對單增李斯特菌的5個毒力基因進行克隆和序列分析,微生物論文

對單增李斯特菌的5個毒力基因進行克隆和序列分析,微生物論文單核細胞增加性李斯特菌〔Listeriamonocytogenes，LM〕，是近20年來才逐步被人們認識的一種人獸共患疾病的致病菌。其在4℃下可生長繁衍并污染食品繼而感染人類，感染后發(fā)病死亡率約為25%,WHO將其列為20世紀90年代食品中四大致病菌之一，也被列為21世紀對中國人衛(wèi)生健康具有重大影響的12種病原微生物之一。近年來，國內外報道從多種食品中分離到李斯特菌或食品污染李斯特菌而引起的食物中毒爆發(fā)事例，為此單增李斯特菌成為新的重要的食源性疾病病原菌，已引起了食品衛(wèi)生管理部門的廣泛關注，很多國家均加強了對該菌的檢測及研究工作。自1996年以來，新疆先后有5個地區(qū)的3個牧區(qū)、4個農區(qū)養(yǎng)羊場爆發(fā)以神經異常感覺和狀態(tài)為主要特征的李氏桿菌病，造成1300余只羔羊死亡。學者們從采集病死綿羊的腦和肝、脾等進行病原菌分離，分離得到LM90株，運用多重PCR方式方法確定LM90為4b血清型。當前LM有16個血清型，華而不實1/2a、1/2b、4b血清型是LM致病菌株最主要的血清型，研究表示清楚，來自食品和患者的95%分離株都屬于這此3個血清型。本實驗以單增李斯特菌新疆羊源臨床分離的4b血清型菌株LM90為實驗菌株，對LM90菌株的5個毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ進行了克隆和序列分析，旨在了解LM90與其他的LM4b的5個毒力基因的差異，揣測羊源的LM90感染人的可能性。1、材料與方式方法1.1材料單增李斯特菌LM90菌株，DH5由本實驗室保存，PMD-19T載體，sfil和pvul限制性內切酶購自寶生物公司，質粒DNA小劑量制備試劑盒，瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自Novengy公司；Buffer，DNTP，Taq酶，Marker2000，Marker5000購自北京東盛公司；腦心浸液培養(yǎng)基購自青島高科技園海博生物技術有限公司，瓊脂購自Biotopped公司，瓊脂糖購自Biowest公司。1.2方式方法1.2.1引物的設計合成參照Genbank中頒布的單增李斯特菌F2365基因全長序列〔登陸號為AE017262〕，用Primer5.0軟件設計Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ基因引物〔表1〕，引物由華大基因公司合成，測序由上海生工完成。1.2.2Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ基因片段的克隆用裂解法提取LM90的DNA，以提取的LM90的DNA為模板，PCR擴增Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ基因。其反響體系為：10buffer〔含MgCl2〕3L，dNTP〔2.5mmol/L〕1L，上游引物〔25mmol/L〕1L，下游引物〔25mmol/L〕1L，TaqDNA酶(2.5U/mL)1L，模板2L，ddH2O21L，總體積30L。反響條件如下：95℃3min；94℃50s；70℃〔Auto為68℃，InlJ為69℃〕45s；72℃，3min〔InlB，InlC為90s〕；72℃，10min；4℃保存。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將PCR擴增產物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收后，與PMD-19T連接，連接體系為：PMD19-T0.5L，PCR回收產物4.5L，solutionI5L，4℃過夜連接。取過夜連接產物10L，參加到100L的E.coliDH5感受態(tài)細胞中，冰浴30min，42℃熱擊60s，冰浴2min，參加800L的液體LB，放置在37℃搖床中，搖菌1h，5000r/min，離心2min，棄出800L上清，混勻，涂到含有Amp〔100g/mL〕的LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)。挑取過夜培養(yǎng)的單個菌落，分別放置于含有Amp〔100g/mL〕的液體LB中，37℃搖菌，3h后，以菌液為模板，進行PCR的挑選鑒定和限制性內切酶的鑒定。然后將挑選的陽性質粒送交上海生工進行序列的測定，并采用DNAMAN軟件對其進行序列分析。2、結果與分析2.1LM90株Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ基因的擴增用相對應的引物分別對Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ基因進行PCR擴增，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳得到與預期值相符的目的片段，片段長度依次為2244、2304、1140、891、2508bp(圖1)。2.2LM90株Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ基因的克隆目的基因經DNA凝膠回收試劑盒回收后和PMD19-T載體連接，連接產物轉化DH5感受態(tài)細胞，分別挑取重組質粒PMD19-T-Ami、PMD19-T-Auto、PMD19-T-InlB、PMD19-T-InlC、PMD19-T-InlJ單個白色菌落，增菌培養(yǎng)1-2h，分別用相應的引物對目的基因進行菌液PCR擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳分析結果，對陽性菌提取質粒，用限制性內切酶sfil和pvul對陽性質粒做酶切鑒定〔圖2〕。