單分子熒光共振能量轉移用于生物大分子構象動態(tài)變化過程研究進展

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摘要生物大分子參與生命活動的各個過程，在單分子水平上實時觀測和分析生物大分子自身的布局動態(tài)以及生物大分子相互作用的動態(tài)過程，對于深入理解生物大分子的作用機制具有重要意義。自提出以來，單分子熒光共振能量轉移技術逐步呈現(xiàn)出其在研究生物大分子構象變化和相互作用過程等方面的巨大潛力，一系列新的作用機理不斷被提出。本文對單分子熒光共振能量轉移技術在蛋白質與核酸分子構象動態(tài)變化、蛋白質-蛋白質相互作用以及蛋白質-核酸相互作用等方面取得的研究進展舉行了綜述。

關鍵詞單分子熒光共振能量轉移；生物大分子；構象動態(tài)；相互作用；評述

1引言

細胞生命活動各個過程都離不開蛋白質、核酸等生物大分子。研究生物大分子的作用機制對于理解根本生物學過程至關重要，然而普遍的生物學研究手段無法實時觀測生物大分子發(fā)揮作用時的狀態(tài)變化，只能間接地觀測宏觀現(xiàn)象，然后對過程機制舉行推斷。依據(jù)宏觀現(xiàn)象推出的作用機理只能在確定程度上扶助人們熟悉生物過程，生物分子到底如何發(fā)揮作用，務必有微觀的證據(jù)才更有壓服力，例如ATP合成酶的作用機制、G蛋白偶聯(lián)受體如何傳遞信號等，都是在取得單分子水平上的證據(jù)后才得到更加深入的熟悉[1～3]。對于宏觀系綜研究，單分子研究的最大優(yōu)勢是可以直接觀測到單個生物分子發(fā)揮作用時的構象動態(tài)或生物分子間相互作用時分子間距離的變化[4～8]，獲取的機制更加接近真實處境。此外，單分子水平的研究能夠透露生物分子之間的個體差異[9]，有助于全面深入地熟悉生物分子的功能性質。

目前，在單分子水平研究生物分子構象變化或生物分子相互作用動態(tài)過程的技術有光鑷[10]、磁鑷[11，12]、原子力顯微鏡[13～16]及單分子熒光技術[17～21]。光鑷和磁鑷技術要求高，操作難度大，無法舉行高通量研究；原子力顯微鏡的成像時間辨識率低，因此在單分子研究方面應用不多。單分子熒光技術起源于20世紀90年頭[17]，目前已經(jīng)逐步成熟地被用于生物學領域，并展現(xiàn)多個分支，其中單分子熒光共振能量轉移技術（SM-FRET）被廣泛用于生物分子相互作用的研究[22]。單分子熒光共振能量轉移技術是指能夠觀測單個生物分子上熒光供體和受體之間共振能量轉移的技術[23]，具有以下優(yōu)勢：（1）熒光共振能量轉移的原理使其能夠觀測到生物大分子發(fā)揮功能時不同布局域或亞基之間空間位置的變化，或者分子之間相對距離的變化[23]，這些變化對于直接理解生物分子的作用機制特別重要；（2）目前全內反射熒光顯微鏡廣泛應用于SM-FRET研究，其利用激光全反射產(chǎn)生的隱逝波舉行照明，具有極高的信噪比，能夠觀測到界面上單個熒光分子；同時利用高速的制冷型電荷耦合器件（CCD）舉行成像，時間辨識率可以達成亞毫秒水平。該高時間辨識率對于實時觀測快速的相互作用或構象變化過程至關重要[24]；（3）光學成像允許同時對多個目標舉行觀測，高通量觀測便于比對被研究對象個體之間的差異；（4）成熟的基因工程技術和化學修飾方法使得研究者能夠對蛋白質或核酸分子舉行定點熒光標記[25～28]，同時，豐富的界面封閉和目標物固定方法可以保證觀測的特異性[23]。自1996年，基于SM-FRET技術的研究取得了一系列成果[29]。本文將圍繞單分子熒光共振能量轉移技術在蛋白分子自身構象動態(tài)變化[30～38]、蛋白質-蛋白質動態(tài)相互作用[6，7，39]、核酸分子自身構象動態(tài)變化[40～47]以及蛋白質-核酸動態(tài)相互作用[48～62]等方面取得的一些代表性研究成果舉行綜述。

2單分子熒光共振能量轉移技術

熒光共振能量轉移現(xiàn)象是供體熒光分子的放射光譜與受體熒光分子的激發(fā)光譜相重疊，且兩個分子間距離小于10nm時，供體的激發(fā)能誘發(fā)受體發(fā)出熒光，同時供體自身的熒光強度減弱的現(xiàn)象，在生物學研究中常被用于鑒定兩種蛋白質之間是否發(fā)生相互作用。SM-FRET技術是觀測單個生物分子上熒光供體和受體之間共振能量轉移。目前，SM-FRET測驗中最常用的成像儀器是全內反射熒光顯微鏡（TIRFM），包括棱鏡型和物鏡型兩類（圖1A）[63]。商業(yè)化的TIRFM多為物鏡型，這是由于物鏡型TIRFM激發(fā)光和熒光都經(jīng)過物鏡，樣品臺有更大的操作空間，能夠更好的與其它設備聯(lián)用，如顯微操作設備。除了設備，SM-FRET測驗最關鍵的是研究對象的定點熒光標記以及對象在界面上的特異性固定。核酸定點標記對比輕易，蛋白定點標記那么要憑借基因工程手段，還要保證標記的位點不影響蛋白布局。將研究對象特異性地固定在石英片或蓋玻片外觀，對于觀測測驗特別重要，目前常用的方式是用聚乙二醇（PEG）封閉玻璃外觀，然后通過抗體或生物素-親和素舉行固定（圖1B）[63]。SM-FRET測驗中獲得的數(shù)據(jù)是熒光供體和受體分子熒光強度隨時間的變化的軌跡，然后通過表觀FRET效率方程計算出對應的FRET效率隨時間變化的軌跡（圖1C）[63]，進而對FRET效率舉行統(tǒng)計分析，以獲得變化規(guī)律。

3單分子熒光共振能量轉移技術用于生物大分子構象和相互作用動態(tài)研究

3.1單分子熒光共振能量轉移技術研究蛋白分子構象動態(tài)

蛋白質分子的折疊和構象動態(tài)變化直接關系到其自身功能，研究蛋白質折疊過程和構象動態(tài)變化，有助于理解蛋白分子形告成能布局及發(fā)揮功能的機理。1999年，Ha等[30]首次將SM-FRET應用于單個葡萄球菌核酸酶（Staphylococcalnuclease，SNase）分子的布局動態(tài)研究。他們將熒光供體（Tetramethylrhodamine，TMR）和熒光受體（Cy5）修飾到SNase的兩個特定位點上，通過觀測分析單個SNase上TMR和Cy5的熒光共振能量轉移效率，察覺SNase分子之間存在