈沖對(duì)細(xì)胞膜的干擾，使其形成利于核酸進(jìn)人的微孔。電穿孔技術(shù)可用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，可方便地用于懸浮細(xì)胞，重現(xiàn)性好，但需要較多的細(xì)胞。影響轉(zhuǎn)染效率的主要因素是脈沖強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。必須找到能夠使核酸有效釋放而又不殺死細(xì)胞的最佳平衡點(diǎn)。

第二十頁(yè)，共四十八頁(yè)。（2）顯微注射法該法雖然費(fèi)力，但卻是非常有效的將核酸導(dǎo)人細(xì)胞或細(xì)胞核的方法。這種方法常用來制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，但不適用于需要大量轉(zhuǎn)染細(xì)胞的研究。（3）基因槍法該法依靠攜帶了核酸的高速粒子而將核酸導(dǎo)人細(xì)胞內(nèi)，這種方法適用于培養(yǎng)的細(xì)胞和在體的細(xì)胞。

第二十一頁(yè)，共四十八頁(yè)。3.病毒感染法

病毒顆粒是一類十分有效的基因釋放系統(tǒng)，因此，它是將外源基因?qū)舜罅考?xì)胞最有效的方法。病毒感染具有高效率、可穩(wěn)定遺傳、適用于各種不同來源的細(xì)胞及操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。但多數(shù)病毒有其潛在的危險(xiǎn)性，操作者需要有一定的病毒操作經(jīng)驗(yàn)和良好的設(shè)施。（1）逆轉(zhuǎn)錄病毒（2）腺病毒第二十二頁(yè)，共四十八頁(yè)。三、基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的應(yīng)用（一）轉(zhuǎn)基因植物（二）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（三）生物制藥（四）基因治療（五）RNAi技術(shù)第二十三頁(yè)，共四十八頁(yè)。（一）轉(zhuǎn)基因植物1.轉(zhuǎn)基因植物的發(fā)展簡(jiǎn)史2.轉(zhuǎn)基因植物類型第二十四頁(yè)，共四十八頁(yè)。1.轉(zhuǎn)基因植物的發(fā)展簡(jiǎn)史（1）1983年，世界第一例轉(zhuǎn)基因植物——

煙草問世（2）1996~2005年，全世界轉(zhuǎn)基因植物在21個(gè)國(guó)家種植，面積從1996年的170萬(wàn)公頃增加到2005年的9000萬(wàn)公頃（3）全世界轉(zhuǎn)基因作物僅種子銷售額到2005年已達(dá)52.5億美元，是1995年的63倍第二十五頁(yè)，共四十八頁(yè)。2.轉(zhuǎn)基因植物類型（1）抗除草劑基因（2）抗蟲基因（3）抗病基因（4）抗逆境基因（5）改良品質(zhì)基因第二十六頁(yè)，共四十八頁(yè)。（二）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物1.轉(zhuǎn)基因小鼠2.轉(zhuǎn)基因牛3.轉(zhuǎn)基因豬4.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物疾病模型第二十七頁(yè)，共四十八頁(yè)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物疾病模型1.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與心血管疾病

a.與動(dòng)脈粥樣硬化和脂質(zhì)代謝有關(guān)的如LDL受體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可增強(qiáng)LDL的清除；

b.apoE3基因轉(zhuǎn)基因鼠可增強(qiáng)LDL的清除，而突變的apoE則誘發(fā)高脂血癥，apoE4與apoE7轉(zhuǎn)基因鼠還出現(xiàn)學(xué)習(xí)與記憶能力降低、誘發(fā)腫瘤以及脾臟、腎臟腫大等。2.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與高血壓

與血壓調(diào)控有關(guān)的如renin—angiotensinogen轉(zhuǎn)基因鼠模型出現(xiàn)高血壓，用于研究RAS(renin—angiotensinogensystem)中各成分致高血壓的作用以及相互關(guān)系第二十八頁(yè)，共四十八頁(yè)。3.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與乙型肝炎

乙型肝炎是目前流行廣泛、危害嚴(yán)重的病毒性傳染病。由于一般實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)HBV不易感，目前發(fā)現(xiàn)能夠感染HBV的動(dòng)物只有靈長(zhǎng)類，因此使得對(duì)HBV致病機(jī)理的研究很難用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法來進(jìn)行。HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的建立，為探討HBV的致病機(jī)理提供了有價(jià)值的動(dòng)物模型4.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與腫瘤研究

轉(zhuǎn)基因鼠腫瘤模型能很好地模擬體內(nèi)的生理、病理環(huán)境，與所要研究腫瘤的發(fā)生過程具有較好的一致性，而且可模擬部分癌前病變。第二十九頁(yè)，共四十八頁(yè)。（三）生物制藥1.細(xì)菌細(xì)胞2.酵母細(xì)胞3.昆蟲細(xì)胞4.哺乳動(dòng)物細(xì)胞5.動(dòng)物乳腺反應(yīng)器第三十頁(yè)，共四十八頁(yè)。動(dòng)物乳腺反應(yīng)器

是指利用動(dòng)物乳腺特異性啟動(dòng)子調(diào)控元件指導(dǎo)外源基因在乳腺中特異性表達(dá)，并能從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳汁中獲取重組蛋白的一種生物反應(yīng)器。特點(diǎn)：

1.對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的影響小

2.產(chǎn)量大，產(chǎn)品易提純，質(zhì)量高

3.表達(dá)產(chǎn)物生物活性穩(wěn)定

4.易于擴(kuò)群，進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)

