第六章基因工程抗體

第六章基因工程抗體第一頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日EmilvonBehring,1901,

antitoxinsGeoregesKohlerandCesarMilstein,1984,monoclonalantibodySusumuTonegama,1987,

structureofIggeneGeraldEdelmanandRodneyPorter,1972,structureofantibodyPaulEhrlich,1908,productionofantibodyNobelPrizewinners第二頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日第三頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日免疫球蛋白的功能第四頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日5美國(guó)FDA已批準(zhǔn)的治療抗體藥物OrthocloneReoProRituxanZenapaxSimulectSynagisRemicadeHerceptinMylotargCampath-1HZevalin移植排斥心絞痛B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤移植排斥移植排斥嬰兒呼吸道合胞病毒類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎乳腺癌急性復(fù)發(fā)性髓性白血病難治性慢性淋巴細(xì)胞白血病難治性B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤19861994199719971998199819981998200020012002第五頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日一抗體分子結(jié)構(gòu)第六頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日免疫球蛋白的功能區(qū)第七頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日免疫球蛋白的水解片段第八頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日complimentaritydeterminingregion,

CDR第九頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日hypervaribleregion

(HVR)(complimentaritydeterminingregion,

CDR):formationoftheAgbindingsite第十頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日purple:HVCDR(inboththeribbonandballandstickviews)green:antigenHVsequencescontacttheantigen.antibodyantigenantigen-antibodycomplex:

epitope第十一頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日theantibodymolecularsurface,withthePorAantigensuperimposed.Closeupofahydrogenbond–TheTyr101oftheantibodyformsahydrogenbondwiththeGln121oftheantigen第十二頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日13Ig胚系基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)在Ig分子多肽鏈中，κ型、λ型輕鏈和Ig的重鏈分別寫(xiě)作Igκ、Igλ和IgH，基因依次寫(xiě)作IGK、IGL和IGH，其分別位于第2、22和14號(hào)染色體上。

第十三頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日14重鏈:位于14號(hào)染色體，可分為4組CμV區(qū)編碼基因:

VH(可變區(qū))-----48

DH(多樣性區(qū))-----23

JH(連接區(qū))-----6C區(qū)編碼基因:

CH(恒定區(qū)):Cμ,Cδ,Cγ等10個(gè)片段第十四頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日15輕鏈(--2號(hào)染色體,--22染色體)V區(qū)編碼基因:

----V,J---40,5

----V,J---30,4C區(qū)編碼基因:

C(1);C(4)第十五頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日二、細(xì)胞工程抗體和基因工程抗體第一代：多克隆抗血清第二代：細(xì)胞工程抗體第三代：基因工程抗體抗體技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了三個(gè)階段第十六頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日1890年Behring和北里柴三郎等人發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素，并建立了血清療法，開(kāi)抗體制藥之先河。

1937年Tiselius等人用電泳法將血清分為白蛋白、甲種（α）球蛋白、乙種（β

）球蛋白、丙種（γ

）球蛋白，并證明抗體活性主要存在于丙種球蛋白組分。

1975年K?hlerandMilstein等首次利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出單克隆抗體(monoclonalantibody,MAb)。1994年基因工程抗體。第十七頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日1、多克隆抗體(polyclonalantibody;PcAb)第十八頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日多價(jià)抗原多個(gè)克?。ㄖ旅舻腂細(xì)胞）多克隆抗體第十九頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日

實(shí)際意義

（1）預(yù)防、治療感染性疾病，如：破傷風(fēng)抗毒素血清抗破傷風(fēng)，胎盤(pán)球蛋白抗病毒感染等，副作用：超敏反應(yīng)。（2）臨床診斷，如：肥達(dá)氏反應(yīng)---傷寒、副傷寒，缺點(diǎn)：特異性差。第二十頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日2、單克隆抗體（monoclonalantibody,McAb）由單一克隆B細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生的，只識(shí)別抗原分子某一特定抗原決定簇的特異性抗體。特點(diǎn)：具有高度均一性。雜交瘤細(xì)胞：骨髓瘤細(xì)胞---無(wú)限增殖；免疫B細(xì)胞---合成、分泌特異性抗體。雜交瘤技術(shù)---HAT培養(yǎng)基：次黃嘌呤(H),氨基蝶呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)。第二十一頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日

單抗制備的流程圖第二十二頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日

實(shí)際意義：

（1）抗原的純化和結(jié)構(gòu)分析；（2）細(xì)胞發(fā)生、分化及功能的闡明；（3）臨床疾病的診斷和治療，如：免疫分子檢測(cè)；免疫導(dǎo)向藥物治療惡性腫瘤

