生物素親和素反應(yīng)的放大技術(shù)

生物素親和素反應(yīng)的放大技術(shù)第一頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日第二節(jié)親合素、鏈霉親合素的理化性質(zhì)與標(biāo)記一、理化特性二、親合素（或鏈酶親合素）的標(biāo)記第一節(jié)生物素的理化性質(zhì)與標(biāo)記

一、活化生物素

二、活化生物素標(biāo)記蛋白質(zhì)第二頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日第三節(jié)生物素-親合素系統(tǒng)的特點(diǎn)

一、靈敏度二、特異性

三、穩(wěn)定性四、適用性

五、其他思考題小結(jié)第四節(jié)生物素-親合素系統(tǒng)的應(yīng)用

一、生物素-親合素系統(tǒng)基本類型及原理

二、生物素-親合素系統(tǒng)在酶免疫測(cè)定中的應(yīng)用

三、生物素-親合素系統(tǒng)在熒光免疫技術(shù)中的應(yīng)用

四、生物素-親合素系統(tǒng)在放射免疫測(cè)定中的應(yīng)用

五、生物素-親合素系統(tǒng)在分子生物學(xué)中的應(yīng)用第三頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日生物素（biotin）、親和素（avidin）是一對(duì)具有高度親和力的物質(zhì)，結(jié)合迅速、專一、穩(wěn)定并具有多級(jí)放大效應(yīng)。BABBAABC第四頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日生物素（維生素H）動(dòng)、植物組織中廣泛分布,卵黃和肝含量高分子量小，244.31DI環(huán)為咪唑酮環(huán)，可與親合素結(jié)合Ⅱ環(huán)為噻吩環(huán)，C2上戊酸側(cè)鏈的未端羧基是結(jié)合生物大分子的唯一結(jié)構(gòu)I咪唑酮環(huán)

Ⅱ噻吩環(huán)

羧基:可用于活化為其他衍生物第一節(jié)生物素理化性質(zhì)與標(biāo)記第五頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日一、活化生物素生物素側(cè)鏈的末端羧基經(jīng)化學(xué)修飾后制成帶各種活性基團(tuán)的衍生物－活化生物素(生物素化衍生物)為何要活化？第六頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日活化生物素活化生物素易與抗原、抗體、酶及核酸分子中相應(yīng)基團(tuán)偶聯(lián)形成生物素化標(biāo)記物標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基的活化生物素標(biāo)記蛋白質(zhì)醛基的活化生物素標(biāo)記蛋白質(zhì)巰基的活化生物素標(biāo)記核酸的活化生物素第七頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日活化生物素標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基的活化生物素BNHS分子可與蛋白質(zhì)

賴氨酸（堿性AA）的氨基形成肽鍵BNHS適用標(biāo)記抗體和

中性或偏堿性的蛋白質(zhì)生物素N-羥基丁二酰胺碳二亞胺生物素羥基琥珀酰亞胺酯(BNHS)第八頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日如何減小空間位阻長(zhǎng)臂活化生物素（BCNHS）：生物素和N-羥基丁二酰亞胺之間添加了兩個(gè)6-氨基已糖分子基團(tuán)，形成連結(jié)臂，生物素與大分子基團(tuán)的距離增加，更易發(fā)揮生物素的活性作用。生物素分子量小，當(dāng)與抗體或酶形成生物素標(biāo)記結(jié)合物后，由于大分子蛋白的空間位阻效應(yīng)，可對(duì)生物素與親和素的結(jié)合以及BAS的應(yīng)用效果造成干擾。？第九頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日標(biāo)記蛋白質(zhì)醛基的活化生物素生物素酰肼(BHZ)：水合肼與生物素的合成物主要用于標(biāo)記偏酸性糖蛋白肼化生物胞素(BCHZ)

：生物素與賴氨酸連接后，再與無(wú)水肼反應(yīng)而成。除醛基外，BCHZ還可標(biāo)記氨基第十頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日標(biāo)記蛋白質(zhì)巰基的活化生物素馬來(lái)酰亞胺-丙酰-生物胞素（MPB)：能特異地與蛋白質(zhì)巰基結(jié)合的活化生物素第十一頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日標(biāo)記核酸的活化生物素光生物素(photobiotin)光敏物質(zhì)側(cè)鏈上連接的芳香基疊氮物基團(tuán),經(jīng)光照后,變?yōu)榉枷慊趸?，可直接與腺嘌呤氨基結(jié)合,形成B-核酸探針，用于DNA或RNA的標(biāo)記。生物素脫氧核苷三磷酸（如Bio-dUTP）作為TTP的結(jié)構(gòu)類似物，可采用缺口移位法（DNaseI和DNA聚合酶I）摻入到雙鏈DNA中。BNHS和BHZ

