第二講血脂脂蛋白及載脂蛋白測定

第二講血脂脂蛋白及載脂蛋白測定演示文稿第一頁，共三十頁。優(yōu)選第二講血脂脂蛋白及載脂蛋白測定第二頁，共三十頁。血脂和脂蛋白檢測前應(yīng)注意的問題

分析前主要影響因素有：

1.生物學(xué)因素如個(gè)體間、性別、年齡和種族等。

2．行為因素如飲食、肥胖、吸煙、緊張、飲酒、飲咖啡和鍛煉等。

3．臨床因素如①疾病繼發(fā)；②藥物誘導(dǎo)4．標(biāo)本收集與處理第三頁，共三十頁。建議：

1．抽血前2周保持平時(shí)的飲食習(xí)慣。2．抽血前3天避免高脂飲食，24小時(shí)內(nèi)不飲酒，不作劇烈運(yùn)動(dòng)。3．應(yīng)在禁食12～14小時(shí)后空腹抽血。4．除臥床的患者外，一般應(yīng)坐位休息5分鐘后抽血。5．抽血前最好停用影響血脂的藥物數(shù)天或數(shù)周，否則應(yīng)記錄用藥情況。第四頁，共三十頁。（一）血清外觀分析（血清冷置試驗(yàn)）

混濁（TG增高）下層濁（VLDL增高）Ⅴ型下層清（VLDL正常）Ⅰ型均勻混濁（VLDL↑）TC正常Ⅳ型上層奶油樣（CM↑）TC增高Ⅱa型TC正常正常人清亮（TG正常）TC↑Ⅱb，Ⅲ型空腹血清

測TC

4℃過夜

測TC第五頁，共三十頁。（二）血清總膽固醇測定

膽固醇是人體重要的脂類成分，具有重要的生理功能，如合成類固醇激素，維生素D3膽汁酸，并構(gòu)成細(xì)胞膜成分，TC包括FC（1/3）和CE（2/3），膽固醇與動(dòng)脈粥樣硬化有密切關(guān)系，故膽固醇測定是最常用的實(shí)驗(yàn)室檢測項(xiàng)目之一。

TC測定方法很多，約200多種，分為化學(xué)測定法、酶法、氣相色譜法、高效液相色譜法、核素稀釋質(zhì)譜法（決定性方法）。第六頁，共三十頁。1、化學(xué)測定法主要有兩類（1）Liberman-Burchard反應(yīng)簡稱L-B反應(yīng)，膽固醇經(jīng)冰醋酸，濃硫酸脫水生成3.5-膽烷二烯陽離子，然后被醋酐，濃硫酸氧化生成綠色的膽烷六烯磺酸。呈色穩(wěn)定性差。（2）Zak反應(yīng)膽固醇經(jīng)冰醋酸，濃硫酸脫水生成3.5-膽烷二烯陽離子，然后在Fe3+存在下氧化生成紫紅色膽烷四烯陽離子，靈敏度較L-B反應(yīng)高7倍，且呈色穩(wěn)定性好，但試劑腐蝕性極大，不能用于自動(dòng)化分析。

第七頁，共三十頁。2、酶法膽固醇酯膽固醇＋脂肪酸膽固醇＋O2膽烷-4-烯-3酮＋H2O2H2O2

＋4AAP＋酚紅色亞胺醌＋H2OCEHChODPOD

試劑中除上述三種酶外，還有膽酸鈉和表面活性劑及穩(wěn)定劑，膽酸鈉用于激活CEH，表面活性劑促進(jìn)膽固醇從脂蛋白中釋放。酶法操作簡便，快速，試劑無腐蝕性，適合于自動(dòng)化分析，但也存在有一些不足，CEH對(duì)膽固醇水解不完全，表面活性劑影響CEH活性，黃疸血清中過高的膽紅素可還原H2O2使結(jié)果偏低。第八頁，共三十頁?！緟⒖挤秶?.10～5.70mmol/L【臨床意義】血清TC含量受年齡、性別、飲食和運(yùn)動(dòng)等因素的影響。①20歲以上隨年齡↑而↑，70歲以后則有下降趨勢。②20～40歲階段男性高于女性，但女性絕經(jīng)后則高于男性。③城市人群高于農(nóng)村人群，與飲食和運(yùn)動(dòng)有關(guān)。④腦力勞動(dòng)者高于體力勞動(dòng)者。病理性高膽固醇血癥原發(fā)性高膽固醇血癥、糖尿病、膽道阻塞、腎病綜合癥、甲狀腺功能減退。病理性低膽固醇血癥嚴(yán)重貧血、甲亢、營養(yǎng)不良。第九頁，共三十頁。（三）血清甘油三脂測定

