第六講轉(zhuǎn)錄修改

第六講轉(zhuǎn)錄修改第一頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日6.1.基本概念6.2.原核生物RNA轉(zhuǎn)錄的起始6.3.真核生物RNA轉(zhuǎn)錄的起始6.4.轉(zhuǎn)錄的延伸6.5.轉(zhuǎn)錄的終止6.6.原核生物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工6.7.真核生物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工6.8.真核生物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中內(nèi)元的去除第二頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日第一節(jié)基本概念

第三頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

轉(zhuǎn)錄(transcription):是指以DNA為模板，在依賴于DNA的

RNA聚合酶催化下，以4中rNTP（ATP、

CTP、GTP和UTP）為原料，合成RNA

的過程。在有些病毒中，RNA也可以指導(dǎo)合成RNA。

若干基本概念

是基因表達(dá)的第一步，也是最關(guān)鍵的一步。

以DoubleStrandDNA中的一條單鏈作為轉(zhuǎn)錄模板

(雜交實(shí)驗(yàn)所證實(shí))第四頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

有義鏈(sensestrand)[又稱編碼鏈codingstrand]:

指不作模板的DNA單鏈

反義鏈(antisensestrand)[又稱模板鏈templatesrand]:指作為模板進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄的鏈(60年代以前的表示方法與此相反)

沒有A＝UG＝C的規(guī)律第五頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

在依賴DNA的RNA聚合酶作用下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄

A＝U、C≡G合成RNA分子轉(zhuǎn)錄合成RNA鏈的方向?yàn)?’→3’，模板單鏈DNA的極性方向?yàn)?’→5’，而非模板單鏈的極性方向與RNA鏈相同，均為5’→3’。（書寫）基因轉(zhuǎn)錄方式為不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄(一條單鏈DNA為模板,RNA

聚合酶的結(jié)合)第六頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日RNA的轉(zhuǎn)錄包括promotion.elongation.terminaton

三過程從啟動(dòng)子(promoter)到終止子(terminator)稱為轉(zhuǎn)錄單位(transcriptionunit)(轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn))

原核生物的轉(zhuǎn)錄單位多為polycistroninoperon,真核生物中的

轉(zhuǎn)錄單位多為monocistron,Nooperon

轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)即轉(zhuǎn)錄原點(diǎn)記為＋1，其上游記為負(fù)值，下游記為正值upstreamstartpointdownstream－10＋1＋10第七頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日第八頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日第二節(jié)原核生物RNA轉(zhuǎn)錄的起始

(RNATranscriptionpromotioninprokaryots)第九頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日兩個(gè)相關(guān)概念:＊操縱元(operon):

是原核生物基因表達(dá)調(diào)控的一個(gè)完整單元，其中包括結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因、操作子和啟動(dòng)子ipozyaNolacmRNAAbsenceoflactoseActiveipozya-GalactosidasePermeaseTransacetylasePresenceoflactose

Inactive第十頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日第十一頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

啟動(dòng)子(promoter)：是指DNA分子上被RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合形成起始轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的區(qū)域，它還包括一些調(diào)節(jié)蛋白因子的結(jié)合位點(diǎn)(頻率、效率)一、原核生物的RNApolymerase(E.coli)1、全酶(HoloEnzyme)和核心酶(CoreEnzyme)＋σββ’ααCoreEnzyme

βααβ’σHoloEnzyme第十二頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

(1)全酶（HoloEnzyme）

?用于轉(zhuǎn)錄的起始

?依靠空間結(jié)構(gòu)與DNA模板結(jié)合(σ與核心酶結(jié)合后引起的構(gòu)象變化)

?專一性地與DNA序列(啟動(dòng)子)結(jié)合

?結(jié)合常數(shù)：1014／mol

?半衰期：數(shù)小時(shí)（107／mol1秒以下）

?轉(zhuǎn)錄效率低，速度緩慢（σ的結(jié)合

）第十三頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

（2）核心酶（CoreEnzyme）

?作用于轉(zhuǎn)錄的延伸過程（終止）

?依靠靜電引力與DNA模板結(jié)合（蛋白質(zhì)中堿性基團(tuán)與DNA的磷酸根之間）

?非專一性的結(jié)合（與DNA的序列無關(guān)）

?結(jié)合常數(shù)：1011／mol?半衰期：60秒第十四頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

此外，新發(fā)現(xiàn)的一種ω亞基的功能尚不清楚。2、各亞基的特點(diǎn)和功能

（1）σ

因子

?σ因子可重復(fù)使用

?修飾RNApol構(gòu)型

?使HoloEnzyme識(shí)別啟動(dòng)子的SextamaBox(－35區(qū)),

并通過σ與模板鏈結(jié)合2α

＋βα2ββ’＋σ

α

2β

＋β’α2ββ’σ（3）全酶的組裝過程第十五頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

?不同的σ因子識(shí)別不同的啟動(dòng)子

E.coli中有四種σ因子（σ70、σ32、σ54、σ28）枯草桿菌中有11種σ因子

（σ因子的更替對(duì)轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控）（2）α因子?核心酶的組建因子

