FACSCalibur雙色熒光檢測(cè)簡(jiǎn)易操作步驟

FACSCalibur雙色熒光檢測(cè)簡(jiǎn)易操作步驟一、開(kāi)機(jī)（見(jiàn)開(kāi)機(jī)程序）二、開(kāi)啟軟件、編輯實(shí)驗(yàn)文件1）在屏幕下方點(diǎn)擊CELLQuest（第四個(gè)圖標(biāo)）啟動(dòng)軟件。桌面會(huì)出現(xiàn)一‘Untitled’實(shí)驗(yàn)文件，可點(diǎn)擊實(shí)驗(yàn)文件的左上角的放大鈕（綠色），將實(shí)驗(yàn)文件窗口放大。2）從工具板中點(diǎn)后放開(kāi)鼠標(biāo)。出個(gè)小黑塊）。3）在出現(xiàn)的散點(diǎn)圖對(duì)話方框中點(diǎn)擊PlotSource，選擇AcquisitionandAnalysis（收取、分析），確認(rèn)X和Y軸參數(shù)預(yù)設(shè)為FSC-H1024、SSC-H1024。室DotPlotPlotSource：|*AnalysisSelectFile-FilePlotSource：|*AnalysisSelectFile-File：自cquiyitiunAcquisition->^nalysiJtjXParameter二［pl256￥Parameter二［pZ256Gate：|NoGate~i4）從屏幕上方Plots菜單中選擇DotPlot功能，可復(fù)制一個(gè)同樣大小的散點(diǎn)圖，在出現(xiàn)的對(duì)話方框內(nèi)選擇X軸：FL1-H1024；Y軸：FL2-H1024（根據(jù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)樣品確定所選通道，本步驟選FL1/FL2來(lái)說(shuō)明）。|mi]iiiiJ藪，并依需要選推乙（FSC：細(xì)胞大小，SSC：細(xì)胞折別舉，F(xiàn)LI：HIL綠出我北，F(xiàn)L2：PE橙色熒光，F(xiàn)L3：PerCP紅色熒光）。

5）在工具板中選擇四象限工具，在FL1/FL2散點(diǎn)圖上拖動(dòng)Quadrant的中心將它設(shè)定在（x,y）=（101，101）處,這些象限將指定陰性/陽(yáng)性區(qū)域。6）從工具板中點(diǎn)擊直方圖圖示,在實(shí)驗(yàn)文件的空白區(qū)點(diǎn)擊,拖后放開(kāi)鼠標(biāo)。需畫2個(gè)直方圖，一個(gè)橫坐標(biāo)選擇FL-1-1024JI4nII；4；JI4nII；4；*；-鼻M.PlldlE"lAll1001011021031朋FL1-H8)lleoioimStatsQudilrciiitStdtiCdirL.NpwFxrirp^tinnEdllEMpeHun8)lleoioimStatsQudilrciiitStdtiCdirL.NpwFxrirp^tinnEdllEMpeHuntStats（象限統(tǒng)計(jì)），5）步驟中的點(diǎn)圖將分為四個(gè)象限。7）在上面直方圖中畫出M1和M2,其中M1代表隱性數(shù)目（一般標(biāo)示是10）,M2代表陽(yáng)性數(shù)目（除M1以外所有的部分）。三、建立儀器和計(jì)算機(jī)之間從Acquire菜單中選擇ConnecControl對(duì)話方框。