可直接標(biāo)記核酸，但對(duì)堿基配對(duì)有影響。目前常用光生物素和生物素化dUTP作為標(biāo)記核酸的活化生物素。第十二頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日特性：活化生物素通過(guò)側(cè)鏈與蛋白分子連接；一個(gè)蛋白分子可被多個(gè)生物素標(biāo)記－多價(jià)性（是BAS多級(jí)放大作用的物質(zhì)基礎(chǔ)）；BNHS多標(biāo)記抗體和中性或偏堿性的蛋白質(zhì),BHZ則多標(biāo)記微酸性抗原；抗原、抗體標(biāo)記后活性不變；可對(duì)標(biāo)記材料（如酶）標(biāo)記：堿性磷酸酶標(biāo)記后，活性降低；二、活化生物素標(biāo)記蛋白質(zhì)第十三頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日注意事項(xiàng)：選擇活化生物素：依抗原或抗體分子所帶可標(biāo)記基團(tuán)的種類（氨基、醛基或巰基）以及分子的酸堿性；控制生物素：蛋白質(zhì)比例生物素：IgG用量比(mg/mg)宜為2:1,IgG應(yīng)用濃度

0.5~5μg/ml;

生物素1~3個(gè)/Ag，3~5個(gè)/Ab；使用交聯(lián)臂減少空間阻力第十四頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日第二節(jié)親合素、鏈霉親合素的理化性質(zhì)與標(biāo)記

親合素(avidin,AV)和鏈霉親合素(streptavidin,SA)是生物素的天然特異性結(jié)合物。而且，二者均為大分子蛋白，因此幾乎所有用于標(biāo)記的物質(zhì)均可以同親合素（AV）或鏈酶親合素（SA）結(jié)合。第十五頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日結(jié)構(gòu)

四亞基糖蛋白四肽鏈蛋白無(wú)糖基PI

10.56結(jié)合位

色氨酸色氨酸生物素

44Ka

10151015活性

13～15U15～18U親合素（AV）鏈霉親合素(SA)一、理化特性SA表面所帶正電荷少，且不含糖基，非特異性結(jié)合遠(yuǎn)低于AV，因此目前以SA標(biāo)記的酶結(jié)合物更為常用。第十六頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日二、親合素/鏈霉親合素的標(biāo)記可標(biāo)記AV/SA的物質(zhì)：酶、抗原或抗體、鐵蛋白、膠體金、125I、異硫氰酸熒光素（FITC）等。

HRP-AV(SA)（酶標(biāo)記蛋白的直接標(biāo)記法）：過(guò)碘酸鈉法、戊二醛法。ABC/SABC：通過(guò)與生物素化酶復(fù)合物中的生物素結(jié)合，間接地與酶形成結(jié)合物。

AV(SA)+B-HRP/ALPABC(avidin-biotin-peroxidasecomlplex)/ABAP

第十七頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日第三節(jié)生物素-親合素系統(tǒng)(BAS)的特點(diǎn)靈敏度高:生物素標(biāo)記蛋白具有多價(jià)性，且標(biāo)記后的抗原/抗體生物活性不變，每個(gè)親合素有四個(gè)生物素結(jié)合部位，可同時(shí)以多價(jià)形式結(jié)合到生物素化大分子衍生物和標(biāo)志物上，因此，BAS具有多級(jí)放大作用，反應(yīng)的靈敏度高。穩(wěn)定性高和特異性強(qiáng)：AV/SA與生物素結(jié)合的親和常數(shù)比抗原-抗體反應(yīng)至少高1萬(wàn)倍，二者的結(jié)合呈高度專一性和不可逆性，且酸、堿、變性劑、蛋白溶解酶、有機(jī)溶劑以及反應(yīng)試劑的高度稀釋均不影響其結(jié)合。因此，BAS穩(wěn)定性高，特異性強(qiáng)。第十八頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日第三節(jié)生物素-親合素系統(tǒng)(BAS)的特點(diǎn)適用性廣泛：BAS的多級(jí)放大作用，以及既可偶聯(lián)生物大分子，又可連接標(biāo)記材料，使BAS不僅用于微量抗原、抗體及受體的定量、定性檢測(cè)及定位觀察研究，亦可制成親和介質(zhì)用于上述各類反應(yīng)體系中反應(yīng)物的分離、純化。其他：可制成通用試劑（如生物素化二抗等）；反應(yīng)試劑可高度稀釋，特別是與一抗偶聯(lián)使用可大幅減少一抗用量，降低實(shí)驗(yàn)成本；實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間不長(zhǎng)。第十九頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日第四節(jié)生物素-親合素系統(tǒng)的應(yīng)用生物素與親合素之間結(jié)合的親合力高、特異性強(qiáng)，各自均可以與各型大小分子結(jié)合，以及二者在結(jié)合反應(yīng)時(shí)具有的多級(jí)放大作用等優(yōu)越性，使BAS及其相關(guān)技術(shù)被廣泛應(yīng)用在各種標(biāo)記免疫分析技術(shù)領(lǐng)域中，尤其為標(biāo)記免疫檢測(cè)自動(dòng)化分析做出了極大的貢獻(xiàn)。

