流式細胞技術(shù)

流式細胞技術(shù)第一頁，共六十頁，2022年，8月28日第四節(jié)流式細胞術(shù)在免疫學檢查中的應用一、淋巴細胞及其亞群的分析二、淋巴細胞功能分析三、淋巴造血系統(tǒng)分化抗原及白血病免疫分型四、腫瘤耐藥相關蛋白分析五、AIDS病檢測中的應用六、自身免疫性疾病相關HLA抗原分析七、移植免疫中的應用思考題小結(jié)第二頁，共六十頁，2022年，8月28日流式細胞術(shù)(flowcytometry,FCM)是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確的對單個細胞理化特性進行多參數(shù)定量分析和分選的新技術(shù)。第三頁，共六十頁，2022年，8月28日

流式細胞術(shù)最大的特點是能在保持細胞及細胞器或微粒的結(jié)構(gòu)及功能不被破壞的狀態(tài)下，通過熒光探針的協(xié)助，從分子水平上獲取多種信號對細胞進行定量分析或純化分選。

流式細胞術(shù)的特點第四頁，共六十頁，2022年，8月28日第一節(jié)概述第五頁，共六十頁，2022年，8月28日

流式細胞儀是測量染色細胞標記物熒光強度的細胞分析儀，是在單個細胞分析和分選基礎上發(fā)展起來的對細胞的物理或化學性質(zhì)（如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等）進行快速測量并可分類收集的高技術(shù)。第六頁，共六十頁，2022年，8月28日第七頁，共六十頁，2022年，8月28日細胞組成細胞功能大小細胞表面/胞漿/核--特異性抗原粒度細胞活性DNA,RNA含量胞內(nèi)細胞因子蛋白質(zhì)含量激素結(jié)合位點鈣離子,PH值,膜電位酶活性流式細胞儀常檢測的細胞特性第八頁，共六十頁，2022年，8月28日采用激光作為激發(fā)光源，保證其具有更好的單色性與激發(fā)效率；利用熒光染料與單克隆抗體技術(shù)結(jié)合的標記技術(shù)，保證檢測的靈敏度和特異性；一、工作原理第九頁，共六十頁，2022年，8月28日用計算機系統(tǒng)對流動的單細胞懸液中單個細胞的多個參數(shù)信號進行數(shù)據(jù)處理分析，保證了檢測速度與統(tǒng)計分析精確性。第十頁，共六十頁，2022年，8月28日

（1）液流系統(tǒng)（2）光學系統(tǒng)（3）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)1.流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)：第十一頁，共六十頁，2022年，8月28日由樣本和鞘液組成待測細胞 單個細胞的懸液 熒光染料標記的單抗對其染色受清潔氣體壓力 從樣品管進入流動室形成樣本流鞘液：輔助樣本流被正常檢測的基質(zhì)液。主要作用是包裹樣本流的周圍，保持樣本流中細胞處于噴嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞噴孔。

（1）液流系統(tǒng)第十二頁，共六十頁，2022年，8月28日激光光源：氣冷式氬離子激光器分色反光鏡：反射長/短波長，通過短/長波長光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡透鏡組：形成平行光，除去室內(nèi)光濾片：長通、短通、帶通光電倍增管：FS,SS（散射光），F(xiàn)L1,FL2,FL3,FL4（熒光）（2）光學系統(tǒng)第十三頁，共六十頁，2022年，8月28日FlowTipLaserSSandFLDetectorFSDetector光學系統(tǒng)示意圖第十四頁，共六十頁，2022年，8月28日主要由計算機及其軟件組成（3）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)第十五頁，共六十頁，2022年，8月28日基本工作原理第十六頁，共六十頁，2022年，8月28日區(qū)別流式細胞儀顯微鏡光源激光自然光、燈光對象細胞、生物粒子細胞、組織等承載工具鞘液及流動室載玻片檢測信號光學信號形態(tài)及染色放大方式PMT、放大電路目鏡×物鏡、光學放大統(tǒng)計計算機，>5000人工，200結(jié)果多參數(shù)，綜合分析簡單，單參數(shù)流式細胞儀與顯微鏡的區(qū)別第十七頁，共六十頁，2022年，8月28日細胞在液柱中與激光束相交時向周圍360°立體角方向散射的光線信號，它的強弱與細胞的大小、形狀、胞內(nèi)顆粒折射等有關，主要分為前向散射光和側(cè)向散射光。二、散射光的測定第十八頁，共六十頁，2022年，8月28日第十九頁，共六十頁，2022年，8月28日

前向散射光（forwardscatter,FS）：激光束照射細胞時，光以相對軸較小角度(0.5°～10°)向前方散射的訊號用于檢測細胞等粒子的表面屬性，信號強弱與細胞體積大小成正比。第二十頁，共六十頁，2022年，8月28日