?促使RNApol與DNA模板鏈結(jié)合α＋α2α＋β

α2β＋β’

?前端α因子－－使模板DNA雙鏈解鏈為單鏈

?尾端α因子－－使解鏈的單鏈DNA重新聚合為雙鏈第十六頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

（3）β因子?促進(jìn)RNApol＋NTPRNAelongation?完成NMP之間的磷酸酯鍵的連接

?Editing功能（排斥與模板鏈不互補(bǔ)的堿基）

?與Rho（ρ）因子競(jìng)爭(zhēng)RNA3’－end第十七頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

Esite（elongationsiteRifR）:對(duì)NTP非專一性地結(jié)合（催化作用和Editing功能）

（4）β’因子

?參與RNA非模板鏈（sensestrand）的結(jié)合（充當(dāng)SSB）

?構(gòu)成Holoenzyme后，β因子含有兩個(gè)位點(diǎn)

Isite（initiationsite.Rifs）:

該位點(diǎn)專一性地結(jié)合

ATP或者GTP（需要高濃度的ATP或GTP）第十八頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日由于各亞基的功能，使全酶本身含有五個(gè)功能位點(diǎn)

有義DNA鏈結(jié)合位點(diǎn)（

β’亞基提供）

DNA/RNA雜交鏈結(jié)合位點(diǎn)（β亞基提供）雙鏈DNA解鏈位點(diǎn)（前端α亞基提供）單鏈DNA重旋位點(diǎn)（后端α亞基提供）

σ因子作用位點(diǎn)第十九頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日E.coliRNApolymerase用于起始和延伸只用于起始36.5KD36.5KD151KD155KD11KD70KD第二十頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

二、啟動(dòng)子（promoter）的結(jié)構(gòu)與功能（）

1、啟動(dòng)子由兩個(gè)部分組成

（1）上游部分—CAP-cAMP結(jié)合位點(diǎn)

（基因表達(dá)調(diào)控的正控制位點(diǎn)）

CAP（catabolitegeneActivatorProtein）降解物基因活化蛋白，環(huán)腺苷酸（cAMP）的受體蛋白

（2）下游部分—RNApol的進(jìn)入（結(jié)合）位點(diǎn)

－35~－10

包括識(shí)別位點(diǎn)和結(jié)合位點(diǎn)（RB位點(diǎn)）第二十一頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日2、RNA聚合酶的進(jìn)入位點(diǎn)（1）Pribonow框（PribonowBox）

§-10序列，RNA聚合酶的牢固結(jié)合位點(diǎn)

結(jié)合位點(diǎn)（B位點(diǎn)）

§一致序列：T80A95T45A60A50T96

（TATPUAT）

§位置范圍－4到－13因此又稱TATABox保守T第二十二頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日（2）Sextama框（SextamaBox）

§-35序列，RNA聚合酶的松弛（初始）結(jié)合位點(diǎn)，

§RNA聚合酶依靠其σ亞基識(shí)別該位點(diǎn)

—識(shí)別位點(diǎn)（R位點(diǎn)）

§大多數(shù)啟動(dòng)子中共有序列為T82T84G78A65C54A45§重要性:很大程度上決定了啟動(dòng)子的強(qiáng)度

（RNApol的σ因子）

§

位置在不同啟動(dòng)子中略有變動(dòng)第二十三頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日第二十四頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日（3）起始位點(diǎn)（initiationsite）：＋1位點(diǎn)

RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)

起始NTP多為ATP或GTP

第二十五頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日起始過程：

a.全酶與啟動(dòng)子結(jié)合的封閉型啟動(dòng)子復(fù)合物的形成（

R位點(diǎn)被σ因子發(fā)現(xiàn)并結(jié)合）第二十六頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

b、開放型啟動(dòng)子復(fù)合物的形成

§RNApol的一個(gè)適合位點(diǎn)到達(dá)－10序列區(qū)域，誘導(dǎo)富含A·T的Pribnow框的“熔解”，形成12－17bp的泡狀物，同時(shí)酶分子向－10序列轉(zhuǎn)移并與之牢固結(jié)合

§開放型啟動(dòng)子復(fù)合物使RNApol聚合酶定向

§兩種復(fù)合物均為二元復(fù)合物（全酶和DNA

）第二十七頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日12～17bp第二十八頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

c.在開放型的啟動(dòng)子復(fù)合物中，RNApol的I位點(diǎn)和E位點(diǎn)的核苷酸前體間形成第一個(gè)磷酸二酯鍵（

β

亞基）三元復(fù)合物形成

+1位多為CAT模式,位于離開保守T6~9個(gè)核苷酸處---6-9bp---GCTATTGACATATAAT-----16-18bp-------+1-35sequence-10sequence（4）σ因子解離→核心酶與DNA的親和力下降起始過程結(jié)束→核心酶移動(dòng)進(jìn)入延伸過程第二十九頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)錄的起始過程σ核心酶12～17bp第三十頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日（β亞基）第三十一頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日3、CAP-cAMP結(jié)合位點(diǎn)（也稱CAP位點(diǎn)）