第二十頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日一、生物素-親合素系統(tǒng)基本類型及原理BAB法：

Ag+B·AbAg-Ab·BA/SAAg-Ab·B-A/SAB·EAg-Ab·B-A/SA-B·E

特點(diǎn)：以游離A/SA分別連接B-Ab和B-E第二十一頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日BA法，也稱標(biāo)記親合素-生物素法:

（labeledavidin-biotin,LAB）Ag+B·AbAg-Ab·BA·E/SA·EAg-Ab·B-A/SA·E特點(diǎn)：以A·E/SA·E代替BAB法中的A/SA，省卻了加B·E的步驟第二十二頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日3.

ABC法⑴A+B·EA-B·E----ABC⑵Ag+B·AbAg-Ab·BABCAg-Ab·B-ABC特點(diǎn):將BAB法中的A先與B-E結(jié)合，制備成復(fù)合物

ABC,網(wǎng)絡(luò)了大量酶分子，使該法的檢測(cè)靈敏度顯著提高。第二十三頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日BABBAABCBAB與ABC成員相同，反應(yīng)順序不同第二十四頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日此外，按待檢反應(yīng)體系中所用的是生物素化第一抗體或生物素化第二抗體，BAS分為直接法和間接法。

方法

反應(yīng)層次

直接法BAAg-(Ab-B)-A*BABAg-(Ab-B)-A-B*ABCAg-(Ab-B)-A-B*C

間接法BAAg-Ab1-(Ab2-B)-A*BABAg-Ab1-(Ab2-B)-A-B*ABCAg-Ab1-(Ab2-B)-A-B*CBAS實(shí)驗(yàn)方法及反應(yīng)層次第二十五頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日二、生物素-親合素系統(tǒng)在酶免疫測(cè)定中的應(yīng)用BAS在ELISA中的應(yīng)用：

BAS用于固相化抗原/抗體的制備AV/SA先包被固相載體、抗原/抗體先與生物素結(jié)合AV/SA-B反應(yīng)而使抗原/抗體固相化。

BAS用于ELISA的終反應(yīng)放大BA-ELISA、BAB-ELISA、ABC-ELISABAS在均相酶免疫測(cè)定中的應(yīng)用：

B·E*AA-B·E（酶因活性中心受空間位阻作用而失活）反應(yīng)系統(tǒng)：B·E*

、Ag·A、Ab（限量）、標(biāo)準(zhǔn)Ag/待檢AgAg·A和待檢Ag競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合限量Ab，若AgAg·AbAg·AAg·A-B·E

酶活性變化與待測(cè)標(biāo)本中抗原濃度呈負(fù)劑量相關(guān)。（酶活性降低）第二十六頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日三、生物素-親合素系統(tǒng)在熒光免疫技術(shù)中的應(yīng)用BAS用于熒光抗體技術(shù)可明顯提高方法的靈敏度和特異性，通常采用BA法，即用熒光素直接標(biāo)記親合素（或鏈酶親合素）；也可采用游離親合素（或鏈酶親合素）搭橋，兩端分別連接生物素化抗體和熒光素標(biāo)記的生物素（BAB法）或熒光標(biāo)記的抗親合素（或鏈酶親合素）抗體的夾心法。

BAS用于時(shí)間分辨熒光免疫分析也可以將反應(yīng)信號(hào)放大。第二十七頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日四、生物素-親合素系統(tǒng)在放射免疫測(cè)定中的應(yīng)用BAS主要與免疫放射分析(IRMA)檢測(cè)體系偶聯(lián)，用于對(duì)終反應(yīng)的放大（BA法