第十三單元綜合性實驗

第十三單元綜合性實驗第一頁，共三十七頁，2022年，8月28日實驗一酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測傷寒O抗體方法的建立（綜合性實驗）第二頁，共三十七頁，2022年，8月28日實驗原理

檢測傷寒O抗體在傷寒菌感染的診斷中具有重要意義，采用肥達反應(yīng)可對抗體進行半定量檢測；若采用新一代的免疫檢測技術(shù)建立對傷寒O抗體準(zhǔn)確定量檢測的法，則可提高臨床診斷效果。以傷寒O抗原免疫動物，制備出抗傷寒O的抗體，將后者純化抗體與酶連接制備成酶標(biāo)抗體;以傷寒O抗原包被酶標(biāo)板，制備傷寒酶標(biāo)抗體為競爭抗體，以競爭法檢測傷寒抗體酶聯(lián)免疫檢技術(shù)。第三頁，共三十七頁，2022年，8月28日1.傷寒沙門菌菌體“O”抗原（免疫用）2.傷寒沙門菌可溶性菌體“O”抗原（包備用）3.飽和硫酸銨溶液4.酶標(biāo)用洗滌液5.酶標(biāo)用稀釋液6.酶標(biāo)用底物液7.酶標(biāo)用終止液(2mol/LH2SO4)8.傷寒“O”抗原包被酶標(biāo)板9.待檢血清標(biāo)本10.實驗室標(biāo)準(zhǔn)陽性血清11.ELISA讀數(shù)儀實驗材料

第四頁，共三十七頁，2022年，8月28日制備抗傷寒O抗體和O抗原抗體純化酶(HRP)標(biāo)記抗體競爭ELISA檢測傷寒O抗體條件的優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)曲線確定標(biāo)本檢測與結(jié)果判斷實驗流程

第五頁，共三十七頁，2022年，8月28日取傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（傷寒沙門菌O901）的典型光滑型菌落，密集劃線接種于普通瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24h，用無菌生理鹽水洗下菌苔，移入無菌的三角燒瓶中。充分振搖，置100℃水浴1h，殺菌及破壞H抗原。菌懸液離心，4000r/min，10min，棄上清。菌體再用無菌生理鹽水洗滌，棄上清。無活菌試驗合格后，用無菌生理鹽水稀釋成8~10億／ml，即成傷寒沙門菌“O”菌體抗原。實驗方法

傷寒沙門菌菌體“O”抗原（免疫用）

第六頁，共三十七頁，2022年，8月28日取傷寒沙門菌O901接種于普通瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24h，用無菌生理鹽水洗下菌苔，配成70~100億/ml菌懸液，隔水煮沸2h，離心，3500r/min，10min，取上清即傷寒沙門菌可溶性菌體“O”抗原。傷寒沙門菌可溶性菌體“O”抗原（包備用）日期第1天第2天第3天第4天第5天抗原劑量（ml）0.10.20.30.51.0途徑多點皮內(nèi)耳緣靜脈耳緣靜脈耳緣靜脈耳緣靜脈表1制備細菌免疫血清的免疫程序第七頁，共三十七頁，2022年，8月28日抗體制備

制備抗傷寒O抗體推薦快速免疫方案供參考采用（表1）：取已制備的傷寒沙門氏菌體O抗原（１０億／ml），免疫程序如下表。最后兩次注射劑量較大，要緩慢推注。在末次免疫2天后試血，采用直接凝集法測定效價（見第二單元）。如凝集效價大于1∶1280，則可于一周后放血。效價過低，可再加強注射。日期第1天第2天第3天第4天第5天抗原劑量（ml）0.10.20.30.51.0途徑多點皮內(nèi)耳緣靜脈耳緣靜脈耳緣靜脈耳緣靜脈表1制備細菌免疫血清的免疫程序第八頁，共三十七頁，2022年，8月28日

1份免疫血清加1份生理鹽水，邊攪拌邊滴加2份飽和硫酸銨溶液，于4℃靜置2h，2000r/min離心20min，吸棄上清，將沉淀溶于適量生理鹽水（盡量保持高蛋白濃度），放置透析袋中，多次更換生理鹽水(透析液)，得初步純化的免疫抗體。采用改良NaIO4標(biāo)記法將酶與抗體的連接，其他備選的標(biāo)記方法請參考單元一?？贵w的純化與酶標(biāo)記

