細(xì)胞生物學(xué)：第二章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法

準(zhǔn)備觀察

提出理論

設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

收集數(shù)據(jù)

解釋結(jié)果

提出結(jié)論

參考文獻(xiàn)知識(shí)

第二章細(xì)胞生物學(xué)研究方法一.顯微成像技術(shù)二.細(xì)胞工程技術(shù)三.細(xì)胞組分的分離技術(shù)四.細(xì)胞組分的分析方法內(nèi)容提要一、光學(xué)顯微鏡分辨力(resolution)

是指能夠區(qū)別開的兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)的最小距離。分辨力的最終限度是決定于光的波長。對(duì)任何顯微鏡而言，最重要的是分辨力，而不是放大倍數(shù)。分辨率或分辨力(resolution，R)：R=0.61λ/(nsinα/2)R=0.61x0.5/1.5=0.2μmInterferencebetweenlightwaves.

Whentwolightwavescombineinphase,theamplitudeoftheresultantwaveislargerandthebrightnessisincreased.Twolightwavesthatareoutofphasepartiallycanceleachotherandproduceawavewhoseamplitude,andthereforebrightness,isdecreased.Edgeeffects.

Theinterferenceeffectsobservedathighmagnificationwhenlightpassestheedgesofasolidobjectplacedbetweenthelightsourceandtheobserver.μm(micrometer)=10-6mnm(nanometer)=10-9m?(?ngstr?munit)=10-10ma.普通光學(xué)顯微鏡取材－固定－脫水－包埋－切片－脫蠟－復(fù)水－染色－脫水－透明－封片－觀察b.熒光顯微鏡Fluorescentdyes.Fruitfly(Drosophila)embryoc.激光共聚焦掃描顯微鏡Comparisonofconventionalandconfocalfluorescencemicroscopy.

Thesetwomicrographsareofthesameintactgastrula-stageDrosophilaembryothathasbeenstainedwithafluorescentprobeforactinfilaments.d.相差顯微鏡TwowaystoobtaincontrastinlightmicroscopyFourtypesoflightmicroscopy.

(A)Theimageofafibroblast（成纖維細(xì)胞）incultureobtainedbycommonlightmicroscopy(B)phase-contrastmicroscopy,(C)differential-interference-contrastmicroscopy(微分干涉差顯微鏡),and(D)dark-fieldmicroscopy.E.ElectronicimageprocessingLimitofresolutionoftheelectronmicroscope.

Electronmicrographofathinlayerofgoldshowingtheindividualfilesofatomsinthecrystalasbrightspots.Thedistancebetweenadjacentfilesofgoldatomsisabout0.2nm(2?).二、電子顯微鏡光鏡與電鏡的基本區(qū)別類型分辨力光源透鏡真空光鏡200

n

m可見光

波長300-700

n

m玻璃透鏡不要求100

n

m紫外光

波長200

n

m玻璃透鏡電鏡0.1n

m電子束波長0.01-0.9

n

m電磁透鏡要求電鏡技術(shù)的基本特點(diǎn)1）電子束照明系統(tǒng)，包括電子槍、聚光鏡。電子束比可見光的波長短得多，提高了分辨力。2）電磁透鏡成像系統(tǒng)聚焦成像。3）真空系統(tǒng)：電子運(yùn)行中如遇到氣體分子將會(huì)被散射，所以電鏡鏡筒中要求高真空。4）記錄系統(tǒng)：電子像是人眼看不到的，因此要用熒光屏來顯示或感光膠片作記錄。電鏡種類1.透射電子顯微鏡2.掃描電子顯微鏡Electronmicrographofaroot-tipcellstainedwithosmium（鋨）andotherheavymetalions.Immunogoldelectronmicroscopy.1.超薄切片（40～50nm）。2.固定→包埋→切片→染色等過程要求高。3.重金屬鹽染色或噴鍍，以形成不同程度的反差，提高分辨力。4.負(fù)染技術(shù)5.冰凍斷裂和冰凍蝕刻技術(shù)電鏡技術(shù)的基本要求：SpecimenPreparationforElectronMicroscopyChemicalfixation

Diagramofthecoppergridusedtosupportthethinsectionsofaspecimeninthetransmissionelectronmicroscope.ElectronmicrographsofindividualmyosinproteinmoleculesMetalShadowingAllowsSurfaceFeaturestoBeExaminedElectronmicrographofnegativelystainedactinfilaments.電子顯微鏡照相冷凍斷裂一個(gè)植物細(xì)胞葉綠體的類囊體膜Freeze-FractureandFreeze-EtchElectronMicroscopy

Regulararrayofproteinfilamentsinaninsectmuscle.Scanningelectronmicroscope(SEM)

ImagesofsurfacescanbeobtainedbySEM;Critical-pointdrying;Range:15－150,000X.Resolution:5nm掃描電子顯微鏡照片在從牛蛙內(nèi)耳的毛囊細(xì)胞伸出的硬纖毛(A).用微分干涉差顯微鏡觀察到同樣的結(jié)構(gòu)(B).電子顯微鏡觀察的薄的部分(C).細(xì)胞工程技術(shù)一、細(xì)胞培養(yǎng)二、細(xì)胞融合三、顯微操作細(xì)胞培養(yǎng)（cellculture）概念是指從活體中取出的細(xì)胞或其他建系細(xì)胞，在體外給予一定的條件進(jìn)行培養(yǎng)，使其能繼續(xù)生存、生長和繁殖的一種方法。細(xì)胞培養(yǎng)的用途1）直接觀察活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)的過程。