四、儀器設(shè)置文件注意：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量，取決于最適化儀器設(shè)定文件。儀器設(shè)定文件不能在數(shù)據(jù)收取后再更改，研究人員必須在第一次就使用正確的儀器設(shè)定文件。儀器設(shè)定文件（Instrumentsettings）,含信號(hào)器高壓（Detector/Amps）,閾值（Threshold）,熒光補(bǔ)償（Compensation）等儀器條件的組合。一般而言，儀器設(shè)定的順序?yàn)镈etector/Amps-Threshold--Compensation。1）檢查現(xiàn)有儀器條件，從Cytometer菜單中選擇Cytometer皿日Betectars/HmpsThreshold■CompensationStatusInstrumentSetting：SortCountersTime-SelaijCalibrat口DetwctorM/Amp三RIPv「amDetector"VoltageAmpGainPode23456pppppFL2-Wn.等l?l0也gl谷堂gl妙堂glH-gll-H-l堂glCytometer皿日Betectars/HmpsThreshold■CompensationStatusInstrumentSetting：SortCountersTime-SelaijCalibrat口DetwctorM/Amp三RIPv「amDetector"VoltageAmpGainPode23456pppppFL2-Wn.等l?l0也gl谷堂gl妙堂glH-gll-H-l堂gl廿*)：：：：：：：：：：：Iriresnoid：：：：：：：：：：：：：：：：：：FTPrimarySecondary■lue:P>rain二Pa「am二52tj?FSC-H52fiOssc-hQSSC-H521Ofli-hOFLI-H521OFL2-HQFL2-H52f]OFL3-HOFL3-H成I@FL4-H■NeneDDMParam：□FourColorDDMParam：2）從Cytometer菜單中選擇Threshold，出現(xiàn)Threshold窗口在Threshold窗口：確認(rèn)FSC為設(shè)閾參數(shù)，初步確認(rèn)預(yù)設(shè)閾值52。將其拖至空白區(qū)。3）從Cytometer菜單中選擇Compensation，確認(rèn)所有預(yù)設(shè)數(shù)值皆為零。將其拖至空白區(qū)。五、上樣品、設(shè)置儀器使儀器處于HighRUN，樣品管支撐架左移，上陰性對(duì)照管樣品，支撐架回位。確認(rèn)AcquisitionControl窗口中因Setup前需打叉或打勾（即不儲(chǔ)存數(shù)據(jù)，用于儀器設(shè)置）,點(diǎn)擊Acquire。SaveAbortSaveAbort1、調(diào)節(jié)FSC/SSC探測(cè)器（電壓）觀察FSC/SSC圖的變化。FSC電壓（Voltage）預(yù)設(shè)為E00,可調(diào)節(jié)AmpGain從1.00—9.99使主要細(xì)胞群得以清楚顯示（如細(xì)胞較大，將FSC電壓設(shè)置于E-1；較小細(xì)胞，將FSC電壓設(shè)置于E01）。調(diào)節(jié)SSC電壓使主要細(xì)胞群得以清楚呈現(xiàn)。調(diào)節(jié)FSC/SSC圖的原則，在于能得到一獨(dú)立離散的細(xì)胞族群，該細(xì)胞群不與其它族群、細(xì)胞碎片有重迭現(xiàn)象。調(diào)整定位后，點(diǎn)擊AcquisitionControl窗口中的Pause。?4二2?4二2TT毆FourColorOOMParam：FL2:I2、Gat…口細(xì)胞檢品中，常含有大小不同、性質(zhì)相異的細(xì)胞群體。我們常用前方散射（FSC）與側(cè)方散射（SSC）的二維位圖，即散射光圖譜（ScatterPlot），來(lái)圈選出不同細(xì)胞群的范圍，選擇性顯示出有意義的細(xì)胞群體，如下圖圈選白血球之淋巴細(xì)胞族群。1）在工具板中選擇多邊形的Region，在FSC/SSC散點(diǎn)圖上劃定淋巴細(xì)胞R1區(qū)域（如下圖）。分析樣品時(shí)，區(qū)域內(nèi)細(xì)胞應(yīng)會(huì)呈現(xiàn)成紅色，可移動(dòng)或改變形狀來(lái)圈選有意義的細(xì)胞。如果要?jiǎng)h除R1區(qū)域，您可以在工具列中點(diǎn)選Gates-Regionlist，以鼠標(biāo)點(diǎn)選R1,再按Delete鍵刪除R1區(qū)域。刪除R1區(qū)域后，可用繪圖工具板，重畫R1。

EventCol右r罩核球淋巴球2）選取希望Gate的FL1/FL2散點(diǎn)圖、FL1直擇ShowInspector。EventCol右r罩核球淋巴球IdentifyEvent3、調(diào)節(jié)FL1、FL2的探測(cè)器（電壓）IdentifyEvent1）點(diǎn)擊AcquisitionControl窗口中的Restart。在Detector/Amps窗口中調(diào)節(jié)FL1、FL2的電壓，使NegativeControl細(xì)胞群著落在所選直方圖或散點(diǎn)圖之100--101處。