第九頁，共三十七頁，2022年，8月28日取5mgHRP溶于0.5ml雙餾水中，加入新配制的0.06MNaIO4水溶液0.5ml，混勻，4℃30min；再加入0.16M乙二醇水溶液（10mlH2O+0.09ml乙二醇）0.5ml，室溫放置30min。然后加入含5mg純化抗體的水溶液1ml，混勻，并裝入透析袋，于0.05MpH9.5碳酸鹽緩沖液中攪拌透析6h（或過夜），使之結(jié)合；加入NaBH4溶液（5mg/ml）0.2ml，混勻，4℃2h；最后緩慢加入等體積的飽和硫酸銨溶液，混勻，4℃30min，離心，去上清，以0.02MpH7.4PBS液溶解沉淀并4℃透析除鹽過夜；次日取出離心，去除沉淀，即得酶-抗體（HRP-IgG）結(jié)合物，以0.02MpH7.4PBS液加至5ml。改良NaIO4標(biāo)記法將酶第十頁，共三十七頁，2022年，8月28日①將酶標(biāo)抗體用稀釋液做系列稀釋，加入包被有傷寒抗原的酶標(biāo)板中（50μl/孔），37℃30min。②洗滌液充分洗滌3次，甩干。③各孔內(nèi)加底物液0.1ml，置暗處20min。④各孔內(nèi)加入終止液終止反應(yīng)。⑤用酶標(biāo)儀檢測OD值。以O(shè)D值在0.８左右的最小稀釋倍數(shù)為待檢樣本的最佳稀釋倍數(shù)。抗競爭法酶標(biāo)抗體工作濃度的確定第十一頁，共三十七頁，2022年，8月28日①從5倍開始用酶標(biāo)稀釋液進行系列倍比稀釋（連續(xù)稀釋10個管），與確定工作濃度的酶標(biāo)抗體一同加入包被有傷寒抗原的酶標(biāo)板中，另在2孔中加入稀釋液作空白對照，置37℃恒溫箱30min。②取出用洗滌液充分洗滌3次，甩干。③各孔內(nèi)加底物液0.1ml，置暗處20min。④各孔內(nèi)加入終止液終止反應(yīng)。⑤用酶標(biāo)儀檢測OD值?？瞻讓φ誒D值在0.8左右實驗成立，以標(biāo)本OD值在0.8～0.05的稀釋度（抗體單位）作為標(biāo)準(zhǔn)品的工作范圍，根據(jù)對標(biāo)準(zhǔn)抗體血清所測得的OD值，在方格紙上以O(shè)D值為x軸，抗體單位為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

第十二頁，共三十七頁，2022年，8月28日按預(yù)試驗摸索的實驗條件進行測定：①將標(biāo)準(zhǔn)血清進行系列倍比稀釋（連續(xù)稀釋10個管）。②將待檢血清用酶標(biāo)稀釋液適當(dāng)稀釋。③稀釋液作空白對照。④將稀釋的酶標(biāo)抗體（50μl/孔），同待檢標(biāo)本、不同單位的標(biāo)準(zhǔn)血清和空白對照標(biāo)本一同加入包被有傷寒抗原的酶標(biāo)板中（50μl/孔）。⑤置37℃恒溫箱30min。⑥加底物，終止反應(yīng)后檢測OD值。標(biāo)本檢測第十三頁，共三十七頁，2022年，8月28日

陽性標(biāo)本反應(yīng)孔不顯色，空白標(biāo)本反應(yīng)孔顯色說明實驗成立。根據(jù)對標(biāo)準(zhǔn)抗體血清所測得的OD值和其所對應(yīng)的抗體單位標(biāo)繪制準(zhǔn)曲線或建立的回歸方程，根據(jù)繪制的準(zhǔn)曲線求出每個標(biāo)本的抗體單位。結(jié)果判定

第十四頁，共三十七頁，2022年，8月28日

1.請就方法學(xué)評價肥達反應(yīng)和競爭ELISA法檢測傷寒“O抗體”。例如，方法的穩(wěn)定性、特異性和敏感性。

2.人類與傷寒沙門菌接觸密切，通常情況下傷寒抗體均陽性。個體傷寒O抗體水平與傷寒感染和機體免疫狀態(tài)有關(guān)，因此建立群體傷寒O抗體水平的正常范圍對判定個體傷寒的感染和機體免疫狀態(tài)具有重要價值。如何建立新方法檢測傷寒O抗體的參考范圍（正常值）?實驗討論

吉林醫(yī)藥學(xué)院李妍第十五頁，共三十七頁，2022年，8月28日實驗二機體免疫功能評估

（綜合性實驗）第十六頁，共三十七頁，2022年，8月28日無胸腺的裸鼠是T細胞選擇性缺陷的天然動物模型第十七頁，共三十七頁，2022年，8月28日人的重癥聯(lián)合型免疫缺陷綜合征第十八頁，共三十七頁，2022年，8月28日實驗原理