TG是有一分子甘油與三分子脂肪酸組成的化合物，主要存在于VLDL和CM中，臨床化學(xué)中往往以測定甘油代表TG的含量。TG的測定方法很多，如氣相色譜法、高效液相色譜法、紅外分光光度法。但上述方法需特殊的儀器設(shè)備和技術(shù)，故一般只用于研究工作中。臨床實(shí)驗(yàn)室主要用化學(xué)法和酶法。第十頁，共三十頁。1、化學(xué)法

基本步驟可歸納為四步（1）提?。焊视腿奶崛〔捎煤线m的溶劑，使脂蛋白變性提取TG，同時(shí)去除干擾物質(zhì)(磷脂、游離甘油、葡萄糖等),常用方法有：

1）異丙醇抽提，沸石合劑（沸石、高嶺土）吸附。

2）異丙醇抽提，氧化鋁吸附磷脂。

3）正壬烷、異丙醇、稀硫酸分溶抽提，免去吸附磷脂的操作，后用價(jià)廉的正庚烷代替正壬烷。應(yīng)用較廣。第十一頁，共三十頁。（2）皂化：甘油三脂的水解一般都采用KOH乙醇或KOH異丙醇溶液，60℃，5～15min可使TG完全水解。（3）氧化：甘油的氧化最常用的氧化劑是HIO4，甘油在酸性條件下被氧化成甲醛、甲酸。反應(yīng)受α-磷酸甘油、葡萄糖、絲氨酸的干擾，故抽提時(shí)應(yīng)盡量除去此類物質(zhì)的干擾。第十二頁，共三十頁。

（4）顯色：顯色測定甲醛。常用方法有：

1）甲醛與變色酸（4.5-二羥-2.7-萘二磺酸）在硫酸溶液中加熱生成紫紅色化合物。（570nm）

2）甲醛與乙酰丙酮在氨的存在下縮合成黃色的3.5-二乙酰-1.4-二氫-2.6-二甲基吡啶。（420nm）第十三頁，共三十頁。2、酶法

常用的有：（1）磷酸甘油氧化酶法（GK-GPOD-POD法）

TG＋H2O甘油＋FA甘油＋ATP3-磷酸甘油＋ADP3-磷酸甘油＋O2

磷酸二羥丙酮＋H2O2

H2O2

＋4-AAP＋酚紅色亞胺醌＋H2O

試劑較穩(wěn)定，靈敏度高，線性范圍寬，膽紅素、維生素C可消耗H2O2使結(jié)果偏低。LPLGK

GPOD

POD

第十四頁，共三十頁。（2）乳酸脫氫酶法（GK-PK-LDH法）TG＋H2O甘油＋FA甘油＋ATP3-磷酸甘油＋ADPADP＋磷酸烯醇式丙酮酸ATP＋丙酮酸丙酮酸＋NADH＋H+

乳酸＋NAD+

（3）甘油氧化酶法第一步消除血清中原有的甘油：

LPLGPOD

PKLDH

第十五頁，共三十頁。游離甘油＋O2

甘油醛＋H2O2GlyODH2O2

＋EMAE無色物質(zhì)

EMAE稱N-乙基-N-（3-甲基）-N-乙酰乙二胺。是一種還原劑，靈敏度比酚高。第二步測定甘油三脂水解釋放的甘油：

TG＋H2O甘油＋FA

甘油＋O2

甘油醛＋H2O2

H2O2

＋4-AAP＋EMAE有色化合物

POD

GlyODLPL

POD

第十六頁，共三十頁。【參考范圍】0.56～1.70mmol/L【臨床意義】血清TG一般隨年齡增長而升高，體重超標(biāo)者往往偏高。

1.病理性增高原發(fā)性高脂蛋白血癥、肥胖癥、糖尿病、腎病綜合癥、脂肪肝、妊娠后期。

2.病理性降低甲亢、腎上腺皮質(zhì)功能減退、嚴(yán)重肝功能損傷。

第十七頁，共三十頁。(四)血清（漿）脂蛋白測定

1、血清脂蛋白電泳臨床實(shí)驗(yàn)室常用的支持介質(zhì)有醋酸纖維薄膜和瓊脂糖凝膠。（1）血清脂蛋白醋酸纖維薄膜電泳以醋酸纖維薄膜為支持介質(zhì)，血清脂蛋白經(jīng)電泳分離，然后用臭氧氧化，使脂蛋白中的不飽和脂肪酸的雙鍵斷裂生成醛，再用亞硫酸品紅染色，即生成紫紅色區(qū)帶。第十八頁，共三十頁。（2）血清脂蛋白預(yù)染瓊脂糖電泳

