質(zhì)粒的小量制備

質(zhì)粒的小量制備1第一頁，共四十一頁，2022年，8月28日一、質(zhì)粒DNA的提取和鑒定實驗一、質(zhì)粒DNA的小量制備實驗二、質(zhì)粒DNA的電泳鑒定實驗三、質(zhì)粒DNA的酶切第二頁，共四十一頁，2022年，8月28日質(zhì)粒(plasmid)的基本概念：1）是生物細胞內(nèi)固有的、能獨立于染色體而自主復制、并被穩(wěn)定遺傳的核酸分子。2）存在于細菌、真菌、藍藻、酵母等細胞中。背景知識復習第三頁，共四十一頁，2022年，8月28日4）絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒具有共價、閉合、環(huán)狀的雙鏈結構(covalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)，以超螺旋形式存在。3）絕大多數(shù)質(zhì)粒是DNA型的，但酵母的“殺傷質(zhì)?！笔荝NA。5）分子大?。?-300kb。第四頁，共四十一頁，2022年，8月28日質(zhì)粒的基本特征：自主復制性不相容性可轉(zhuǎn)移性

攜帶特殊的遺傳標記第五頁，共四十一頁，2022年，8月28日嚴緊型質(zhì)粒松弛型質(zhì)粒

根據(jù)在每個細胞中的分子數(shù)(拷貝數(shù))多寡，質(zhì)粒可分為：

質(zhì)粒能利用寄主細胞的DNA復制系統(tǒng)，進行自主復制。自主復制性：第六頁，共四十一頁，2022年，8月28日

1-3拷貝/cell，復制受細胞核控制，伴隨染色體DNA復制而復制。如：pSC101、p15A。1）嚴緊型質(zhì)粒(stringentplasmid)：第七頁，共四十一頁，2022年，8月28日

加入氯霉素（終濃度10-170g/ml）抑制細菌蛋白質(zhì)合成后，可達3000拷貝/cell。2）松弛型質(zhì)粒(relaxedplasmid)：如：pMB1、ColE1。10-200拷貝/cell，復制不受細胞核控制，染色體DNA復制停止時，仍可進行復制。第八頁，共四十一頁，2022年，8月28日質(zhì)粒DNA的提取方法：氯化銫密度梯度離心法堿裂解法沸水浴法第九頁，共四十一頁，2022年，8月28日氯化銫密度梯度離心法：

質(zhì)粒純度高、周期長、設備要求高、溴乙錠污染；堿裂解法：

質(zhì)粒純度低、快速、操作簡便；沸水浴法：質(zhì)粒純度、操作周期介于氯化銫法和沸水浴法之間。第十頁，共四十一頁，2022年，8月28日

在強堿性溶液中，DNA雙鏈的氫鍵斷裂變性；當溶液恢復中性時，DNA雙鏈復性。原理：堿裂解法是最常用的質(zhì)粒DNA提取方法。第十一頁，共四十一頁，2022年，8月28日在變性后雙鏈不分離、復性快。閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA：12第十二頁，共四十一頁，2022年，8月28日強堿性

變性后雙鏈分離、難以復性而形成纏繞結構，與蛋白質(zhì)-SDS復合物結合在一起，離心時沉淀。染色體線性DNA、有缺口的質(zhì)粒DNA：13第十三頁，共四十一頁，2022年，8月28日本實驗的目的掌握質(zhì)粒DNA提取的堿裂解方法。14第十四頁，共四十一頁，2022年，8月28日實驗試劑1）LB培養(yǎng)基：10g/L胰蛋白胨5g/L酵母提取物10g/LNaCl用5NNaOH調(diào)pH至7.0，121℃高壓滅菌20min。15第十五頁，共四十一頁，2022年，8月28日用無菌H2O配置100mg/ml，-20℃保存；在LB中的終濃度為100g/ml。2）Amp貯存液：16第十六頁，共四十一頁，2022年，8月28日4）STE：10mmol/LTris-HCl（pH8.0）1mmol/LEDTA（pH8.0）0.1mol/LNaCl3）TE：10mmol/LTris-HCl（pH8.0）1mmol/LEDTA17第十七頁，共四十一頁，2022年，8月28日5）溶液I：50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris-HCl（pH8.0）10mmol/LEDTA（pH8.0）121℃高壓滅菌20min，4℃保存。18第十八頁，共四十一頁，2022年，8月28日6）溶液II：0.2mol/LNaOH1%SDS注意：配0.2mol/LNaOH時，臨用前用10mol/L貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋。19第十九頁，共四十一頁，2022年，8月28日7）溶液III：5mol/LNaAc60ml冰HAc11.5mlH2O28.5mlpH為4.8，4℃保存。20第二十頁，共四十一頁，2022年，8月28日8）25:24:1酚:氯仿:異戊醇9）氯仿10）無水乙醇11）70%乙醇21第二十一頁，共四十一頁，2022年，8月28日10）RNase：10mmol/LTris-HCl（pH7.5）15mmol/LNaCl10mg/mlRNase11）質(zhì)粒貯存液：含20g/mlRNase的TE或H2O22第二十二頁，共四十一頁，2022年，8月28日1）葡萄糖

增加溶液粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械力的作用而降解（震蕩）。各種試劑的作用：23第二十三頁，共四十一頁，2022年，8月28日2）EDTAMg2+、Ca2+螯合劑，抑制DNase活性，防止DNA被降解。24第二十四頁，共四十一頁，2022年，8月28日3）NaOH-SDS

