第十二章DNA的生物合成

第十二章DNA的生物合成第一頁，共六十六頁，2022年，8月28日DNA是遺傳的主要物質基礎。生物有機體的遺傳特征以密碼的形式編碼在DNA上，表現(xiàn)為特定的核苷酸排列順序，通過DNA的復制和細胞分裂，將遺傳信息由親代傳遞給子代。第二頁，共六十六頁，2022年，8月28日在后代的個體發(fā)育過程中，遺傳信息自DNA轉錄給RNA，并指導蛋白質合成，以執(zhí)行各種生命功能，使后代表現(xiàn)出與親代相似的遺傳性狀。遺傳信息的傳遞方向，是從DNA到RNA再到蛋白質，即所謂的生物學“中心法則”。第三頁，共六十六頁，2022年，8月28日某些致癌RNA病毒的遺傳信息也可存在于RNA分子中，由RNA通過逆轉錄的方式將遺傳信息傳遞給DNA。本章的內容涉及DNA生物合成的三個方面，第一，DNA復制，第二，RNA反轉錄為DNA，第三，細胞內DNA受到損傷時進行的修復作用。第四頁，共六十六頁，2022年，8月28日第一節(jié)DNA的復制

DNA作為遺傳物質的基本特點就是在細胞分裂前進行準確地自我復制，使DNA的量成倍增加，這是細胞分裂的物質基礎。DNA雙螺旋結構模型指出，DNA是由二條互補的脫氧核苷酸鏈組成，所以DNA的復制是由原來存在的分子為模板來合成新的鏈。即半保留復制。第五頁，共六十六頁，2022年，8月28日雙螺旋DNA的復制第六頁，共六十六頁，2022年，8月28日第七頁，共六十六頁，2022年，8月28日一、DNA復制的方式及一般過程(一)DNA的半保留復制Watson和Crick在提出DNA雙螺旋結構模型時即推測，DNA在復制時首先兩條鏈之間的氫鍵斷裂兩條鏈分開，然后以每一條鏈分別做模板各自合成一條新的DNA鏈，這樣新合成的子代DNA分子中一條鏈來自親代DNA，另一條鏈是新合成的，這種復制方式為半保留復制。第八頁，共六十六頁，2022年，8月28日1958年Meselson和Stahl利用15N在大腸桿菌中首次證實了DNA的半保留復制，他們將大腸桿菌放在含有15N標記的NH4Cl培養(yǎng)基中繁殖了15代，使所有的大腸桿菌DNA被15N所標記。然后將細菌轉移到含有14N標記的NH4Cl培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)不同代數(shù)時，收集細菌，裂解細胞，用氯化銫密度梯度離心并觀察DNA所處的位置。由于15N標記DNA的密度比普通DNA(14N－DNA)的密度大，密度梯度離心時，兩種密度不同的DNA在試管中分布于不同的區(qū)帶。第九頁，共六十六頁，2022年，8月28日DNA的半保留復制第一代分子含有一條親代的鏈(用黑色素示)，與另一條新合成的鏈(用白色表示)配對。在以后的連續(xù)復制過程中，原來親代的兩條鏈仍然保持完整，因此總有兩個分子各具有一條原來親代的鏈。