利用淋巴細胞敏感的細胞毒藥物抑制或殺傷淋巴細胞，使機體免疫功能低下。給實驗動物（小鼠）注射抗原，通過觀察小鼠機體免疫抗體的反應(yīng)水平評價機體的體液免疫水平。二硝基氟苯（DNFB）是一種半抗原，將其溶液涂抹腹壁皮膚后，與皮膚蛋白結(jié)合成完全抗原，刺激T淋巴細胞增殖成致敏淋巴細胞。4～7天后將其再次涂抹，可使局部產(chǎn)生遲發(fā)型超敏反應(yīng)（水腫），通過觀察遲發(fā)型超敏反應(yīng)程度對小鼠機體的細胞免疫功能做出評價。.雞卵卵核蛋白抗原是天然的可溶性抗原，注入機體可誘導(dǎo)特異抗體產(chǎn)生，當(dāng)免疫細胞受到抑制，B細胞活化和抗體產(chǎn)生能力下降，檢測特異性抗體產(chǎn)生可評價體液免疫功能。第十九頁，共三十七頁，2022年，8月28日實驗材料

1.免疫抑制劑環(huán)磷酰胺，氫化可的松。2.免疫抗原1%的二硝基氟苯（DNEB），雞卵卵核蛋白。3.酶標(biāo)用洗滌液，稀釋液，底物液，酶標(biāo)用終止液（2mol/LH2SO4）。4.抗原包被的酶標(biāo)板用包被液將免疫用抗原稀釋20倍加到酶標(biāo)板中，每孔0.1ml，置濕盒中4℃過夜；次日取出，用蒸餾水充分洗滌3次，甩干備用。5.酶標(biāo)儀6.酶標(biāo)抗小鼠IgG抗體。7.抗體標(biāo)準(zhǔn)品多支小鼠抗雞卵卵核蛋白抗體的混合物。8.1ml注射器，采血用手術(shù)器械，分離血清用器材，天平，繪圖紙等。第二十頁，共三十七頁，2022年，8月28日基礎(chǔ)免疫實驗分組對照組抗原激發(fā)造模組遲發(fā)型超敏反應(yīng)（二硝基氟苯）特異性抗體的誘發(fā)（雞卵卵核蛋白）抗體效價測定皮膚超敏反應(yīng)觀察空白組實驗流程

非免疫動物第二十一頁，共三十七頁，2022年，8月28日1.二硝基氟苯致敏:將小鼠腹部去毛，范圍約3×3cm2大小，并將１％DNFB溶液均勻涂抹于上。2.可溶抗原致敏:取小鼠于大腿內(nèi)側(cè)注射卵核抗原0.2ml/只?？乖?/p>

實驗方法

基礎(chǔ)免疫

第二十二頁，共三十七頁，2022年，8月28日將做過基礎(chǔ)免疫的小鼠隨機分成兩組（造模組和實驗對照組）；另取數(shù)量相等的未經(jīng)免疫的小鼠為空白對照組。造模組小鼠可采用以下方法之一誘導(dǎo)免疫抑制,也2方法均用,進行對比。方法一:每鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺50mg/kg（參考劑量），連續(xù)5天后免疫功能顯著降低。方法二：每鼠每天腹腔注射氫化可的松50mg/kg（參考劑量），5天后免疫功能顯著受抑。實驗動物分組與免疫模型建立

第二十三頁，共三十七頁，2022年，8月28日致敏后第7天，將１％DNFB溶液10μl均勻涂抹于小鼠右耳（兩面）進行攻擊，空白對照組同樣涂耳但未致敏。攻擊后24h，剪下左右耳殼，取同樣大小的耳片，稱重。遲發(fā)型超敏反應(yīng)激發(fā)(細胞免疫功能檢測)

特異性抗體的誘發(fā)(體液免疫功能檢測)