轉(zhuǎn)錄調(diào)控中，I→阻遏蛋白→負(fù)調(diào)控

lac

操縱子模型第三十二頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日I第三十三頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

許多基因的表達(dá)還存在正調(diào)控機(jī)制

例如:E.coli培養(yǎng)基中乳糖和葡萄糖共存時(shí)→只有葡萄糖被利用原因：CAP位點(diǎn)的正調(diào)控

?葡萄糖缺少時(shí)，腺苷酸環(huán)化酶將ATP→cAMP，

cAMP與CAP位點(diǎn)結(jié)合,此時(shí)啟動(dòng)子的進(jìn)入位點(diǎn)才能與RNApol結(jié)合

?葡萄糖存在時(shí)，cAMP不能形成，沒有CAP－cAMP

與CAP位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)子的RNApol進(jìn)入位點(diǎn)不能結(jié)合RNApol

第三十四頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

因此,一個(gè)操縱元中有兩道控制開關(guān),只有同時(shí)打開,結(jié)構(gòu)基因才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。（對(duì)lac操縱元而言，只有沒有葡萄糖，有乳糖時(shí)才能進(jìn)行錄）（1）CAP位點(diǎn)的組成（－70～－40）

位點(diǎn)Ⅰ：－70～－50

包括一個(gè)IR序列

強(qiáng)結(jié)合位點(diǎn)

位點(diǎn)Ⅱ：－50～－40

弱結(jié)合位點(diǎn)位點(diǎn)Ⅰ對(duì)位點(diǎn)Ⅱ具有協(xié)同效應(yīng)（cooperativity）第三十五頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日第三十六頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日（2）位點(diǎn)Ⅱ結(jié)合CAP－cAMP復(fù)合物后，促使RNApol進(jìn)入

SextamaBox,最終與－10序列結(jié)合起始轉(zhuǎn)錄

原因：CAP－cAMP復(fù)合物與位點(diǎn)Ⅱ結(jié)合→SextamaBox富含G·C區(qū)域（G·C島區(qū)）穩(wěn)定性降低→

PribnowBox的溶解溫度降低→促進(jìn)開放型啟動(dòng)子復(fù)合物的形成→促進(jìn)轉(zhuǎn)錄第三十七頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日第三十八頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日4、RNApol在DNA上結(jié)合位點(diǎn)的鑒定

DNase法----------40bp

而足跡法（footprinting）結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確

足跡法原理：

?限制酶切割結(jié)合有RNApol的DNA→大分子DNA?末端標(biāo)記該DNA（Klenow片段標(biāo)記3’,堿性磷酸酯酶標(biāo)記5’）

?用內(nèi)切酶降解DNA（控制反應(yīng)條件）

?凝膠電泳分離，放射自顯影觀察第三十九頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日限制酶切分離大片段DNA第四十頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日末端標(biāo)記大分子DNA重新結(jié)合RNApol

作對(duì)照直接用DNase進(jìn)行降解電泳用微量DNase降解電泳第四十一頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日第四十二頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

?用足跡法鑒定出來的RNApol與DNA的結(jié)合區(qū)域?yàn)?/p>

+20~－50（－40），大約60~70bp

5、啟動(dòng)子各位點(diǎn)與轉(zhuǎn)錄效率的關(guān)系

（1）－35序列與－10序列與轉(zhuǎn)錄效率的關(guān)系

標(biāo)準(zhǔn)啟動(dòng)子－35TTGACA

－10TATAAT第四十三頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

則不同的啟動(dòng)子

a.與標(biāo)準(zhǔn)啟動(dòng)子序列同源性越高→啟動(dòng)強(qiáng)度越大b.與標(biāo)準(zhǔn)啟動(dòng)子同源性越低→啟動(dòng)強(qiáng)度越小

c.與標(biāo)準(zhǔn)啟動(dòng)子差異很大時(shí)→由另一種σ因子啟動(dòng)原因:?－35序列通過被σ因子識(shí)別的容易→決定啟動(dòng)子強(qiáng)度

?－10序列影響開放型啟動(dòng)子復(fù)合物形成的速度→決定啟動(dòng)子強(qiáng)度第四十四頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

（2）－35序列與－10序列的間隔區(qū)與轉(zhuǎn)錄效率的關(guān)系◆堿基序列并不重要◆間距非常重要，17bp的間距轉(zhuǎn)錄效率最高◆間距上的突變種類：間距趨向于17bp→

上升突變間距遠(yuǎn)離17bp→下降突變?啟動(dòng)子上升突變、啟動(dòng)子下降突變第四十五頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日E.Coli各σ識(shí)別的啟動(dòng)子的序列第四十六頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日第三節(jié)真核生物RNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)RNATranscriptionpromotioninEukaryots第四十七頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

一、真核生物的RNApol

1、三種RNApol：

根據(jù)對(duì)

α-鵝膏蕈堿的敏感性不同而分類

RNApolⅠ最不敏感（動(dòng)、植、昆）

RNApolⅡ最敏感

RNApolⅢ不同種類的敏感性不同

2、位置和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物

RNApolⅠ核仁活性所占比例最大

轉(zhuǎn)錄rRNA（5.8S、18S、28S）第四十八頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日RNApolⅡ核質(zhì)主要負(fù)責(zé)hnRNA、snRNA的轉(zhuǎn)錄

hnRNA（mRNA前體，核不均一RNAheterogeneousnuclearRNA）

snRNA（核內(nèi)小分子RNAsmallnulearRNA)RNApolⅢ核質(zhì)負(fù)責(zé)tRNA、5SrRNA、Alu序列和部分snRNA

?