---McAb抗癌藥物(毒素或放射核素偶聯(lián))。

第二十三頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日多克隆抗體單克隆抗體來(lái)源動(dòng)物免疫血清、恢復(fù)期病人血清或免疫接種人群多為鼠源性特點(diǎn)來(lái)源廣泛、制備容易純度高、特異性強(qiáng)、效價(jià)高、少或無(wú)血清交叉反應(yīng)組成針對(duì)不同抗原表位的抗體的混合物針對(duì)單一表位，結(jié)構(gòu)和組成高度均一，抗原特異性及同種型一致應(yīng)用疾病的被動(dòng)免疫治療疾病診斷、特異性抗原或蛋白的檢測(cè)和鑒定、疾病的被動(dòng)免疫治療和生物導(dǎo)向藥物制備缺點(diǎn)特異性不高、易發(fā)生交叉反應(yīng)，不易大量制備人體應(yīng)用后可導(dǎo)致人鼠抗體反應(yīng)多克隆抗體與單克隆抗體的比較第二十四頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日單抗體內(nèi)應(yīng)用和療效受限原因：1.鼠源性單抗對(duì)人體有較強(qiáng)的免疫原性2.注入人體的單抗在腫瘤部位的攝取量甚少3.生產(chǎn)成本高,難于普及應(yīng)用第二十五頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日人雜交瘤技術(shù)未獲真正突破原因:融合率低、建株難、不穩(wěn)定、產(chǎn)量低、人體不能隨意免疫新思路：盡量減少抗體中的鼠源成分，但又盡量保留原有的抗體特異性?；蚬こ炭贵w：根據(jù)研究者的意圖，采用基因工程方法，在基因水平，對(duì)免疫球蛋白基因進(jìn)行切割、拼接或修飾后導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生新型抗體，主要包括嵌合抗體、人源化抗體、小分子抗體、抗體融合蛋白和雙特異性抗體。第二十六頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日27基因工程抗體第二十七頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日1小分子抗體3鼠單抗人源化基因工程改造的抗體2第二十八頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日

第一代的抗體人源化—嵌合抗體

從雜交瘤細(xì)胞分離出鼠MAb功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)（決定免疫原性）基因連接，插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)人-鼠嵌合抗體。嵌合抗體由于這兩部分在空間結(jié)構(gòu)上相對(duì)獨(dú)立，其獨(dú)特的抗體親和力保持得很好，但因鼠單抗可變區(qū)的存在，應(yīng)用時(shí)仍有較強(qiáng)的免疫排斥反應(yīng)。

特點(diǎn)：減少了鼠源性抗體的免疫原性，同時(shí)保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力。第二十九頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日Pr鼠VH人CHPr鼠VL人CL免疫球蛋白基因載體的構(gòu)建H鏈嵌合載體L鏈嵌合載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞啟動(dòng)子人-鼠嵌合抗體基因工程改造策略第三十頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日鼠VH鼠VL人CL人CH抗體分泌細(xì)胞人-鼠嵌合基因工程抗體第三十一頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日第二代的抗體人源化——改型抗體

在嵌合抗體的基礎(chǔ)上進(jìn)一步將鼠MAb可變區(qū)中相對(duì)保守的FR(frameworkregion)替換成人的FR，保留與抗原結(jié)合部位決定簇互補(bǔ)區(qū)（complementdeterminantregion)部位(即CDR移植)

早期的改型抗體：簡(jiǎn)單的CDR移植，通過(guò)點(diǎn)突變進(jìn)行微調(diào)即更換某個(gè)位點(diǎn)上的氨基酸。第三十二頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日第三十三頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日CDR序列CDR序列鼠單克隆抗體人抗體人源化抗體鼠單克隆V區(qū)人源化（CDR移植）第三十四頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日

小分子抗體

人源化抗體屬完全的抗體分子。通過(guò)基因重組技術(shù)，可以在保持原有抗原結(jié)合活性的基礎(chǔ)上，把完整的抗體分子改造成較小的分子，稱(chēng)為小分子抗體。根據(jù)其價(jià)數(shù)的不同可分為單價(jià)小分子抗體及多價(jià)小分子抗體。第三十五頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日單價(jià)小分子抗體一、Fab抗體

Fab段由重鏈V區(qū)及CH1功能區(qū)與整個(gè)輕鏈以二硫鍵形式連接而成，主要發(fā)揮抗體的抗原結(jié)合功能。Fab抗體只有完整IgG的1/3。第三十六頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日二、單鏈抗體(ScFv)

定義：用基因工程方法，將抗體VH和VL（重鏈和輕鏈可變區(qū)）通過(guò)一個(gè)連接肽連接而成的小分子抗體，功能：具有較好的抗原結(jié)合能力，且分子量小、穿透力強(qiáng)、免疫原性低等特性?？膳c其他效應(yīng)分子構(gòu)建成多種具有新功能的抗體分子，是構(gòu)建免疫毒素和雙特異抗體等的理想而基本的元件。Ag第三十七頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日