基礎(chǔ)免疫后第7天再次注射抗原，方法同基礎(chǔ)免疫。5-7天后采血測抗體。在優(yōu)化間接法檢測小鼠抗卵核抗原的條件的基礎(chǔ)上;采ELISA檢測實驗組和空白組小鼠特異抗體的濃度。第二十四頁，共三十七頁，2022年，8月28日優(yōu)化間接法檢測小鼠抗卵核抗原的條件①將待檢血清從5倍開始用酶標(biāo)稀釋液進行系列倍比稀釋（連續(xù)稀釋10個管），分別加入已用抗原包被好的酶標(biāo)板中（每孔加0.1ml），置37℃恒溫箱30min。②取出用洗滌液充分洗滌3次，甩干。③各孔加酶標(biāo)抗體0.1ml，置37℃恒溫箱30min。④取出用洗滌液充分洗滌3次，甩干。⑤各孔內(nèi)加底物液0.1ml，置暗處20min。⑥各孔內(nèi)加入終止液終止反應(yīng)。⑦用酶標(biāo)儀檢測OD值。以O(shè)D值在0.30左右的最小稀釋倍數(shù)為待檢樣本最佳稀釋倍數(shù)。第二十五頁，共三十七頁，2022年，8月28日①將待檢血清按預(yù)實驗確定的稀釋倍數(shù)用酶標(biāo)稀釋液進行稀釋，分別加入已用抗原包被好的酶標(biāo)板中（每孔加0.1ml）。②將標(biāo)準(zhǔn)血清進行系列倍比稀釋（連續(xù)稀釋10個管），分別加入已用抗原包被好的酶標(biāo)板中（每孔加0.1ml）。③另在2孔中加入稀釋液作空白對照。④置37℃恒溫箱30min。⑤洗滌，加酶標(biāo)抗體，加底物，終止反應(yīng)和檢測OD值。優(yōu)化間接法檢測小鼠抗卵核抗體第二十六頁，共三十七頁，2022年，8月28日1.細胞免疫功能的判定以剪下的左右耳片重量之差為遲發(fā)型超敏反應(yīng)程度，可以反映機體細胞免疫水平。模型組免疫功能下降，遲發(fā)型超敏反應(yīng)強度下降。結(jié)果判斷

第二十七頁，共三十七頁，2022年，8月28日2.體液免疫根據(jù)對標(biāo)準(zhǔn)抗體血清所測得的OD值（標(biāo)準(zhǔn)血清及待檢血清OD值在計算時均應(yīng)減去空白對照OD值），在方格紙上以O(shè)D值為x軸，抗體單位為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；或采用數(shù)學(xué)模型進行線性轉(zhuǎn)化，建立回歸方程。根據(jù)標(biāo)繪制的準(zhǔn)曲線或建立的回歸方程，可以求出每個標(biāo)本的抗體單位。模型組免疫功能下降，特異抗體產(chǎn)生下降。第二十八頁，共三十七頁，2022年，8月28日實驗討論

1.舉例說明人體在哪些情況下發(fā)生免疫缺陷。

2.針對本實驗建立的模型，你還能想到哪些方法或指標(biāo)來評價免疫功能？第二十九頁，共三十七頁，2022年，8月28日實驗三免疫相關(guān)疾病的實驗診斷

（科研設(shè)計）第三十頁，共三十七頁，2022年，8月28日免疫學(xué)檢驗的與臨床疾病對自身免疫性疾病的診斷對免疫增生性疾病的診斷對感染性疾病的診斷對機體免疫狀態(tài)進行綜合評價腫瘤標(biāo)志物對腫瘤進行早期診斷或病情監(jiān)測第三十一頁，共三十七頁，2022年，8月28日主要課程討論安排

第一階段:重點是與臨床醫(yī)師和患者本人接觸，或通過查閱有關(guān)書籍和互聯(lián)網(wǎng)增加對疾病和疾病的診斷過程的感性認識;第二階段:有針對性地、系統(tǒng)地收集有關(guān)臨床實驗診斷數(shù)據(jù)和資料，作為分析和討論的基礎(chǔ)；第三階段:對實驗數(shù)據(jù)和資料進行總結(jié)分析并提出有關(guān)設(shè)想或新的實驗診斷方案；第四階段:回到臨床與臨床醫(yī)師或指導(dǎo)教師共同探討有關(guān)診斷的做出方案的合理性并形成文字材料，召開有專家參加的討論會或報告會。第三十二頁，共三十七頁，2022年，8月28日免疫學(xué)診斷的核心內(nèi)容是利用實驗的方法獲得人體的免疫信息對疾病作出診斷。其研究內(nèi)容包括實驗系統(tǒng)研發(fā)；實驗指標(biāo)檢測效果評價和實驗指標(biāo)信息解釋等。課程選題來源于課程的學(xué)習(xí)，收集的臨床資料和在實踐中的感性認識。選題

可采取主動探索的討論方式，綜合運用所掌握的免疫學(xué)檢測方法解決臨床疑難問題，對選擇的病例進行思考和提問，包括：（1）上述病例是否是典型病例，還需與哪些疾病相鑒別？（2）上述病例是否可以通過臨床表現(xiàn)做出診斷和鑒別診斷？單從臨床表現(xiàn)做出的診斷還有哪些不足？（3）實驗診斷在診治上述病例中的作用（早期診斷、確定診斷、鑒別診斷、觀察病情等方面）。（4）對機體的免疫系統(tǒng)狀態(tài)進行評估的指標(biāo)是否妥當(dāng)，結(jié)論是否正確。（5）建議臨床醫(yī)生應(yīng)進一