目前在線粒體和葉綠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)少數(shù)RNApol（活性較低）第四十九頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日3、亞基組成：分子量500KDa,含兩個(gè)大亞基和7~12個(gè)小亞基

RNApolⅡ：

?大亞基中有C末端結(jié)構(gòu)域

(carboxyterminaldomainCTD)?CTD中含一保守氨基酸序列的多個(gè)重復(fù)

Tyr－Ser－Pro－Thr－Ser－Pro－SerC端重復(fù)七肽

?不同生物中重復(fù)數(shù)目不一樣（酶活性）第五十頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日?CTD中的Ser和Thr可被高度磷酸化

磷酸化的RNApolⅡ被稱為ⅡA

非磷酸化的RNApolⅡ稱為ⅡB?CTD參與轉(zhuǎn)錄

→

ⅡB→ⅡA

→

使RNApol易于離開啟動(dòng)子進(jìn)入延伸過程（10倍）

二、真核生物的啟動(dòng)子

三種RNApol→三種轉(zhuǎn)錄方式三種啟動(dòng)子→三類基因，Ⅰ類Ⅱ類Ⅲ類第五十一頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

1、RNApolⅡ的啟動(dòng)子

?結(jié)構(gòu)最復(fù)雜

?位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游,有多個(gè)短序列元件組成

?通用型啟動(dòng)子（無組織特異性）（1）帽子位點(diǎn)（capsite）：轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)

與Prok.的“CAT模式”相似

（2）TATA框（Hogness框或Goldberg-Hogness框）

?

位于－30處

?一致序列為T82A97T93A85A63（T37）A83A50（T37）第五十二頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日?定位轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的功能（類似原核的Pribnow框）

?TATA是絕大多數(shù)真核基因的正確表達(dá)所必需的（3）CAAT框（CAATbox）

?位于－75bp處?一致序列為GGC/TCAATCT?前兩個(gè)G

的作用十分重要(轉(zhuǎn)錄效率)?增強(qiáng)啟動(dòng)子的效率、頻率，不影響啟動(dòng)子的特異性（距轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的距離，正反方向）

第五十三頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

（4）增強(qiáng)子（enhancer）（又稱遠(yuǎn)上游序列farupstreamsequence）

?在－100以上

?SV40的兩個(gè)正向重復(fù)研究得最清楚（DR）

-107~178、－179~－250各72bp

第五十四頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日遠(yuǎn)距離效應(yīng)無方向性順式調(diào)節(jié)無物種和基因特異性具有組織特異性有相位性（構(gòu)象）可對(duì)外部信號(hào)產(chǎn)生反應(yīng)增強(qiáng)子的特點(diǎn)第五十五頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

（5）GC框（GCbox）

?位于－90附近，較常見的成分

?核心序列為GGGCGG?可有多個(gè)拷貝，也可以正反兩方向排列第五十六頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日（6）其他元件

?八聚核苷酸元件（octamerelementOCT元件）一致序列為ATTTGCAT?KB元件一致序列為GGGACTTTCC?ATF元件一致序列為GTGACGT?還有一些位于起始點(diǎn)下游的相關(guān)元件（7）不同元件的組合情況不同元件的數(shù)目、位置、和排列方向均有差異

例如：SV40的早期啟動(dòng)子中有6個(gè)GC框第五十七頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日小結(jié)：★不同啟動(dòng)子中每種元件與轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的距離不同★不同啟動(dòng)子中的相應(yīng)元件互相交換,形成的雜交啟動(dòng)子功能沒有變化★各種元件將相應(yīng)的蛋白因子結(jié)合到啟動(dòng)子上，組成起始復(fù)合物，蛋白因子間的相互作用決定了轉(zhuǎn)錄的起始第五十八頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

2、RNApolⅢ啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)

（1）分為三類，每種識(shí)別方式不同

a、下游啟動(dòng)子（內(nèi)部啟動(dòng)子）位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的下游

5SRNA和tRNA基因

b、上游啟動(dòng)子

snRNA第五十九頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日（2）內(nèi)部啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)

最早發(fā)現(xiàn)于非洲爪蟾的5SrRNA基因

試驗(yàn)設(shè)置：

★非洲爪蟾的卵母細(xì)胞提取液作為體外轉(zhuǎn)錄體系，進(jìn)行缺失試驗(yàn)★以不同長(zhǎng)度的5SrRNA基因?yàn)槟０暹M(jìn)行轉(zhuǎn)錄

