預習放免方法設計

預習放免方法設計Page1第一頁，共四十八頁，2022年，8月28日前言原理第二頁，共四十八頁，2022年，8月28日前言

放射免疫方法的建立原則

根據(jù)分析目的和要求，通過對標記物、抗體、標準品（校準品）的合理匹配，以及對反應條件、分離方法的選擇，達到最滿意的效果第三頁，共四十八頁，2022年，8月28日前言

放射免疫設計的目標

根據(jù)要求使試劑的劑量反應曲線在滿足靈敏度的情況下，是多數(shù)樣品得到較高的精密度。第四頁，共四十八頁，2022年，8月28日目錄靈敏度的設計反應條件的選擇反應方式的選擇分離方法的選擇方法學鑒定第五頁，共四十八頁，2022年，8月28日靈敏度的設計第六頁，共四十八頁，2022年，8月28日靈敏度的設計放射免疫分析的靈敏度Sensitivity指能測出的具有統(tǒng)計學意義的最小值，通常指“0”標準管結(jié)合率減兩個標準差的相應劑量。第七頁，共四十八頁，2022年，8月28日靈敏度的設計放射免疫分析的靈敏度Sensitivity若以能測出的具有一定精密度的最小值為靈敏度的定義，則應根據(jù)劑量反應曲線的精密度圖（PDP），以CV%-10%的最小劑量為有效地可測量的最小劑量，即靈敏度。第八頁，共四十八頁，2022年，8月28日靈敏度的設計放射免疫分析的靈敏度Sensitivity影響因素標記物的比活性抗體的親和力和用量劑量反應曲線濃度范圍第九頁，共四十八頁，2022年，8月28日標記物的用量標記物的用量∝計數(shù)率計數(shù)誤差靈敏度統(tǒng)計漲落樣品保持一定的計數(shù)率①減少樣品化學量②適當比活性、穩(wěn)定的標記物第十頁，共四十八頁，2022年，8月28日標記物的用量最佳標記抗原的選擇方法用不同濃度的標記抗原作一系列的抗血清實驗，直到標記物減少不再使曲線再右移，此時標記物濃度稱“減弱濃度”，即為加入標記抗原化學量的最低濃度。第十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日抗血清的用量放射免疫分析抗血清的鑒定指標高親和力高滴度高特異性選用親和常數(shù)大，滴度高的抗血清第十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日抗血清的用量確定抗血清用量的方法第十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日抗血清的用量確定抗血清用量的方法抗血清滴度曲線

B/T01020304050607080結(jié)合率為30%-50%的抗血清稀釋度

第十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日抗血清的用量確定抗血清用量的方法做兩條抗體稀釋度曲線A.單純標記抗原B.標記抗原中加入微量非標記抗原

兩條曲線分離度最大時抗體稀釋度，即為最佳稀釋度?？紤]了標記抗原與抗原免疫活性是否一致第十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日劑量反應曲線劑量反應曲線的濃度范圍可影響反應曲線的斜率根據(jù)實驗體系的要求以及稀釋曲線確定第十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日劑量反應曲線劑量反應曲線的濃度范圍可影響反應曲線的斜率根據(jù)實驗體系的要求以及稀釋曲線確定最低標準品的濃度應與標記物的用量接近，B/B0=80-90%最大濃度劑量點的結(jié)合率為10-20%待測物的正常濃度范圍應在劑量反應曲線的直線部分第十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日劑量反應曲線劑量反應曲線的濃度范圍第十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日劑量反應曲線劑量反應曲線的工作范圍工作范圍由PDP圖確定工作范圍與劑量反應曲線的濃度范圍是兩個不同的概念第十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日劑量反應曲線劑量反應曲線的工作范圍工作范圍確定方法：A.CV%<10%的劑量區(qū)段為有效工作范圍第二十頁，共四十八頁，2022年，8月28日劑量反應曲線劑量反應曲線的工作范圍工作范圍確定方法：結(jié)合率（B/B0%）在20-80%之間的區(qū)段為工作范圍

為劑量反應曲線接近直線的部分，待測物的正常范圍應在該區(qū)段以內(nèi)。

第二十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日反應試劑劑量關(guān)系第二十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日反應試劑劑量關(guān)系一般規(guī)律靈敏度增加工作范圍減小第二十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日反應試劑劑量關(guān)系一般規(guī)律靈敏度下降工作范圍較大第二十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日反應試劑劑量關(guān)系比較抗原濃度和抗體濃度的最佳匹配數(shù)學模型推倒