血清脂蛋白經(jīng)飽和蘇丹黑B預(yù)染后，以瓊脂糖凝膠為支持介質(zhì)，進(jìn)行電泳分離，即可得到清晰的蘭色區(qū)帶。凝膠濃度一般為0.5%，超過1%，β-Lp與preβ-Lp不易分開，＜0.5%，凝膠機(jī)械強(qiáng)度太低。血清：染料為9：1，染料過多稀釋標(biāo)本，而且染料中乙醇會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，影響分離效果。

第十九頁，共三十頁。

結(jié)果判斷，直觀區(qū)帶的著色深淺，寬窄，用淺染，稍淺染，深染及消失加以描述；或用光密度掃描儀測定?！緟⒖挤秶喀?Lp30%～40%preβ-Lp13%～25%β-Lp50%～60%CM（－）第二十頁，共三十頁。2、血清高密度脂蛋白測定常以測定HDL-C含量代表HDL水平。測定步驟包括①HDL的分離；②測定HDL中膽固醇。

HDL的分離方法有：超速離心法、凝膠過濾法、免疫化學(xué)法、電泳法、沉淀法。臨床實(shí)驗(yàn)室常用沉淀法。沉淀劑一般為二價(jià)陰離子和多價(jià)陰離子。如：肝素-Mg2+、硫酸葡聚糖-Mg2+、磷鎢酸-Mg2+、聚乙二醇（PEG）等。第二十一頁，共三十頁。

如：磷鎢酸-Mg2+選擇性地沉淀血清中的LDL和VLDL，經(jīng)離心上清液中保留HDL，然后用酶法測定上清液中的膽固醇含量，即代表HDL中的膽固醇?！緟⒖挤秶磕?.28±0.33mmol/L女1.37±0.33mmol/L【臨床意義】HDL-C與冠心病發(fā)病呈負(fù)相關(guān)，HDL-C低于0.9mmol/L是冠心病危險(xiǎn)因素。第二十二頁，共三十頁。3、血清高密度脂蛋白亞組分測定

HDL有三個(gè)亞類（HDL1、HDL2、HDL3）最近的研究工作表明，HDL2亞類與冠心病危險(xiǎn)度的相關(guān)程度比總HDL-C更密切。

HDL2

d=1.063～1.125g/mlHDL3

d=1.125～1.210g/mlHDL2脂類60%蛋白質(zhì)40%；

HDL3脂類45%蛋白質(zhì)55%第二十三頁，共三十頁。

高密度脂蛋白亞組分的分析方法有超速離心法、柱層析法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、多價(jià)陰離子分級(jí)沉淀法。其中多價(jià)陰離子分級(jí)沉淀法具有快速、經(jīng)濟(jì)、簡便更為實(shí)用，是目前臨床實(shí)驗(yàn)室最常用的方法。常用的沉淀劑有硫酸葡聚糖-Mg2+、聚乙二醇（PEG）。第二十四頁，共三十頁。【原理】用PEG做沉淀劑，以不同濃度的PEG在不同pH條件下分別將VLDL和LDL（沉淀劑Ⅰ95g/LPEG，pH6.5）HDL2（沉淀劑Ⅱ170g/LPEG，pH7.5）沉淀，上清液中只含有HDL（沉淀劑Ⅰ）和HDL3（沉淀劑Ⅱ），然后用酶法測定HDL-C和HDL3-C，并以HDL-C減去HDL3-C的差即為HDL2-C的含量。

【參考范圍】HDL2-C男0.53±0.17mmol/L

女0.62±0.22mmol/LHDL3-C男0.75±0.17mmol/L

女0.75±0.16mmol/L第二十五頁，共三十頁。4、低密度脂蛋白測定低密度脂蛋白水平通常以LDL-C含量表示。LDL-C測定方法很多，常用的有：（1）Friedewald公式法

LDL-C＝TC－HDL-C－或在一般情況下能得到可被臨床接受的近似結(jié)果，但TG＞4.25mmol/L時(shí)不能應(yīng)用此公式計(jì)算，否則結(jié)果偏差太大。TG2.2TG5mg/dlmmol/L第二十六頁，共三十頁。（2）聚乙烯硫酸鹽沉淀法聚乙烯硫酸（PVS）能選擇性沉淀血清中LDL，再以血清TC減去上清液（含HDL和VLDL）膽固醇，即得LDL-C值。試劑中加入EDTA去除兩價(jià)陽離子，避免VLDL共沉，輔以聚乙二醇獨(dú)甲醚（PEGME）可加速沉淀。（3）直接測定法勻相的LDL-C直接測定法是以不同的表面活性劑的雙試劑使非LDL-C與LDL-C分兩步水解，因先消除非LDL-C，故也稱為消除法?！緟⒖挤秶縇DL-C≤3.12mmol/L【臨床意義】LDL-C增高是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素。第二十七頁，共三十頁。5、脂蛋白（a）測定脂蛋白(a)是由