2.3LM90菌株毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ核苷酸及推導的氨基酸的序列分析用DNAMAN軟件對序列進行分析，LM90菌株毒力基因Ami與Genbank中頒布的參考株F2365的Ami基因的核苷酸序列同源性為98.04%，序列分析顯示該基因共有6處發(fā)生了堿基突變，分別是：第183位核苷酸由C突變?yōu)門，第228位核苷酸由T突變?yōu)镃，第552位，第1145位核苷酸由A突變?yōu)镚，第1515位核苷酸由T突變?yōu)锳，第1659位核苷酸由G突變?yōu)锳。Ami編碼747個氨基酸，推導氨基酸序列的同源性到達99.73%。氨基酸序列有6處發(fā)生突變，華而不實4處是同義突變，2處是錯義突變，錯義突變的是第360位氨基酸由Tyr突變?yōu)镃ys，第483位氨基酸由Phe突變?yōu)長eu。LM90菌株毒力基因Auto與Genbank中頒布的參考株F2365的Auto基因的核苷酸序列同源性為96.59%，序列分析顯示該基因共有4處發(fā)生了堿基突變，分別是：第448位核苷酸由A突變?yōu)镃，第630位核苷酸由T突變?yōu)镃，第1258位核苷酸由A突變?yōu)镚，第1825位核苷酸由C突變?yōu)門。Auto編碼774個氨基酸，推導氨基酸序列的同源性到達99.61%，氨基酸序列有4處發(fā)生突變，華而不實2處是同義突變，3處是錯義突變，錯義突變的是第83位氨基酸由Glu突變?yōu)锳sp，第144位氨基酸由Leu突變?yōu)镻ro，第414位氨基酸由Asp突變?yōu)閂al。LM90菌株毒力基因InlB與Genbank中頒布的參考株F2365的InlB基因的核苷酸序列同源性為98.20%，序列分析顯示該基因共有1處發(fā)生堿基突變，第656位核苷酸由T突變?yōu)镚。InlB編碼379個氨基酸，推導氨基酸序列的同源性到達99.74%，氨基酸序列有1處錯義突變，第206位氨基酸由Trp突變?yōu)镚ly。LM90菌株毒力基因InlC與Genbank中頒布的參考株F2365的InlC基因的核苷酸序列同源性為96.41%，序列分析顯示該基因共有4處發(fā)生了堿基突變，分別是第63位，第208位，第856位核苷酸由T突變?yōu)镃，第673位核苷酸由T突變?yōu)锳。InlC編碼296個氨基酸，推導氨基酸序列的同源性到達99.66%，氨基酸序列有4處突變，華而不實1處是同義突變，3處是錯義突變，錯義突變的是第11位氨基酸由Val突變?yōu)锳la，第116位氨基酸由Lys突變?yōu)锳sn，第126位氨基酸由Val突變?yōu)镸et。LM90菌株毒力基因InlJ與Genbank中頒布的參考株F2365的InlJ基因的核苷酸序列同源性為98.23%，序列分析顯示該基因共有4處發(fā)生了堿基突變，分別是第591位核苷酸由A突變?yōu)門，第658位核苷酸由G突變?yōu)锳，第1404位核苷酸由C突變?yōu)門，第2348位核苷酸由T突變?yōu)镃。InlJ編碼835個氨基酸，推導氨基酸序列的同源性到達99.76%，氨基酸序列有4處突變，華而不實2處是同義突變，2處是錯義突變，錯義突變的是第189位氨基酸由Asn突變?yōu)锳sp，第752氨基酸由Ser突變?yōu)镻he。3、討論與小結單增李斯特菌4b血清型主要有F2365、clip80459、LL195、J1-220、J1816、07PF0776六種，華而不實LL195、clip80459、07PF0776是從人類的臨床病例中分離出來的，F2365、J1816、J1-220是從食品中分離出來的，通過比擬其他5株菌的毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ，得出F2365與其他5株菌〔LL195、J1816、clip80459、J1-220、07PF0776〕的同源性均為99%~100%。序列比對講明單增李斯特菌4b血清型的這5個毒力基因序列相對保守，不同源的4b血清型菌株之間的變異較小。由于單增李斯特菌4b血清型的5個毒力基因比擬保守，本研究以F2365菌株作為參考，研究了與單增李斯特菌粘附侵襲相關的毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJ的變異情況。Ami、Auto基因編碼具有自溶作用的蛋白，該蛋白包括信號肽區(qū)，N端催化域〔Ami〕和自溶區(qū)〔Auto〕，C端由GW區(qū)組成。N端區(qū)域能特異性的辨別細胞壁上的肽聚糖，進而毀壞細菌細胞壁，GW區(qū)使細菌粘附至靶細胞外表。LM90株Ami第483位氨基酸在GW區(qū)有1個錯義突變的氨基酸，由Phe突變?yōu)長eu。AutoN端有2個錯義突變氨基酸，第83位氨基酸由Glu突變?yōu)锳sp，第144位氨基酸由Leu突變?yōu)镻ro，C端在其GW區(qū)有1個錯義突變氨基酸，第414位氨基酸由Asp突變?yōu)閂al。InlB、InlC、InlJ是LM內化素家族的成員，該類蛋白主要介入細菌的侵襲，粘附。內化素蛋白N端均有LRR重復區(qū)，C端差異比擬大，InlBC端為GW區(qū)，InlC沒有GW區(qū)，只要5個連續(xù)的LRR重復區(qū)，InlJC端為LPXTG基元。LRR重復區(qū)介入細菌的粘附和信號的傳遞，LPXTG基元能使蛋白質結合到宿主細胞的胞漿膜上。LM90株InlB錯義突變的氨基酸不在它的這些功能區(qū)域，InlJ錯義突變的氨基酸位于它的C端的細胞壁錨定區(qū)，第752氨基酸由ser突變?yōu)閜he，InlC在LRR區(qū)有2個氨基酸的錯義突變，分別是第116位氨基酸由Lys突變?yōu)锳sn，第126位氨基酸由Val突變?yōu)镸et。本研究通過對LM90毒力基因Ami、Auto、InlB、InlC、InlJPCR擴增，測序，并將序列提交到NCBI上，登錄號分別為KF826613、KF826614、KF826611、KF703749、KF826612。將序列與F2365進行比對，核苷酸的同源性高達96%，氨基酸的同源性高達9