結(jié)果：

★缺失＋55以前和缺失＋80以后的序列都能正常轉(zhuǎn)錄★缺失＋55到＋80序列不能轉(zhuǎn)錄第六十頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

結(jié)論：

★5SrRNA基因的啟動(dòng)子位于基因內(nèi)部★該啟動(dòng)子可使RNApolⅢ在其上游的55bp處起始轉(zhuǎn)錄（3）內(nèi)部啟動(dòng)子分為兩類均含兩個(gè)短序列元件，中間由其他序列隔開

第一類：含A框和C框（5SrRNA基因）第二類：含A框和B框（tRNA基因、VARNA基因）間隔序列長(zhǎng)短差異很大

?其中內(nèi)部啟動(dòng)子起被RNApolⅢ識(shí)別的作用第六十一頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日第六十二頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日第六十三頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

三、真核生物轉(zhuǎn)錄的起始?三種RNApol均沒有對(duì)啟動(dòng)子特異序列的識(shí)別能力?轉(zhuǎn)錄起始過程需要很多的輔助因子(轉(zhuǎn)錄因子)參與,

并且按一定順序與DNA形成復(fù)合物,協(xié)助RNApol定位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)第六十四頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日RNApolⅠTBP因子第六十五頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日RNApolⅡ第六十六頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日第六十七頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

★RNApolⅢ的轉(zhuǎn)錄起始◎兩種內(nèi)部啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始需要三種輔助因子

TFⅢA一種含鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白

TFⅢB由TBP和BRT、B”TFⅢC至少5個(gè)亞基以上第六十八頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日第六十九頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

?TBP的作用★所有RNApolⅢ的轉(zhuǎn)錄起始都需要TBP★在RNApolⅠ的轉(zhuǎn)錄起始過程中,TBP是SL1的組份，起定位RNApolⅠ的作用

★

RNApolⅡ的轉(zhuǎn)錄起始由TBP識(shí)別TATA框

?TBP起定位作用,所以又稱定位因子（positioningfactor）第七十頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日第七十一頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日第四節(jié)轉(zhuǎn)錄延伸TranscriptionElongation第七十二頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

一、起始到延伸的轉(zhuǎn)變

★始于第一個(gè)磷酸二酯鍵的形成★伴隨著DNA分子和酶分子構(gòu)象的變化

1、Prok.

?起始時(shí)，

σ因子有利于β

和β’亞基具有與DNA專一性結(jié)合所要求的構(gòu)象

?起始后,σ因子解離,β

和β’亞基構(gòu)象發(fā)生變化

2、Euk.

?多種輔助因子的共同作用來保證這一轉(zhuǎn)變第七十三頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

二、延伸過程（Prok）

★酶與產(chǎn)物RNA不解離

★底物NTP不斷加到RNA鏈的3’-OH端★形成一個(gè)磷酸二酯鍵后，核心酶向前滑動(dòng)★延伸位點(diǎn)不斷地接受新的NTP，RNA鏈不斷延伸

?始終保持三元復(fù)合物的結(jié)構(gòu)第七十四頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日第七十五頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

1、轉(zhuǎn)錄泡★RNApol結(jié)合和轉(zhuǎn)錄的DNA模板區(qū)域，有17bp左右

DNA形成解鏈區(qū)★轉(zhuǎn)錄泡處雜交雙鏈很短

?胰臟RNAase______其長(zhǎng)度10bp（不準(zhǔn)確）

?推測(cè)也就兩個(gè)核苷酸左右第七十六頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日2、拓?fù)鋵W(xué)問題

Φ

RNA合成過程中，轉(zhuǎn)錄泡兩端要發(fā)生拓?fù)滢D(zhuǎn)變

?RNApol的前沿…..解螺旋作用

?RNApol后端…..DNA的螺旋化（保持…………）

Φ

超纏問題的解決靠DNA旋轉(zhuǎn)酶

Φ

RNA-DNA雜交鏈也要求作旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)第七十七頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日旋轉(zhuǎn)酶第七十八頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

第五節(jié)轉(zhuǎn)錄的終止Transcriptiontermination

第七十九頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日☆終止過程：酶停止添加底物→→釋放RNA鏈→→酶解離終止反應(yīng)…雜合雙鏈的氫鍵斷裂，

…重新形成雙螺旋，酶的解離?！罱K止子（terminator）：在轉(zhuǎn)錄的過程中，提供轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的DNA序列真正起終止作用的是RNA序列－－－與啟動(dòng)子不同☆Prok.和Euk.都具有－－－－一種基因表達(dá)調(diào)控的手段第八十頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

一、原核生物的終止子

1、終止子的種類（1）內(nèi)在終止子（不依賴

ρ因子的終止子）體外實(shí)驗(yàn)中，只有核心酶和終止子就足以使轉(zhuǎn)錄終止（2）依賴ρ因子的終止子蛋白質(zhì)輔助因子－－ρ因子存在時(shí)，核心酶終止轉(zhuǎn)錄

兩者有共同的結(jié)構(gòu)特征（序列差異）第八十一頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日2、不依賴