2）直接施加物理、化學(xué)和生物因子，觀察對(duì)細(xì)胞影響。

3）可將不同種類的細(xì)胞混合培養(yǎng)，研究細(xì)胞間的相互作用。

4）配合其他的實(shí)驗(yàn)技術(shù)可作大量的研究工作，如細(xì)胞周期與調(diào)控、細(xì)胞衰老等。

5）為植物育種開辟新途徑，為疫苗生產(chǎn)、藥物研制提供新手段。細(xì)胞培養(yǎng)的條件1）溫度

2）pH值

3）營養(yǎng)物質(zhì)

4）無菌條件A.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)B.植物細(xì)胞培養(yǎng)C.非細(xì)胞體系D.細(xì)菌的培養(yǎng)E.病毒的培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)的種類動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)

1）能顯示來源組織的分化特征。

例如：成纖維細(xì)胞仍能分泌膠原;

神經(jīng)細(xì)胞伸展出具有電興奮作用的軸突。

2）可從組織的不同類型的細(xì)胞混合群體中

純化某種類型的細(xì)胞，便于單因素的分析。

3）取材容易，使用方便。細(xì)胞培養(yǎng)的方法1）貼附型：能在玻璃或塑料瓶壁上平展生長，形成單層細(xì)胞層。如上皮型細(xì)胞、成纖維型細(xì)胞等。2）懸浮型：不貼附于支持物上，呈懸浮生長，胞體呈球形。如淋巴細(xì)胞等。原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)（primaryculture）1）概念

直接取材于有機(jī)體組織的細(xì)胞培養(yǎng)。2）步驟取材→剪碎→胰酶消化將細(xì)胞分散→置合適的培養(yǎng)基培養(yǎng)，一般數(shù)小時(shí)即可貼壁生長、增殖，直到相互接觸鋪滿瓶壁，形成單層細(xì)胞。第一代細(xì)胞稱為原代細(xì)胞。傳代培養(yǎng)（secondaryculture）：將原代培養(yǎng)的細(xì)胞取出，轉(zhuǎn)移到另一盛有新鮮培養(yǎng)液的器皿中進(jìn)行培養(yǎng)的過程稱傳代培養(yǎng)。用這種方法可重復(fù)傳代。

細(xì)胞系(cellline)概念培養(yǎng)的細(xì)胞中產(chǎn)生了具有無限繁殖能力的變異細(xì)胞，這種細(xì)胞可被無限地傳代，稱為細(xì)胞系常用細(xì)胞系：細(xì)胞系細(xì)胞類型來源

3T3成纖維細(xì)胞小鼠

BHK-21成纖維細(xì)胞倉鼠

Hela上皮細(xì)胞人宮頸癌

PTK1上皮細(xì)胞袋鼠

L6成肌細(xì)胞大鼠

SP2漿細(xì)胞小鼠植物細(xì)胞培養(yǎng)A單倍體培養(yǎng)B原生質(zhì)培養(yǎng)Preparationofhybridomasthatsecretemonoclonalantibodiesagainstaparticularantigen(X).MonoclonalAntibodiesThetechniqueforthetakeapartandgatherupofcell,andmicroscopemanipulation

Transgenicmice10weeks44gand29gMethodstointroduceamembrane-impermeantsubstanceintoacell.GeneKnockoutmiceMarioCapecchi(Late1980s)(UniversityofUtah)embryonicstemcellsininnercellmassastargetcells1/104cellsundergoaprocessofhomologousrecombination.Step-by-stepprocedureforthepurificationoforganellesbydifferentialcentrifugation.1.差速離心（differentialcentrifugation）

差速離心

在密度均一的介質(zhì)中，不同大小的顆粒沉降速度不同，大顆粒沉降快，先到管底，逐步加大離心力，延長離心時(shí)間，可分離細(xì)胞的不同組分。組織勻漿沉淀小塊含整個(gè)細(xì)胞核和細(xì)胞骨架低速離心1000g10min將上清中速離心20000g20min沉淀小塊含線粒體、溶酶體、過氧化物酶體沉淀小塊含微粒體小泡將上清高速離心80000g1小時(shí)沉淀小塊含核糖體、病毒、大分子將上清超高速離心150000g3小時(shí)2.密度梯度離心(densitygradientcentrifugation)

在離心管中制備由上到下逐漸增加密度的蔗糖溶液（5%—20%），形成密度梯度，細(xì)胞勻漿放最上面，這樣不同組分以不同速率沉降，形成不同的沉降帶，分別收集，進(jìn)行分析。密度梯度離心

Theseparationofsmallmoleculesbypaperchromatography.3.PaperchromatographyTheseparationofmoleculesbycolumnchromatography.4.Columnchromatography離子交換層析凝膠過濾層析親和層析5.chromatography細(xì)胞組分的分析方法一、組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)法二、免疫化學(xué)法三、分子細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)金屬沉淀法福爾根(Feulgen)反應(yīng)聯(lián)苯胺反應(yīng)脂溶染色法茚三酮反應(yīng)一、組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)法二、免疫化學(xué)法蛋白印跡法(westernblot)SDSpolyacrylamide-gelelectrophoresisSDSpolyacrylamide-gelelectrophoresis(SDS).（一）DNA序列分析（二）核酸分子雜交技術(shù)

(RNA)Northernblot,(DNA)

Southernblot（三）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR)（四）放射自顯影術(shù)三、分子細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)

雙脫氧鏈末端終止法測序原理示意圖PCR反應(yīng)過程示意圖InsituhybridizationforRNAlocalizationintissues.TracingandAssayingMoleculesInsideCells3H-白氨酸脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)β胰腺細(xì)胞的白氨酸5分鐘對(duì)照

熒光檢觀察的細(xì)胞內(nèi)Ca2+

濃縮過程Fluorescentanaloguecytochemistry.Fluorescencemicrographofthe