Stahl實驗密度梯度離心后的DNA位置：左三管為對照；右三管為實驗結果第十頁，共六十六頁，2022年，8月28日(二)DNA復制的一般過程：

DNA雙螺旋是由兩條方向相反的單鏈組成，復制開始時，雙鏈打開，形成一個復制叉（從打開的起點向一個方向形成)，或一個復制泡(從打開的起點向兩個方向形成)。兩條單鏈分別做模板。各自合成一條新的DNA鏈。由于DNA一條鏈的走向是5′→3′方向，另一條鏈的走向是3′→5′方向，但生物體內DNA聚合酶只能催化DNA從5′→3′的方向合成。那么，兩條方向不同的鏈怎樣才能做模板呢?這個問題由日本學者崗崎先生解決。第十一頁，共六十六頁，2022年，8月28日在以3′→5′方向的母鏈為模板時，復制合成出一條5′→3′方向的前導鏈，前導鏈的前進方向與復制叉打開方向是一致的，因此前導鏈的合成是連續(xù)進行的；另一條母鏈DNA是5′→3′方向，它作為模板時，復制合成許多條5′→3′方向的短鏈，叫做隨后鏈，隨后鏈的前進方向是與復制叉的打開方向相反的。隨后鏈只能先以片段的形式合成，這些片段就叫做崗崎片段。第十二頁，共六十六頁，2022年，8月28日原核生物崗崎片段含有1000-2000核苷酸，真核生物一般100～00核苷酸。最后再將多個崗崎片段連接成一條完整的鏈。由于前導鏈的合成是連續(xù)進行的，而隨從鏈的合成是不連續(xù)進行的，所以從總體上看DNA的復制是半不連續(xù)復制第十三頁，共六十六頁，2022年，8月28日第十四頁，共六十六頁，2022年，8月28日第十五頁，共六十六頁，2022年，8月28日DNA復制的全部過程可以分成三個階段：第一個階段為DNA復制的起始階段，包括起始點，復制方向以及引發(fā)體的形成；第二階段為DNA鏈的延長，包括前導鏈及隨后鏈的形成和切除RNA引物后填補空缺及連接崗崎片段；第三階段為DNA復制的終止階段。在DNA復制的整個過程中需要30多種酶及蛋白質分子參加。第十六頁，共六十六頁，2022年，8月28日二、DNA復制的起始階段(一)DNA復制的起始點實驗證明：復制是從DNA分子上的特定部位開始的，該部位叫做復制起始點常用ori或o表示。DNA復制一經開始就會連續(xù)復制下去，直至完成細胞中全部基因組DNA的復制。DNA復制從起始點開始直到終點為止，每個這樣的DNA單位稱為復制子或復制單元。第十七頁，共六十六頁，2022年，8月28日在原核細胞中，每個DNA分子只有一個復制起始點，因而只有一個復制子，而在真核生物中，DNA的復制是從許多起始點同時開始的，所以每個DNA分子上有許多個復制子。DNA復制起始點有結構上的特殊性，例如：大腸桿菌染色體DNA復制起始點Oric由422個核苷酸組成，是一系列對稱排列的反向重復序列，即回文結構，其中有9個核苷酸或13個核苷酸組成的保守序列，這些部位是大腸桿菌中DnaA蛋白(解鏈蛋白)識別的位置。第十八頁，共六十六頁，2022年，8月28日

大腸桿菌染色體DNA是環(huán)狀雙鏈DNA，它的復制是典型的“θ”型復制(由于形狀像希臘字母θ)。從一個起點開始，同時向兩個方向進行復制，當兩個復制方向相遇時，復制就停止。而有些生物的DNA復制起始區(qū)是一段富含A·T的區(qū)段。這些特殊的結構對于在DNA復制起始過程中參與的酶和許多蛋白質分子的識別和結合都是必須的。第十九頁，共六十六頁，2022年，8月28日(二)DNA復制的方向：(1)定點開始雙向復制：這是原核生物和真核生物DNA復制最主要的形式，從一個特定位點解鏈，沿著兩個相反的方向各生長出兩條鏈，形成一個復制泡，用電子顯微鏡可以觀察到復制泡的存在。第二十頁，共六十六頁，2022年，8月28日第二十一頁，共六十六頁，2022年，8月28日復制泡生長的電鏡圖譜第二十二頁，共六十六頁，2022年，8月28日

(2)定點開始單向復制：質粒colE1是個典型的例子，復制從一個起始點開始，以同一方向生長出兩條鏈，形成一個復制叉。第二十三頁，共六十六頁，2022年，8月28日(3)兩點開始單向復制：腺病毒DNA的復制是從兩個起點開始的，形成兩個復制叉，各以一個單一方向復制出一條新鏈。第二十四頁，共六十六頁，2022年，8月28日DNA鏈生長方向的三種機制第二十五頁，共六十六頁，2022年，8月28日

(三)DNA復制起始引發(fā)體的形成及所參與的酶和蛋白質：

1.解鏈酶DNA開始復制時首先在起始點處解開雙鏈，反應是在一種解鏈酶的催化下進行的。解鏈酶需要ATP分解供給能量。大腸桿菌中DnaB蛋白就有解鏈酶活性，與隨后鏈的模板DNA結合，沿5′→3′方向移動，還有一種叫做Rep蛋白和前導鏈的模板DNA結合沿3′→5′方向移動。解鏈酶的作用就是打開DNA雙鏈之間的氫鍵。