ρ因子的終止子結(jié)構(gòu)特征:?一是形成一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)莖….7~20bp的IR序列形成（富含G/C）環(huán)….中間不重復(fù)序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的突變可阻止轉(zhuǎn)錄的終止?二是6~8個(gè)連續(xù)的U串（發(fā)夾結(jié)構(gòu)末端）第八十二頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日不依賴ρ終止子結(jié)構(gòu)IRIR莖部富含GC第八十三頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日3、依賴ρ因子的終止子（1）結(jié)構(gòu)

IR序列中的G／C對(duì)含量較少發(fā)夾結(jié)構(gòu)末端沒有固定特征（2）靠與ρ的共同作用而實(shí)現(xiàn)終止

第八十四頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日無連續(xù)U串G/C含量較少第八十五頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

二、原核生物轉(zhuǎn)錄的終止

1、不依賴ρ因子的終止子終止轉(zhuǎn)錄（1）新生RNA鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成

與RNApol發(fā)生作用

造成高度延宕（典型的有60秒左右）

（2）RNApol暫停為終止提供了機(jī)會(huì)，6~8個(gè)連續(xù)的U

串可能為RNApol與模板的解離提供了信號(hào)

RNA－DNA之間的rU－dA結(jié)合力較弱

阻止RNA鏈的釋放第八十六頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

于是：RNA－DNA解離三元復(fù)合體解體

RNApol解離轉(zhuǎn)錄終止（3）真正的終止點(diǎn)不固定，在U串中的任何一處（4）IR序列和U串同等重要

IR中的G／C對(duì)含量的減少

U串的縮短或缺失（5）DNA上與U串對(duì)應(yīng)的為富含A／T的區(qū)域說明：AT富含區(qū)在轉(zhuǎn)錄的終止和起始中均起重要的作用第八十七頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

2、依賴ρ因子的終止子終止轉(zhuǎn)錄（1）通讀（readthrough）：在依賴ρ

因子的轉(zhuǎn)錄終止過程中，RNApol轉(zhuǎn)錄了IR序列之后，雖發(fā)生一定時(shí)間的延宕，但如果沒有ρ

因子存在，則

RNApol會(huì)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄（2）ρ因子活性形式為六聚體促進(jìn)轉(zhuǎn)錄終止的活性，NTPase活性第八十八頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

ρ因子識(shí)別和結(jié)合的是RNA（3）ρ因子對(duì)終止子的作用

a、ρ因子與RNA結(jié)合（終止子上游的某一處，RNA的5’端）b、ρ因子沿RNA從5’→3’移動(dòng)（NTP水解供能）（終止子處的較長(zhǎng)時(shí)間的延宕給ρ因子追趕的機(jī)會(huì)）c、ρ因子與RNApol相互作用而造成轉(zhuǎn)錄的終止第八十九頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日ρ結(jié)合上來追趕RNApolρ追趕上來（暫停）

ρ與RNApol相互作用使雜交鏈解鏈終止子第九十頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

（4）終止反應(yīng)還需要RNA與DNA的相互作用即：需要一定的RNA序列因?yàn)椋浩渑c模板的結(jié)合力必須弱到一定數(shù)值，才能配合

ρ因子與RNApol的作用（發(fā)夾結(jié)構(gòu)下游的AU序列）序列不同的終止子→→不同的終止程度→→基因表達(dá)調(diào)控的途徑之一第九十一頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日三、終止與抗終止及抗終止因子?各種生物采用不同的手段控制不同發(fā)育階段的基因表達(dá)

*

枯草桿菌------更替σ因子*T7噬菌體------更換RNApol*λ噬菌體采用依賴于ρ因子的終止以及通過抗終止因子的抗終止作用第九十二頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日?抗終止的機(jī)制依賴于噬菌體本身的依賴ρ因子的終止子依賴ρ因子的終止子上游有抗終止信號(hào)(靠近PL的nutL，靠近tR1的nutRnut—PNutilization)抗終止蛋白和nut位點(diǎn)的結(jié)合，等待RNApol經(jīng)過時(shí)修飾RNApol的構(gòu)象，拮抗寄主編碼的終止蛋白ρ的活性,使之通過那些依賴ρ的終止子第九十三頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日第九十四頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日第六節(jié)原核生物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工Pre-RNAprocessinginProkaryotes第九十五頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

Φ

Prok.的mRNA半衰期只有幾分鐘

（基因表達(dá)調(diào)控的一種手段）

Φ

rRNA、tRNA比較穩(wěn)定半衰期幾小時(shí)

成熟分子和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的差別：

?5’單磷酸／三磷酸

?

分子大小

?