5.縮短新藥上市周期

6.可以獲取巨額經(jīng)濟(jì)利潤(rùn)第三十一頁(yè)，共四十八頁(yè)。（四）基因治療

1.基因治療(genetherapy)

是指將外源功能性目的基因?qū)氩∪梭w內(nèi)，通過調(diào)控目的基囚表達(dá)，抑制、替代或補(bǔ)償缺陷基囚，從而恢復(fù)細(xì)胞、組織或器官的生理功能，達(dá)到疾病治療目的的一種方法

2.治療方式：

（1）基因直接注射法(invivo)：

即經(jīng)靜脈或肌肉直接將帶存外源DNA的病毒、脂質(zhì)體或裸露的DNA注入患者有關(guān)組織，使其進(jìn)入相應(yīng)的細(xì)胞并表達(dá)。

（2）體外基因轉(zhuǎn)移再回輸體內(nèi)的方法(exvivo)：

即將患者的體細(xì)胞(如T淋巴細(xì)胞)取出在體外培養(yǎng)并導(dǎo)入外源目的基因后重新輸回患者體內(nèi)。第三十二頁(yè)，共四十八頁(yè)。3.基因治療的策略（1）基因置換（2）基因補(bǔ)償（3）基因失活（4）免疫基因治療（5）活化前體藥物基因治療（6）耐藥基因治療第三十三頁(yè)，共四十八頁(yè)。（五）RNAi技術(shù)TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2006第三十四頁(yè)，共四十八頁(yè)。RNAi一、RNAi早期研究和理論形成二、參與RNAi的重要分子三、RNAi作用機(jī)制第三十五頁(yè)，共四十八頁(yè)。

一、RNAi早期研究和理論形成

(一)、RNAi早期研究

1、牽牛花實(shí)驗(yàn)

1990年，Arizona大學(xué)的Rich教授在轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)室將紫色素基因?qū)胫涟珷颗；ㄖ参?，目的是想通過增加紫色素基因拷貝獲得具有更多的紫紅色的矮牽牛。結(jié)果出乎意外，增加花瓣紫色的著色失敗，一些轉(zhuǎn)基因的花出現(xiàn)全白或部分白花，色素合成不是增加了，而是減少了，事實(shí)上，不僅導(dǎo)入的基因未被表達(dá)，反而植物本身的基因也失活或受到某種程度的限制。這種現(xiàn)象稱為共抑制（cosuppression)現(xiàn)象。

第三十六頁(yè)，共四十八頁(yè)。2.秀麗線蟲實(shí)驗(yàn)

1995年，Cornell大學(xué)SuGuo和Kemphues試圖以反義RNA技術(shù)特異性地阻斷秀麗線蟲par-1基因的表達(dá)以研究其功能。發(fā)現(xiàn)，給線蟲注射par-1的反義RNA時(shí)，如預(yù)期那樣阻斷了該基因的表達(dá)；但當(dāng)給對(duì)照組注射正義RNA以期觀察到該基因表達(dá)增強(qiáng)時(shí)，卻發(fā)現(xiàn)par-1基因同樣也被抑制了。第三十七頁(yè)，共四十八頁(yè)。3.粗糙脈孢菌實(shí)驗(yàn)

1997年，意大利Cogoni等，將外源類胡蘿卜素基因?qū)胝婢植诿}孢菌（結(jié)果引起30%被轉(zhuǎn)化的脈孢自身基因失活，轉(zhuǎn)化細(xì)胞中內(nèi)源性胡蘿卜素基因也受到了抑制，這種基因失活形式稱之為抑制（quelling,基因壓制）。第三十八頁(yè)，共四十八頁(yè)。

早期的三個(gè)實(shí)驗(yàn)，牽?；▽?shí)驗(yàn)和粗糙脈孢菌實(shí)驗(yàn)已經(jīng)做出了有意義的結(jié)果，但都沒有繼續(xù)研究。其中以秀麗線蟲實(shí)驗(yàn)有最有意義，因?yàn)樵谶@個(gè)實(shí)驗(yàn)中給線蟲注射了正義RNA和反義RNA，但就是沒有注射二者結(jié)合起來的雙連RNA。而RNAi理論形成的形成正是基于后者。第三十九頁(yè)，共四十八頁(yè)。（二）RNAi理論形成1.RNAi理論2.RNAi概念第四十頁(yè)，共四十八頁(yè)。DiscoveryofRNAiDouble-strandedRNAinjectC.elegansNeg.controlUninjectedAntisenseRNAdsRNAsenseantisenseNature1998,391:806-811Mex-3mRNAdetectioninembryosbyinsituhybridization第四十一頁(yè)，共四十八頁(yè)。

1.RNAi理論

1998年，F(xiàn)ire和Mello運(yùn)用asRNA、sRNA及dsRNA進(jìn)行研究，結(jié)果非常令人吃驚，在使相應(yīng)的C.elegans基因沉默上，dsRNA的抑制效能比單一的有義或反義均有效，誘導(dǎo)基因沉默的效率高10倍。少量的dsRNA處理線蟲就能呈現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象，該抑制現(xiàn)象還可傳給第二代。第四十二頁(yè)，共四十八頁(yè)。2.RNAi概念

RNAi是指一些小的雙鏈RNA序列導(dǎo)入機(jī)體或細(xì)胞中，機(jī)體或細(xì)胞中與之有同源序列的基因的表達(dá)將會(huì)受到高效特異的抑制或阻斷