NaOH是強堿，提供pH>12的堿性條件，使DNA雙鏈變性。

SDS是離子型表面活性劑，溶解細胞膜蛋白和細胞內(nèi)蛋白，并結合成“蛋白質(zhì)-SDS”復合物，使蛋白質(zhì)（包括DNase）變性沉淀。25第二十五頁，共四十一頁，2022年，8月28日4）NaAc-HAc緩沖液

用來中和NaOH變性液，使DNA復性。

高濃度的NaAc有利于變性的大分子（蛋白質(zhì)、DNA、RNA等）沉淀。第二十六頁，共四十一頁，2022年，8月28日用于沉淀DNA。5）乙醇DNA分子以水合狀態(tài)“溶于”水里，乙醇能奪去DNA分子的水環(huán)境。

一般使用2倍體積的無水乙醇。第二十七頁，共四十一頁，2022年，8月28日6）RNaseA

降解殘留的RNA，以免提取后的DNA中含有小分子RNA。28第二十八頁，共四十一頁，2022年，8月28日7）TE緩沖液：DNA保存液，由Tris-HCl和EDTA配制。

EDTA抑制DNase，防止DNA被酶降解。

Tris-HCl不含金屬離子（不同于磷酸緩沖液或硼酸緩沖液），利于以后操作。

29第二十九頁，共四十一頁，2022年，8月28日

但苯酚會殘留在DNA溶液中（現(xiàn)已少用，多用各種商品化的層析柱純化DNA)。8）酚-氯仿-異戊醇

蛋白變性劑，進一步抽提DNA溶液中的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀。第三十頁，共四十一頁，2022年，8月28日實驗步驟3）將細菌沉淀重懸于0.5mlSTE中，12000rpm離心1min，棄上清。1）將菌落接種于2ml含100g/ml的LB中，37℃振搖過夜。2）取1.5ml培養(yǎng)物于1.5mlEppendorf管中，于4℃離心12000rpm1min，棄上清。第三十一頁，共四十一頁，2022年，8月28日4）將細菌沉淀重懸于100l4℃預冷的溶液I中，蓋緊管口，vortex劇烈振蕩，使細菌沉淀完全分散，放置5-15min。5）加200l溶液II，蓋緊管口，快速顛倒Eppendorf管5次，使管整個內(nèi)表面均與溶液II接觸（不要振蕩），冰上放置5-10min。第三十二頁，共四十一頁，2022年，8月28日6）加入150l4℃預冷的溶液III，蓋緊管口，溫和振蕩10sec，冰上放置5min。7）4℃離心15000rpm5min，將上清轉(zhuǎn)移至另一EP管中。8）加入等量酚-氯仿-異戊醇，振蕩混勻，于4℃離心15000rpm2min，將上清轉(zhuǎn)移至另一EP管中。第三十三頁，共四十一頁，2022年，8月28日9）加入等量氯仿，振蕩混勻，于4℃離心15000rpm2min，將上清轉(zhuǎn)移至另一EP管中。10）加入2倍體積無水乙醇，振蕩混勻，室溫放置5min（或-70℃放置30min），4℃離心15000rpm10min，小心吸去上清，將附于管壁的液滴除盡。第三十四頁，共四十一頁，2022年，8月28日11）用4℃預冷的70%乙醇洗滌DNA沉淀1-2遍，按上述方法除盡上清，37℃干燥5-10min。12）用含RNase的TE或H2O溶解DNA，貯存于-20℃。第三十五頁，共四十一頁，2022年，8月28日

許多公司都研制出成套的商品化質(zhì)粒提取試劑盒，原理大都依照堿裂解法，但在純化步驟上采用柱層析，實驗步驟參考相應的Protocol。第三十六頁，共四十一頁，2022年，8月28日微量加樣器的使用方法3、將吸頭浸入待移取的液體液面下2-3mm處，慢慢松開按鈕，液體在大氣壓的作用下進入吸頭內(nèi)。待吸入要求量的液體后，將加樣槍撤離液面，擦去吸頭外側(cè)的液體，注意不能接觸吸頭尖部。1、將加樣槍刻度或讀數(shù)調(diào)至所需定量吸取的液體量值，并裝上合適的吸頭。2、將按鈕壓至第一停點位置（有明顯的阻滯感）并保持，以擠出吸頭內(nèi)空氣，形成吸頭內(nèi)負壓。37第三十七頁，共四十一頁，2022年，8月28日5、繼續(xù)按住按鈕，撤出加樣槍，將吸頭棄于特定的盛污染吸頭的器皿中，松開按鈕至起始位置，將加樣槍豎直懸掛在加樣槍架上。4、將加樣槍移至待加入液體的容器，讓吸頭位于容器液面的近上方。輕輕壓下按鈕至第一停點位置，讓液體緩緩流出。待液體將流盡時，繼續(xù)將按鈕下壓至第二停點位置，并讓吸頭尖部輕輕接觸液面上方的容器壁，以免產(chǎn)生氣泡。38第三十八頁，共四十一頁，2022年，8月28日第三十九頁，共四十一頁，2022年，8月28日2、要保證在整個吸液過程中，吸頭尖端要一直處于液面之下，即防止吸空造成吸樣不準確。1、加樣前，一定要檢