第二十六頁，共六十六頁，2022年，8月28日2.單鏈結合蛋白(SSBP)它與解開的單鏈DNA結合，使其穩(wěn)定不會再度螺旋化并且避免核酸內切酶對單鏈DNA的水解，保證了單鏈DNA做為模板時的伸展狀態(tài)，SSBP可以重復利用。第二十七頁，共六十六頁，2022年，8月28日大腸桿菌DNA復制叉中復制過程簡圖

第二十八頁，共六十六頁，2022年，8月28日3.引發(fā)體的形成DNA復制起始的關健步驟是前導鏈DNA的合成，一旦前導鏈DNA的聚合作用開始，隨后鏈DNA的合成也隨著開始。由于前導鏈的合成是連續(xù)進行的，所以它的起始相對簡單，而隨后鏈的合成是不連續(xù)進行的，所以引發(fā)階段比較復雜。大腸桿菌的引發(fā)前體由DnaB.DnaC和單鏈結合蛋白組成。

第二十九頁，共六十六頁，2022年，8月28日(1)引物酶特殊的RNA聚合酶，催化短片段RNA的合成。這種短RNA一般由十幾個至數(shù)十個核苷酸組成，在DNA復制起始處做為引物。RNA引物的3’－ＯＨ末端提供了由DNA聚合酶催化形成DNA分子第一個磷酸二酯鍵的位置。

(2)引發(fā)體高度解鏈的模板DNA與多種蛋白質因子形成的引發(fā)前體促進引物酶結合上來，共同形成引發(fā)體。引發(fā)體主要在DNA隨后鏈上形成，連續(xù)地與引物酶結合并解離，從而在不同部位引導引物酶催化合成RNA引物。第三十頁，共六十六頁，2022年，8月28日

三、DNA復制的延長以及參與的酶和蛋白質分子DNA的復制實際上就是以DNA為模板在DNA聚合酶作用下，將游離的四種脫氧單核苷酸(簡寫為dNTP)聚合成DNA的過程。這是一個非常復雜的酶促反應，需要許多種酶和蛋白質參與，現(xiàn)分別敘述它們在DNA復制中作用。

第三十一頁，共六十六頁，2022年，8月28日(一)DNA的聚合反應和DNA聚合酶DNA聚合酶的作用

第三十二頁，共六十六頁，2022年，8月28日1957年，Arthurkornberg首次在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶Ⅰ，(DNapolymeraseⅠ,簡寫DNApolⅠ)后來又相繼發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶Ⅱ和DNA聚合酶Ⅲ(DNapolymeraseⅡ，Ⅲ，簡寫DNApolⅡ,DNApolⅢ)。實驗證明大腸桿菌中DNA復制的主要過程靠DNapolⅢ起作用，而DNApolⅠ和DNApolⅡ在DNA錯配的校正和修復中起作用。第三十三頁，共六十六頁，2022年，8月28日聚合酶的共同性質是：①需要DNA模板，因此這類酶又稱為依賴DNA的DNA聚合酶。②需要RNA或DNA做為引物，即DNA聚合酶不能從頭催化DNA的起始。③催化dNTP加到引物的3’-OH末端，因而DNA合成的方向是5′→3′。④三種DNA聚合酶都屬于多功能酶，它們在DNA復制和修復過程的不同階段發(fā)揮作用。由于DNA聚合酶Ⅰ是研究得最清楚而且代表了其他DNA聚合酶的基本特點，所以我們著重介紹DNapolⅠ的作用并指出另外二種DNApol的特殊性：第三十四頁，共六十六頁，2022年，8月28日

1.DNA聚合酶Ⅰ：DNApolⅠ是由一條多肽鏈組成，分子量為109KD。酶分子中含有一個Zn2+，是聚合活性必須的。大腸桿菌每個細胞中約有400個酶分子，每個酶分子每分鐘在37℃下能催化667個核苷酸參入到DNA鏈中，用枯草桿菌蛋白酶可將此酶水介成兩個片段，大片段分子量為76KD，通常稱為klenow片段，小片段為34KD。大小片段具有不同的酶活性。第三十五頁，共六十六頁，2022年，8月28日1956年由ArthurKornberg首先發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶，又稱Kornber酶。此酶研究得清楚而且代表了其他DNA聚合酶的基本特點。

第三十六頁，共六十六頁，2022年，8月28日DNAPolⅠ在空間上近似球體，直徑約65A。在酶的縱軸上有一個約20A的深溝，帶有正電荷，這是該酶的活性中心位置，在此位置上至少有6個結合位點:模板DNA結合位點;DNA生長鏈或引物結合位點;引物末端結合位點，用以專一引物或DNA生長鏈的3'-OH;脫氧核苷三磷酸結合位點;5'→3'外切酶活性位點，用以結合生長鏈前方的5'-端脫氧核苷酸并切除之;3'→5'外切酶活性位點，用以結合和切除生長鏈上未配對的3'-端核苷酸。第三十七頁，共六十六頁，2022年，8月28日

