紫外分光光度計測蛋白濃度

紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量一、實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量的原理。掌握紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量的實驗技術(shù)。3?掌握TU-1901紫外可見分光光度計的使用方法并了解此儀器的主要構(gòu)造。二、實驗原理紫外-可見分光光度法，是以溶液中物質(zhì)的分子或離子對紫外和可見光譜區(qū)輻射能的選擇性吸收為基礎(chǔ)而建立起來的一類分析方法。紫外光：10-400nm可見光：400-780nm(可被人們的眼睛所感覺)特點：帶光譜、分子光譜應(yīng)用：定性分析最大吸收波長;定量分析：朗伯-比爾定律(標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法)a?定性分析原理：吸收曲線：吸收峰的數(shù)目、位置、相對強度以及吸收峰的形狀b?定量分析原理：根據(jù)朗伯-比耳定律：A=ebc，當(dāng)入射光波長A及光程b一定時，在一定濃度范圍內(nèi)，有色物質(zhì)的吸光度A與該物質(zhì)的濃度c成正比。定量分析常用的方法是標(biāo)準(zhǔn)曲線法即只要繪出以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度c為橫坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測出試液的吸光度，就可以由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得對應(yīng)的濃度值，即未知樣的含量。c.儀器組成部件:各種類型的紫外可見分光光度計，如下圖所示，從總體上來說是由五個部分組成，即光源、單色器、吸收池、檢測器和信號顯示記錄裝置。本實驗采用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量的實驗原理：蛋白質(zhì)可作定量分析的原因：蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，所以蛋白質(zhì)溶液在275--280nm具有一個吸收紫外吸收高峰。在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液在最大吸收波長處的吸光度與其濃度成正比，服從朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。該法測定蛋白質(zhì)的濃度范圍為0.1—1.0mg/mL。此種方法測量的準(zhǔn)確度差一點的原因：由于不同蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸的含量不同，所處的微環(huán)境也不同，所以不同蛋白質(zhì)溶液在280nm的光吸收職也不同。據(jù)初步統(tǒng)計，濃度為1.0mg/mL的1800種蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)亞基在280nm的吸光度在0.3—3.0之間，平均值為1.25+/-0.51。所以此種方法測量的準(zhǔn)確度差一點。有嘌呤、嘧啶等核酸類干擾時的經(jīng)驗公式：若樣品中含有嘌呤、嘧啶等核酸類吸收紫外光的物質(zhì)，在280nm處來測量蛋白質(zhì)含量時，會有較大的干擾。核酸在260nm處的光吸收比280nm更強，但蛋白質(zhì)卻恰恰相反，因此可利用280nm及260nm的吸收差來計算蛋白質(zhì)的含量。常用下列經(jīng)驗公式計算：蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)=1.45A280-0.74A260(A280和A260分別為蛋白質(zhì)溶液在280nm和260nm處測得的吸光度值)還可以通過下述經(jīng)驗公式直接計算出溶液中的蛋白質(zhì)的含量：蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)=F*A280*D*l/d其中A280為蛋白質(zhì)溶液在280nm處測得的吸光度值；d為石英比色皿的厚度(cm);D為溶液的稀釋倍數(shù);F為校正因子稀溶液中蛋白質(zhì)濃度測定的經(jīng)驗公式：蛋白質(zhì)的肽鍵在200—250nm有強的紫外吸收。其光吸收強度在一定范圍與濃度成正比，其波長越短，光吸收越強。若選用215nm可干擾及光散射，用215nm和225nm光吸收差值與單一波長測定相比，可減少非蛋白質(zhì)成分引起的誤差，因此，對稀溶液中蛋白質(zhì)濃度測定，可選用215nm和225nm光吸收差法。常用下列經(jīng)驗公式：蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)=0.144(A215-A225)(A215和A225分別為蛋白質(zhì)溶液在215nm和225nm處測得的吸光度值三、儀器與試劑儀器：TU-1901紫外-可見分光光度計，比色管(10ml的5個)，吸量管。試劑：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：5.00mg/mL溶液、0.9%NaCI溶液，待測蛋白質(zhì)溶液(牛血清白蛋白)。四、實驗步驟1.基本操作啟動計算機(jī)，打開主機(jī)電源開關(guān)，啟動工作站并初始化儀器,預(yù)熱半小時。用吸量管分別吸取0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL5.00mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液于5只10mL比色管中，用0.9%NaCl溶液稀釋至刻度，搖勻。用1cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液為參比(參比溶液不可取出).（3）在工作界面上選擇測量項目為光譜掃描，設(shè)置掃描參數(shù)（起點：400nm，終點：250nm，速度：中，間隔：1.0nm，單次掃描）（4）將兩個均裝有0.9%NaCI溶液的1cm石英比色皿放入測量池中，進(jìn)行基線掃描，然后選定量測定，校零，在調(diào)回光譜掃描。吸收曲線的制作:（找出最大吸收波長）將放在前面的比色皿中溶液換為0.3mg/mL的蛋白質(zhì)溶液，點擊START進(jìn)行掃描，得到如下吸收曲線，從曲線中我們可以看出此標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的最大吸收波長為278nm，此波長下的吸光度為0.1984。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：在工作界面上選擇測量項目為光度測量設(shè)置測量條件（測量波長：278.00nm）。用1cm石英比色皿，以0.9%NaCI溶液為參比，在278nm處分別測定以上所配標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度A278，記錄如下：以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：樣品測定：配制三份待測蛋白質(zhì)溶液，（取待測蛋白質(zhì)溶液2.0mL分別于3只10mL比色管中，用0.9%NaCI溶液稀釋至刻度）按上述方法測定278nm處的吸光度。得吸光度依次為0.3906，0.3765，0.