側(cè)向散射光（sidescatter,SS）：激光束照射細胞時，光以90°角散射的訊號，用于檢測細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性。第二十一頁，共六十頁，2022年，8月28日

測得的FS與SS信號通過計算機處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號對未染色的活細胞進行分析或分選。此為血細胞分類的基本原理，但不能分析表面分子。光散射測量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群第二十二頁，共六十頁，2022年，8月28日熒光信號由被檢細胞上標記的特異性熒光染料受激發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長與激發(fā)光波長不同。三、熒光測量第二十三頁，共六十頁，2022年，8月28日每種熒光染料會產(chǎn)生特定波長的熒光和顏色，通過波長選擇通透性濾片，可將不同波長的散射光和熒光信號區(qū)分開，送入不同的光電倍增管。第二十四頁，共六十頁，2022年，8月28日選擇不同的單抗及染料就可同時測定一個細胞上的多個不同特征。線性放大器和對數(shù)放大器第二十五頁，共六十頁，2022年，8月28日熒光染料的特性激發(fā)波長(EXCITING)發(fā)射波長(EMISSION)第二十六頁，共六十頁，2022年，8月28日

通過流式細胞儀進行細胞分選主要是在對具有某種特征的細胞需進一步培養(yǎng)和研究時進行的。四、細胞分選原理第二十七頁，共六十頁，2022年，8月28日細胞懸液形成液流柱流動室振動液流斷裂成液滴空白液滴含細胞的液滴棄去偏轉(zhuǎn)落入收集器壓電晶體產(chǎn)生機械振動不充電充電（一）分選基本原理第二十八頁，共六十頁，2022年，8月28日分選速度：單位時間內(nèi)分選的細胞數(shù)量。與懸液中細胞的含量成正比。分選純度：分選出的目的細胞占所有收獲細胞的百分率。（二）分選的技術(shù)要求第二十九頁，共六十頁，2022年，8月28日分選收獲率：實際收獲的分選細胞與設定通過測量點的分選細胞之間的比率。與純度成反比。分選得率：從一群體細胞懸液中分辨出目的細胞的總量，再經(jīng)分選后得到目的細胞的實際得率。與分選速度成反比。第三十頁，共六十頁，2022年，8月28日第二節(jié)數(shù)據(jù)的顯示與分析第三十一頁，共六十頁，2022年，8月28日參數(shù)：FS,SS,FL數(shù)據(jù)顯示方式（單參數(shù)直方圖、雙參數(shù)散點圖、二維等高圖、假三維等高圖、三參數(shù)散點圖）設門分析技術(shù)第三十二頁，共六十頁，2022年，8月28日FS：反映顆粒的大小SS：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復雜程度FL：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少一、參數(shù)第三十三頁，共六十頁，2022年，8月28日單參數(shù)直方圖雙參數(shù)直方圖:點圖 二維等高圖 假三維等高圖三參數(shù)直方圖多參數(shù)分析直分析方圖二、數(shù)據(jù)顯示方式第三十四頁，共六十頁，2022年，8月28日由一維參數(shù)(散射光或熒光)與顆粒計數(shù)(COUNT)構(gòu)成，反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數(shù)量的多少。（一）單參數(shù)直方圖第三十五頁，共六十頁，2022年，8月28日雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測量細胞的兩個測量參數(shù)，根據(jù)這兩個參數(shù)就可以確定細胞在圖上的表達位置。（二）雙參數(shù)直方圖第三十六頁，共六十頁，2022年，8月28日雙參數(shù)信號通常采用對數(shù)信號，最常用的是點密圖，在圖中，每個點代表一個細胞，點圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數(shù)量的多少。第三十七頁，共六十頁，2022年，8月28日2.二維等高圖由類似地圖上的等高線組成，其本質(zhì)也是雙參數(shù)直方圖。等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細胞相對或絕對數(shù)，即“等高”。曲線層次越高(越里面的線)所代表的細胞數(shù)愈多。等高線越密集則表示細胞數(shù)變化率越大。第三十八頁，共六十頁，2022年，8月28日

多參數(shù)分析：當細胞標記了多色熒光，被激發(fā)光激發(fā)后，得到的熒光信號和散射光信號可根據(jù)需要進行組合分析。（四）流式細胞儀的多參數(shù)分析第三十九頁，共六十頁，2022年，8月28日第四節(jié)流式細胞儀免疫分析的技術(shù)要求