最適抗體濃度q=3/K

最適標記抗原濃度*Ag=4/K經(jīng)驗確定（常用于實際工作）

①通過一定量的標記抗原作抗體滴度試驗，確定抗血清稀釋度

②通過劑量反應曲線的制作進行逐步調(diào)整，最后達其最佳相互關(guān)系第二十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日標準品標準配的制備標準品介質(zhì)系統(tǒng)應與待測樣品一致或近似如，待測為血清樣本，最好用零值血清制備標準品若用緩沖液制備標準品，應加入一定量的蛋白質(zhì)（1-2%的BSA）或明膠第二十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日反應條件的選擇第二十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日反應條件的選擇緩沖體系添加劑反應體積溫育條件樣品處理第二十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日緩沖體系特異性結(jié)合反應的親和常數(shù)受反應介質(zhì)的pH和離子強度的影響第二十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日緩沖體系常見的緩沖體系磷酸鹽緩沖液（PBS）巴比妥緩沖液乙酸鹽緩沖液硼酸鹽緩沖液Tris-HCl緩沖液第三十頁，共四十八頁，2022年，8月28日添加劑目的：改善試劑的穩(wěn)定性/特殊需要要求：對特異性結(jié)合無影響常見添加劑EDTA-Na2ANSBSA/明膠抑肽酶疊氮鈉/硫柳汞第三十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日反應體積抗原抗體反應∝反應物濃度減小反應體積，利于提高反應濃度，提高實驗靈敏度體積過小，易出現(xiàn)加樣誤差，形成放射性復合物的量亦減少，測量誤差增加常規(guī)選用反應體積為：第三十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日溫育條件反應的平衡常數(shù)與溫度相關(guān)嚴格控制反應溫度，包括整個分析至離心過程測定指標不同，其對溫度的依賴程度亦不同溫度與反應速度相關(guān)提高反應溫度，可加速反應，但親和力下降4℃抗體親和力最大，但反應時間較長目前多采用較短時間37℃或室溫孵育第三十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日樣品處理

樣品中可能存在各種干擾物質(zhì)，或影響特異性反應的物質(zhì)。故許多分析系統(tǒng)需要對分析樣品進行預處理，常用的預處理方法是稀釋或提取。第三十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日反應方式的選擇第三十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日反應方式平衡法順序飽和法即時法第三十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日反應方式平衡法AbAgAg*加入分離劑Ag*AbAg*方法學評價

穩(wěn)定、重復性好、劑量反應曲線具有競爭性分析的典型特征，靈敏度相對較低

第三十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日反應方式順序飽和法(非平衡競爭體系)AbAg平衡Ag*AbAg*AgAg*Ab終止反應方法學評價

靈敏度較高，但因第二次孵育時間較短，要求標記抗原的比活性較高，并且要求分離方法更為精細。

因存在兩次溫育，曲線偏離典型特征，且反應穩(wěn)定性較差。

第三十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日反應方式即時法

在反應尚未達完全平衡時終止反應，并進行分離測定。

要求：需嚴格控制反應時間。

第三十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日分離方法的選擇第四十頁，共四十八頁，2022年，8月28日分離系統(tǒng)

分離系統(tǒng)應依據(jù)實驗要求選擇。其對放射免疫分析的結(jié)果影響較大，分離不全或錯分都可造成劑量反應曲線異常。

不同分離方法NSB差異較大，亦可影響反應的靈敏度，因此，選擇適宜的分離系統(tǒng)更是建立放射免疫系統(tǒng)的重要步驟之一。第四十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日分離系統(tǒng)常用的分離體系125I3H雙抗體-PEG/固相分離法活性炭吸附法第四十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日方法學鑒定第四十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日方法學鑒定劑量反應曲線穩(wěn)定性檢查靈敏度檢查精密度檢查健全性檢查正常參考范圍確定臨床有效性檢查第四十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日方法學鑒定劑量反應曲線穩(wěn)定性檢查NSB/TB0/T截距/斜率EDPDP圖第四十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日方法學鑒定劑量反應曲線穩(wěn)定性檢查靈敏度檢查精密度檢查健全性檢查正常參考范圍確定臨床有效性檢查第四十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日QCXSD12345678910L3.310.253.203.523.563.113.282.503.03.403.523.0M10.51.2511.710.611.511.110.39.6010.69.807.908.70H30.82.7