異常堿基第九十六頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

一、rRNA后加工

1、基因排列方式

★三種rRNA基因（5S、16S、23S）與tRNA

的基因形成操縱元（rrn）（E.coli七個(gè)）

★每個(gè)rrn中tRNA基因無固定模式（種類、數(shù)量、位置）第九十七頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日★三個(gè)rRNA基因的相對(duì)位置有一定規(guī)律

…16SrDNA……間隔tDNA…….23SrDNA…….5SrDNA……收尾tDNA…加工過程主要是RNAseⅢ等酶的作用第九十八頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日雙鏈區(qū)域第九十九頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

二、tRNA的轉(zhuǎn)錄后加工

1、tRNA基因

轉(zhuǎn)錄單元大多是多基因的同一個(gè)tRNA基因、不同tRNA基因、與rRNA基因第一百頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日2、E.coli的tRNATyr1分子的修飾過程編碼基因的原始轉(zhuǎn)錄物三磷酸

有兩個(gè)基因拷貝間隔子（各長(zhǎng)350base）第一百零一頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日有一個(gè)tRNATyr1的轉(zhuǎn)錄單元的原始轉(zhuǎn)錄物的修飾過程①②③④⑤⑤⑤⑤第一百零二頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日三、RNA中的甲基化及常見的修飾核苷酸m5C

m6A

HNHHNHOO

HNHHN—CH3H3C★Prok.中主要是堿基的修飾

Euk.－－核糖、堿基第一百零三頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日第七節(jié)Euk轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工

Pre-RNAprocessinginEukaryotes

第一百零四頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日一、rRNA的轉(zhuǎn)錄后加工主體rRNA基因（5.8S、18S、28SrDNA）組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元47S前體45S前體

a、甲基化位點(diǎn)可能是酶識(shí)別的標(biāo)志

b、加工的對(duì)象是一種核蛋白

c、哺乳動(dòng)物的45SRNA前體有幾種不同的加工方式第一百零五頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日第一百零六頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日二、mRNA的轉(zhuǎn)錄后修飾－--------帽子

1、帽子的種類帽子0（Cap-0）m7GpppXpYp----------（共有）

m7GN7—甲基鳥苷帽子1（Cap-1）m7GpppXmpYp----------

第一個(gè)核苷酸的2’-O位上產(chǎn)生甲基化（AN6位甲基化）帽子2（Cap-2）m7GpppXmpYmp

第二個(gè)核苷酸的2’-O位上產(chǎn)生甲基化（A、G、C、U）第一百零七頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日HN—CH3m7G帽子0第一百零八頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日第一百零九頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日其中:

☆單細(xì)胞真核生物只有Cap—0☆Cap—1是其余真核生物的主要帽子形式☆Cap—2存在于某些真核生物中2、帽子結(jié)構(gòu)的生成

☆甲基供體都為S—腺苷甲硫氨酸（SAM）

☆RNA鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶-----戴帽酶（cappingenzyme）第一百一十頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日3、帽子結(jié)構(gòu)的功能

（1）對(duì)翻譯起識(shí)別作用------為核糖體識(shí)別RNA提供信號(hào)

Cap—0的全部都是識(shí)別的重要信號(hào)

Cap—1,2的甲基化能增進(jìn)識(shí)別

（2）增加mRNA的穩(wěn)定性，使5’端免遭外切核酸酶的攻擊

（3）與某些RNA病毒的正鏈合成有關(guān)（Cap—1、Cap—2）

除帽子結(jié)構(gòu)外的Euk.mRNA內(nèi)部甲基化－－－m6A形式第一百一十一頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日三、mRNA的轉(zhuǎn)錄后修飾二--------多聚（A）尾巴1、3’端-----約長(zhǎng)200bp(大多數(shù)Euk.的mRNA)

（poly(A)+poly(A)-

）

最近研究發(fā)現(xiàn)，原核生物的RNA轉(zhuǎn)錄后也有3’添加

poly(A)的現(xiàn)象

E.coli的poly(A)+聚合酶早在1962年就已發(fā)現(xiàn)2、

poly(A)的生成a.RNA末端腺苷酸轉(zhuǎn)移酶（poly(A)聚合酶）催化前體－－ATP第一百一十二頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日反應(yīng)如下：多聚核糖核酸+nATPMg++或Mn++

多聚核糖核酸(A)n+nPPib、添加位點(diǎn)內(nèi)切酶(360KDa)切除一段序列

由poly(A)聚合酶催化添加poly(A)內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)（有其它因子參與）

切點(diǎn)上游13－20bp處的AAUAAA

第一百一十三頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日3、poly(A)的功能c、對(duì)含poly(A)的mRNA失去poly(A)可減弱其翻譯

（1）可能與核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)

（2）與mRNA的壽命有關(guān)

（3）與翻譯有關(guān)

a、缺失可抑制體外翻譯的起始

b、胚胎發(fā)育中，poly(A)對(duì)其mRNA的翻譯有影響（非poly(A)化的為儲(chǔ)藏形式）第一百一十四頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日（4）poly(A)在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中有很大應(yīng)用價(jià)值a、也可將oligo(dT)與載體相連，從總體RNA中分離純化mRNAb、用寡聚dT（oligo(dT)）為引物，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一百一十五頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日真核與原核生物mRNA的特征比較原核生物mRNA的特征1、原核生物mRNA半衰期短2、原核生物mRNA大多以多順反子存在3、原核生物mRNA無帽子結(jié)構(gòu)，無或有較短polyA結(jié)構(gòu)真核生物mRNA的特征1、有帽子結(jié)構(gòu)2、絕大多數(shù)真核生物mRNA具有polyA尾巴第一百一十六頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