第四十頁，共六十頁，2022年，8月28日樣本制備標記染色液相芯片技術(shù)質(zhì)量控制第四十一頁，共六十頁，2022年，8月28日外周血淋巴細胞樣品的制備 分離單個核細胞培養(yǎng)細胞的樣品制備蛋白酶消化機械吹打使貼壁細胞脫落洗滌尼龍網(wǎng)過濾單細胞懸液一、免疫檢測樣品制備第四十二頁，共六十頁，2022年，8月28日新鮮實體組織單細胞懸液的制備機械法酶處理法化學試劑處理法表面活性劑處理法第四十三頁，共六十頁，2022年，8月28日單細胞懸液的保存深低溫保存法（一年）乙醇或甲醇保存法（2周）甲醛或多聚甲醛保存法（2月）第四十四頁，共六十頁，2022年，8月28日適用條件:有較高的量子產(chǎn)額和消光系數(shù)對488nm的激發(fā)光波長有較強的吸收發(fā)射光波長與激發(fā)光波長間有較大的波長差易與標記單抗結(jié)合而不影響抗體的特異性二、常用的熒光染料與標記染色第四十五頁，共六十頁，2022年，8月28日名稱染料激發(fā)波長熒光顏色溶解性對PH敏感性特點異硫氰酸熒光素FITC488綠525易敏感易溶于水，與抗體結(jié)合不影響特異性得州紅Texasred568紅615不易不敏感穩(wěn)定，偶聯(lián)后量子產(chǎn)額低藻紅蛋白PE488橙575易不敏感具較多發(fā)光基團，消光系數(shù)和量子產(chǎn)額高藻青蛋白PC488別藻青蛋白APC633紅670能量傳遞復合染料PEcy5488紅670易不敏感減少交叉，成本高常用的幾類熒光染料第四十六頁，共六十頁，2022年，8月28日

用化學法將兩種不同激發(fā)波長的染料結(jié)合在一起，在488nm激發(fā)光照射下，通過一個熒光染料被激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長再激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生熒光信號，從而檢測到該特定熒光信號。能量傳遞復合染料第四十七頁，共六十頁，2022年，8月28日熒光染料與細胞成分的四種結(jié)合方式

結(jié)構(gòu)親和式 嵌入結(jié)合 共價鍵結(jié)合 熒光標記抗體特異性結(jié)合（二）免疫熒光標記第四十八頁，共六十頁，2022年，8月28日免疫熒光標記方法

直標:干擾少,但需購買多種單抗

間標:步驟多,干擾多,不需標記多種抗體 組合標記第四十九頁，共六十頁，2022年，8月28日免疫膠乳顆粒的應用即液相芯片技術(shù)是把微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色，把針對不同檢測物的乳膠微球混合后再加入待標本，在懸液中與微粒進行特異性地結(jié)合，經(jīng)激光照射后不同待測特產(chǎn)生不同顏色，并可進行定量分析。因檢測速度極快，所以又有“液相芯片”之稱。三、免疫膠乳顆粒技術(shù)的應用第五十頁，共六十頁，2022年，8月28日微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色（固相芯片是用探針在芯片上的坐標位置給基因的特異性編碼；而液相芯片則是用顏色來編碼）第五十一頁，共六十頁，2022年，8月28日第四節(jié)在免疫學檢驗中的應用第五十二頁，共六十頁，2022年，8月28日

流式細胞術(shù)目前已廣泛地被應用于免疫學基礎研究和逐步進入臨床應用各方面，用流式細胞儀對細胞表面的抗原成分進行標記分析，可區(qū)別多種細胞的特性，為細胞免疫的研究增加了有效的手段和幫助。第五十三頁，共六十頁，2022年，8月28日T淋巴細胞及其亞群分析

Th(CD3+CD4+CD8-T);Tc(CD3+CD4-CD8+T)B淋巴細胞及其亞群分析

B1(CD19+CD5+):產(chǎn)生IgM型自身抗體,參與免疫調(diào)節(jié)、與自身免疫病的發(fā)生有關

B2(CD19+CD5-):受外來抗原刺激,產(chǎn)生高親和性特異性抗體NK細胞分析

NK(CD3-CD16+CD56+)一、淋巴細胞及其亞群的分析第五十四頁，共六十頁，2022年，8月28日細胞介導細胞毒性試驗(死細胞與活細胞比例)細胞內(nèi)細胞因子測定二、淋巴細胞功能分析第五十五頁，共六十頁，2022年，8月28日三、淋巴造血系統(tǒng)及白血病免疫分型對淋巴瘤和白血病進行多色免疫分型用于選擇化療方案、判斷預后及檢出微小殘留病變第五十六頁，共六十頁，2022年，8月28日CD4+Th細胞、CD4+/CD8+比例

MDR(+)表示對化療藥物耐藥四、腫瘤耐藥基因分析五、AIDS病檢測中的應用第五十七頁，共六十頁，2022年，8月28日HLA-B27可出現(xiàn)在58%～97%的強直性脊椎炎(As)患者 六、自身免疫病相關HLA抗原分析第五十八頁，共六十頁，2022年，8月28日

FCM作為一個強大的技術(shù)平臺，已應用于多個領域，其在