2）在Threshold窗口，適當(dāng)?shù)靥岣逨SC閾值＞52,以去除碎片或低階噪音。唯需注意不要切掉主要細(xì)胞族群。3）點(diǎn)擊AcquisitionControl窗口中的Pause、Abort。移去陰性對(duì)照管，我們已設(shè)定好有意義細(xì)胞群之自體熒光，不要再改動(dòng)Detector/Amps、Threshold等數(shù)值。4、調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償說(shuō)明：最適化的最后一步是調(diào)節(jié)光譜重迭。（如是單色熒光實(shí)驗(yàn)可跳過(guò)此步驟）如是2色樣本，必要時(shí)需調(diào)節(jié)FL2-%FL1，F(xiàn)L1-%FL2（若3色樣本，必要時(shí)需調(diào)節(jié)FL2-%FL1、FL1-%FL2、FL3-%FL2、FL2-%FL3的補(bǔ)償）。1）LowRUN，換上單染CD3-FITC管。點(diǎn)擊AcquisitionControl窗口中的Acquire。調(diào)節(jié)FL2-%FL1使FITC陽(yáng)性細(xì)胞在FL1/FL2散點(diǎn)圖的右下象限。補(bǔ)償調(diào)節(jié)可通過(guò)點(diǎn)擊TJ來(lái)選擇或直接拖動(dòng)滑標(biāo)上下移動(dòng)。調(diào)節(jié)完畢，點(diǎn)擊AcquisitionControl窗口中的Pause。[j：：：：：：：：Compensation：：：：：：：：[ZjFL1FL2FL2FL3FL3FL4FFFF%%%%maltl_+HI±I_ol_3I01_ol0_6_0,0_%FL4FL1-%FL2FL2-363國(guó)%FL1FL2-°-0?%FL3FL3-%FL2FL3-凝噂%FL4FL4-行,貨色%FL3口FL1-%FL2FL2-363國(guó)%FL1FL2-°-0?%FL3FL3-%FL2FL3-凝噂%FL4FL4-行,貨色%FL3口WWC0mpenmatig臼3.）最后以CD3-FITC/CD19-PE雙染樣本上機(jī)，點(diǎn)擊AcquisitionControl窗口中的Restart,確定三群細(xì)胞工整垂直。當(dāng)您已完成2色熒光之光譜重迭時(shí)，點(diǎn)擊AcquisitionControl窗口中的Pause、Abort。4）移去樣本管，換上ddH2O管，讓儀器暫且處于Standby狀態(tài)。關(guān)閉Compensation窗口。您已完成2色熒光之最適化。六、收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)1）決定儲(chǔ)存細(xì)胞總數(shù)：預(yù)設(shè)之「儲(chǔ)存細(xì)胞總數(shù)」為10000。如需修改，從Acquire菜單中選擇Acquisition&Storage，并在出現(xiàn)的窗口功，確認(rèn)「CollectionCriteria」從10000ofAll10000ofAll，再點(diǎn)擊OK。Requisition&orageParameterUe&triptiDnCustomKeymordsCountersEditReagentList,,；EditPanels.^QuantiQuestDisconnectfromCytomGlobalSettd4*hQ￡AcquisitionPlotM2）找個(gè)檔案匣準(zhǔn)備儲(chǔ)存數(shù)據(jù)，本機(jī)所有數(shù)據(jù)都貯存在D盤data盤中，按實(shí)驗(yàn)日期編排。從Acquire菜單中選擇ParameterDescription，GlobalSettd4*hQ￡AcquisitionPlotM2）找個(gè)檔案匣準(zhǔn)備儲(chǔ)存數(shù)據(jù)，本機(jī)所有數(shù)據(jù)都貯存在D盤data盤中，按實(shí)驗(yàn)日期編排。從Acquire菜單中選擇ParameterDescription，出現(xiàn)ParameterDescription對(duì)話方框。點(diǎn)擊Folder，并在隨后出現(xiàn)之對(duì)話方框，選擇「YourFolder」或新建活頁(yè)夾，點(diǎn)擊此對(duì)話方框的Select'YourFolder'（一般用實(shí)驗(yàn)日期來(lái)命名Folder）。900QBrowser:untitledDiredGiryjM-3-WrGahAnUntitledAcquisitionTubeList輯窗口，輸入文件名（根據(jù)實(shí)驗(yàn)來(lái)決定），點(diǎn)擊此對(duì)話方框的OK。Optional：如有需要，可選擇或在P1-P5后的空格中輸入相關(guān)參數(shù)名。如P1：Size,

P2：Granularity,P3：CD35仃0。輸入?yún)?shù)名會(huì)存入實(shí)驗(yàn)檔案中，顯示在圖譜上。計(jì)數(shù)器Counters：從Acquire菜單中選擇Counters.窗口會(huì)顯示樣品分析速率、與總數(shù)進(jìn)度開(kāi)始收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。LOWRUN（根據(jù)Counters來(lái)調(diào)節(jié)速度，一般保持在700-800/Second），將第一管樣品放到檢測(cè)區(qū)，在AcquisitionControl窗口中，將因Setup改成口Setup，此時(shí)CellQuest會(huì)自動(dòng)顯示YourFolder文件名為資料文件名。點(diǎn)擊“Acquire”便可啟動(dòng)樣品之分析測(cè)定與數(shù)據(jù)儲(chǔ)存。當(dāng)計(jì)算機(jī)成功地收取足夠數(shù)據(jù)，會(huì)自動(dòng)儲(chǔ)存數(shù)據(jù)文件文件名.001,并會(huì)以“嘟”聲告知，CellQuest會(huì)自動(dòng)升冪附加檔名成文件名.002。等待下一指示。換上超純水，清洗管路，直到Counters持續(xù)顯示0/Second30s（約為10