ScFv應(yīng)用：用于腫瘤的導(dǎo)向治療腫瘤的影像分布基因治療研究基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系第三十八頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日小分子抗體123第三十九頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日免疫球蛋白基因載體的構(gòu)建H鏈表達(dá)載體L鏈表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞PrVHCH1PrVLCLFab抗體分子的制備IFabantibodymolecule第四十頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日抗體分泌細(xì)胞VHVLCL-S-S-CH1Fab抗體分子的制備第四十一頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日IIFvantibodymolecule第四十二頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日分別構(gòu)建載體L鏈表達(dá)載體H鏈表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞PrVHPrVLFv[二硫鍵穩(wěn)定的Fv(disulfide-stabilizedFv,ds-Fv)]小分子抗體的制備(1)ds-Fv第四十三頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日抗體分泌細(xì)胞VHVL-S-S-Fv小分子抗體的制備disulfide-stabilizedFv,ds-Fv第四十四頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日VHVL接頭DNA(Gly4Ser)3VH引物PCRVH接頭DNA酶切、克隆ScFv(singlechainFv,scFv)的構(gòu)建變性、復(fù)性VL引物(2)Sc-FvVL第四十五頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日三、單域抗體

抗體與抗原的結(jié)合主要由Ig的V區(qū)決定，因此只含V區(qū)基因片段的小分子抗體，即只有VH或VL一個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，也能保持原單克隆抗體的特異性。這種小分子的抗體片段就稱(chēng)為單域或單區(qū)抗體，其分子量?jī)H為整個(gè)Ig分子的1／12，故也稱(chēng)之為小抗體。第四十六頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日四.超變區(qū)多肽

抗體抗原結(jié)合是經(jīng)過(guò)補(bǔ)體決定區(qū)（CDR）來(lái)實(shí)現(xiàn)。因此，CDR是構(gòu)成抗原抗體結(jié)合的最小結(jié)構(gòu)單位。根據(jù)這一特點(diǎn)，可以設(shè)計(jì)出那些在抗原識(shí)別及親和力方面有重要意義的CDR多肽，直接用于診斷或治療，可望獲得理想的結(jié)果。這種只含有一個(gè)CDR多肽的抗體，稱(chēng)為超變區(qū)多肽，亦稱(chēng)為最小識(shí)別單位(minimalrecognitionunit,MRU)。第四十七頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日提高抗體效應(yīng)功能抗體融合蛋白雙特異性抗體偶連細(xì)胞毒物質(zhì)細(xì)胞內(nèi)抗體提高抗體效應(yīng)功能第四十八頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日雙特異性抗體抗原A抗原B-S-S-FabVHCH1VL-S-S-CH1VHVLFvVHVL第四十九頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日第五十頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日CTLCD3TUMORCELL-S-S-VHCH1VL-S-S-CH1抗原A抗原B第五十一頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日制備雙特異性抗體的方法主要有3種：

（1）雜化雜交瘤技術(shù)：將具有某種特異性（如抗瘤細(xì)胞）的Mab細(xì)胞株與具有抗第二抗原（如蓖麻毒蛋白）的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合，即產(chǎn)生出雜化雜交瘤細(xì)胞株的二價(jià)瘤體。第五十二頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日它們分泌的是重鏈、輕鏈被雜化的抗體分子，有10種形式：重鏈、輕鏈都無(wú)改變，保持原特異性的配對(duì)抗體分子：

LH-HL，KG-GK

重鏈特異性相同的配對(duì)抗體分子：

LH-HK，KH-HKKG-GL，LG-GL

重鏈、輕鏈特異性不同的配對(duì)抗體分子：

LH-GK，LH-GLKH-GL，KH-GK第五十三頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日在這些雜化抗體分子中，只有LH-GK配對(duì)的才是所需的雙功能抗體分子。第五十四頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日（2）化學(xué)交聯(lián)法：Nisonoff和Rivers最早從事這方面的研究。化學(xué)交聯(lián)的方法無(wú)需經(jīng)過(guò)細(xì)胞融合，所以比較簡(jiǎn)便易行。通常利用重鏈與輕鏈這間的二硫鏈經(jīng)還原和再氧化，將兩種不同特異性抗體的半分子結(jié)合在一起?；蛴秒p功能交聯(lián)劑，如鄰苯酸酯等，把兩個(gè)抗體半分子交聯(lián)在一起。

第五十五頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日第五十六頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日

用于制備雙功能抗體的Mab可以是完整分子，也可是經(jīng)胃酶水解獲得F（abˊ）2片段。后者在減少鼠源免疫原性方面，效果較好。第五十七頁(yè)，共六十二頁(yè)，2022年，8月28日（3）利用基因工程技術(shù)將兩套重輕鏈基因?qū)牍撬枇黾?xì)胞或傳染瘤細(xì)胞中。這種方法制備的雙功能抗體可選擇合適的穩(wěn)定區(qū)和合適的類(lèi)及亞類(lèi)，而得到較好的產(chǎn)量較