第八節(jié)Euk.轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中內(nèi)元的去除IntronremovinginEukaryote第一百一十七頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日一、概述

1、概念

割裂基因（splitgene）：指編碼某一RNA的基因中有些序列并不出現(xiàn)在成熟的RNA序列中，成熟RNA

的序列在基因中被其他的序列隔開

內(nèi)元（intron）：原初轉(zhuǎn)錄物中通過RNA拼接反應(yīng)而被去除的RNA序列或基因中與這些RNA序列相應(yīng)的

DNA序列

外元（excon）：第一百一十八頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日第一百一十九頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日RNA拼接（RNAsplicing）：一個(gè)基因的外元和內(nèi)元共同轉(zhuǎn)錄在一條轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，將內(nèi)元去除而把外元連接起來形成成熟RNA分子的過程

拼接點(diǎn)：

5’拼接點(diǎn)或左拼接點(diǎn)（內(nèi)元上游）

3’拼接點(diǎn)或右拼接點(diǎn)（……下游）第一百二十頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日2、內(nèi)元的分類

1982Davies等人

中部核心結(jié)構(gòu)（centralcorestructure）:在有些內(nèi)元中，含有4個(gè)重復(fù)的保守序列，長(zhǎng)度為

10~20bp，4個(gè)保守序列構(gòu)成一種二級(jí)結(jié)構(gòu)，在拼接中起重要作用

由于并非所有的內(nèi)元都有中部核心結(jié)構(gòu)，所以有了內(nèi)元的分類第一百二十一頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日★Ⅰ類內(nèi)元（groupⅠ）:含有中部核心結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器基因核基因★Ⅱ類內(nèi)元（groupⅡ）:不含有中部核心結(jié)構(gòu)細(xì)胞器線粒體基因內(nèi)核基因★Ⅲ類內(nèi)元（groupⅢ）:具有GU－AG特征的邊界序列核基因mRNA前體

第一百二十二頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日3、拼接方式

方式一：由拼接裝置完成（核mRNA內(nèi)元）可供識(shí)別的特異序列

拼接裝置由多種蛋白質(zhì)和核蛋白組成

方式二：自我拼接（兩類內(nèi)元Ⅰ

、Ⅱ

）

形成特定的二級(jí)結(jié)構(gòu)

RNA具有催化拼接的能力

第一百二十三頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

二、第Ⅰ類內(nèi)元的拼接

特點(diǎn)：

?拼接屬于自我拼接

?形成明顯的二級(jí)結(jié)構(gòu)

1、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：（1）5’

拼接點(diǎn)和3’

拼接點(diǎn)-------U↓……G↓

↓↓

5’……exon……U……intron……G……exon……3’

第一百二十四頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日（2）有由保守序列形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)

a、保守序列為

5’－P－Q－R－S－3’

距拼接點(diǎn)很遠(yuǎn)，各10~12bpP與Q互補(bǔ)、R與S互補(bǔ)而形成中部核心結(jié)構(gòu)第一百二十五頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日b、二級(jí)結(jié)構(gòu)中還包括內(nèi)元與外元的某一序列互補(bǔ)所形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)

內(nèi)部引導(dǎo)序列（interalguidesequenceIGS）：內(nèi)元中能與兩個(gè)拼接點(diǎn)邊界序列配對(duì)的一段序列

#第一類內(nèi)元的拼接依賴于以上二級(jí)結(jié)構(gòu)－－為自我拼接的進(jìn)行提供活性位點(diǎn)第一百二十六頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日2、拼接機(jī)制（以四膜蟲的大rRNA前體的拼接為例）（1）兩種rRNA轉(zhuǎn)錄在一條35S的產(chǎn)物中，26SrRNA

有內(nèi)元5’UG3’

小rRNA大rRNA（26S有內(nèi)元）

（2）35SRNA體外有自我拼接的能力反應(yīng)需要：一價(jià)和二價(jià)離子鳥苷酸輔助因子（GTPGDPGMP和鳥嘌呤核苷）不需能量的供給

（3）拼接反應(yīng)后，G與內(nèi)元（414base）5’端以磷酸二酯鍵相連（放射性標(biāo)記試驗(yàn)）第一百二十七頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日（4）具體的拼接過程第一步：游離G發(fā)動(dòng)的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)

G的3’-OH攻擊內(nèi)元的5’拼接點(diǎn)

G-內(nèi)元、左外元（有游離3’OH）

第一百二十八頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

第二步：游離外元（左）發(fā)動(dòng)的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)左外元的3’-OH攻擊3’拼接點(diǎn)，同時(shí)釋放線狀的內(nèi)元,形成成熟RNA分子第一百二十九頁，共一百四十六頁，2022年，8月28日

?

兩次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)是緊密偶聯(lián)的?釋放出的內(nèi)元可繼續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)酯反應(yīng)而形成環(huán)狀第一百三十頁，共一