(1)DNA聚合酶的5′→3′聚合酶活性：這是DNA聚合酶最主要的活性，按模板DNA上的核苷酸順序，將互補的dNTP逐個加到引物RNA3’-OH末端，并促進3’-OH與dNTP的5’-OH形成磷酸二酯鍵，酶的專一性表現(xiàn)為新進入的dNTP必須與模板DNA堿基配對才有催化作用，5′→3′聚合酶活性存在于klenow片段上。第三十八頁，共六十六頁，2022年，8月28日第三十九頁，共六十六頁，2022年，8月28日第四十頁，共六十六頁，2022年，8月28日(2)DNA聚合酶的3′→5′外切核酸酶活性：這種酶活性的主要功能是從3′→5′方向識別并切除DNA生長鏈末端與模板DNA不配對而游離的核苷酸，這種功能稱為校對功能，這是保證其聚合作用的正確性不可缺少的，因此對于DNA復制中極高的保真性是至關重要的。第四十一頁，共六十六頁，2022年，8月28日第四十二頁，共六十六頁，2022年，8月28日(3)DNA聚合酶的5′→3′外切核酸酶活性：這種酶活性是從DNA鏈的5’-端向3’-末端水解已配對的核苷酸，本質是切斷磷酸二酯鍵，每次能切除10個核苷酸。因此，這種酶活性在DNA損傷的修復中可能起重要作用，對完成的DNA片段去除5’-端的RNA引物也是必須的。第四十三頁，共六十六頁，2022年，8月28日第四十四頁，共六十六頁，2022年，8月28日

DNApolⅠ的5′→3′聚合活性和5′→3′外切酶活性協(xié)同作用，可以使DNA一條鏈上的切口從5′→3′方向移動，這種反應叫做缺刻平移，利用此反應可在體外對DNA片段進行放射性磷(α-32PdNTP)的標記制成探針(probe)，進行核酸的分子雜交實驗，是現(xiàn)代分子生物學的一項重要技術。第四十五頁，共六十六頁，2022年，8月28日缺刻平移標記DNA探針許多實驗證實DNApolⅠ并不是DNA復制過程中的主要酶，它的作用主要與DNA損傷后的修復有關。第四十六頁，共六十六頁，2022年，8月28日

2.DNA聚合酶Ⅱ(DNApolⅡ)此酶分子量為120KD，每個細胞約有100個酶分子，但活性只有DNapolⅠ的5%，它具有5′→3′聚合酶活性和3′→5′外切酶活性，而沒有5′→3′外切酶活性，它的作用可能與DNA損傷修復有關。第四十七頁，共六十六頁，2022年，8月28日3.DNA聚合酶Ⅲ(DNApolⅢ)DNA聚合酶Ⅲ催化先導鏈和隨后鏈的合成第四十八頁，共六十六頁，2022年，8月28日真核生物DNA復制叉結構示意圖

第四十九頁，共六十六頁，2022年，8月28日該酶在DNA復制過程中起主要作用，是一個多亞基組成的蛋白質分子，其分子量＞600kDa，酶分子形成一個不對稱的二聚體。每個大腸桿菌細胞中只有10?0個酶分子，但催化dNTP參入DNA鏈的速率卻是最快的，約為9000核苷酸/酶.min。在染色體DNA進行復制時，DNA聚合酶Ⅲ全酶并不是單獨起作用的，而是與引發(fā)體，解鏈酶等構成一個復制體。由于復制體的存在，先導鏈和隨后鏈可以同時復制。隨后鏈的模板DNA在DNA聚合酶Ⅲ全酶上繞轉了180°而形成一個圈，因此崗崎片段的合成方向能夠與先導鏈的合成方向以及復制體移動方向保持一致。第五十頁，共六十六頁，2022年，8月28日隨著DNApolⅢ向前移動，先導鏈的合成逐漸延長的同時，崗崎片段也在不斷延長，圈也在不斷擴大。當崗崎片段合成到前一個片段的5’-端時，這一大圈就釋放出來，由于復制叉向前移動又將另一部分隨后鏈的模板置換出來，由引發(fā)體合成新的引物，然后再形成一個小的圈，進行新的崗崎片段的合成。由此可知：隨后鏈的合成需要周期性的引發(fā)，因此其合成進度總是與前導鏈相差一個崗崎片段的長度。第五十一頁，共六十六頁，2022年，8月28日崗崎片段完成后，其5’-端的RNA引物由DNapolⅠ的5′→3′外切酶活性切除，由此造成的空隙再由DNApolⅠ的5′→3′聚合活性催化dNTP得到填補。所以DNA的復制是在DNapolⅢ和DNApolⅠ互相配合下完成的。第五十二頁，共六十六頁，2022年，8月28日

DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ分子量109KD120KD＞600KD每個細胞中的分子數(shù)40017-10010-205′→3′聚合活性+++37℃轉化率核苷酸數(shù)／酶分子·分鐘6003030,0005′→3′外切活性+--5′→3′外切活性+++切刻平移活性+--對dNTP親和力低低高功能修復不詳復制去除引物

填補空缺

真核生物DNA聚合酶特點第五十三頁，共六十六頁，2022年，8月28日真核細胞在DNA復制中起主要作用的是DNApolα，主要負責染色體DNA的復制。DNapolβ的模板特異性是具有缺口的DNA分子，被認為它與DNA修復有關。DNapolγ在線粒體DNA的復制中起作用。DNApolδ不但有5′→3′聚合活性，而且還具有3′→5′外切酶活性，據(jù)認為真核生物DNA復制是在DNapolα和DNApolδ協(xié)同作用下進行的，前導鏈的合成靠DNApolδ催化，并且還需要一種細胞周期調節(jié)因子(PCNA)參與。而隨后鏈的合成靠DNApolα和引發(fā)酶配合作用完成。第五十四頁，共六十六頁，2022年，8月28日(二)與超螺旋松馳有關的酶：

DNA復制從起始點開始向一個方向復制時，局部的DNA雙鏈必須打開，主要靠解鏈酶的作用，打開后的單鏈還需要單鏈結合蛋白與其結合，在復制叉向前移動時造成其前方DNA分子所產生的正超螺旋，必須由拓撲異構酶來解決。下面分別介紹它們的作用。第五十五頁，共六十六頁，2022年，8月28日拓撲異構酶是一類改變DNA拓撲性質的酶。在體外可催化DNA的各種拓撲異構化反應，而在生物體內它們參與DNA的復制與轉錄。在DNA復制時，復制叉行進的前方DNA分子部分產生有正超螺旋，拓撲酶可松馳超螺旋，有利于復制叉的前進及DNA的合成。DNA復制完成后，拓撲酶又可將DNA分子引入超螺旋，使DNA纏繞、折疊，壓縮以形成染色質。DNA拓撲異構酶有Ⅰ型和Ⅱ型，它們廣泛存在于原核生物及真核生物中。第五十六頁，共六十六頁，2022年，8月28日大腸桿菌和真核生物中的拓撲異構酶類型作用對超螺旋的作用Ⅰ型拓撲異構酶

大腸桿菌切開一股DNA鏈松馳負超螺旋真核生物切開一股DNA鏈松馳正，負超螺旋Ⅱ型拓撲異構酶

大腸桿菌切開二股DNA鏈構馳正超螺旋；依賴ATP引入負超螺旋，

解環(huán)連等真核生物切開二股DNA鏈松馳正超旋，依賴ATP但不能引入負超螺旋第五十七頁，共六十六頁，2022年，8月28日拓撲異構酶Ⅰ(TopoⅠ)的主要作用是將環(huán)狀雙鏈DNA的一條鏈切開一個口，切口處鏈的末端繞螺旋軸按照松馳超螺旋的方向轉動，然后再將切口封起來。這就使DNA復制叉移動時所引起的前方DNA正超螺旋得到緩解，利于DNA復制叉繼續(xù)向前打開。拓撲異構酶Ⅰ除上述作用外，對環(huán)狀單鏈DNA還有打結或解結作用，對環(huán)狀雙鏈DNA的環(huán)連或解連以及使環(huán)狀單鏈DNA形成環(huán)狀雙鏈DNA都有作用。第五十八頁，共六十六頁，2022年，8月28日拓撲酶Ⅰ及Ⅱ的作用特點(a)大腸桿菌拓撲酶Ⅰ催化的4種拓撲異構化作用(b)拓撲酶Ⅱ的作用

第五十九頁，共六十