現(xiàn)代分子制藥工程

經(jīng)典的基因治療：指正常的基因整合入細胞基因組以校正或置換致病基因的一種治療方法。廣義的基因治療：將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，以達到治療疾病目的的方法?；蛑委煼诸?；體細胞(somaticcell)基因、治療生殖細胞(germline)基因治療基因治療步驟：ADA基因+逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導入患者淋巴細胞體外擴增回輸病人體內(nèi)淋巴細胞ADA酶恢復至正常水平的5%-10%維持免疫系統(tǒng)功能,改善病人癥狀基因治療的必要條件發(fā)病機制在DNA水平上已經(jīng)清楚；要轉(zhuǎn)移的基因已經(jīng)克隆分離，其表達產(chǎn)物有詳盡的了解；該基因正常表達的組織可在體外進行遺傳操作；一、基因治療的策略(四)自殺基因治療(三)基因干預(二)基因添加(一)基因置換基因治療途徑：1、間接體內(nèi)治療途徑2、直接體內(nèi)治療途徑基因轉(zhuǎn)移技術(shù)：1.病毒介導的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。2.非病毒介導的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。逆轉(zhuǎn)錄病毒整合入宿主DNA中的分子機制，其本質(zhì)是轉(zhuǎn)座逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的主要缺點隨機整合，有插入突變、激活癌基因的潛在危險；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的容量較小，只能容納7kb以下的外源基因。基因干預的種類反義RNA(antisenseRNA)干擾RNA(RNAinterference)核酶(ribozyme)延長半衰期常用方法聚乙二醇化白蛋白融合可溶性受體融合糖鏈化生物技術(shù)藥物重組蛋白多肽類單克隆抗體及其片斷寡核苷酸疫苗制劑基因治療藥物(核酸制劑)干細胞藥物蛋白肽類藥物藥代動力學吸收分布代謝與排泄蛋白肽類藥物特點及其應(yīng)用明顯的種族特異性：實驗動物的選擇；免疫原性：ELISA;反復給藥產(chǎn)生抗被測試藥物的抗體；體內(nèi)有大量的蛋白肽類物質(zhì)包括結(jié)合蛋白：生物樣品的前處理：LC-MS；被測試藥物尤其細胞因子給藥量極小(ng-pg/ml):檢測靈敏度；存在被測試藥物的內(nèi)源性物質(zhì)：本底效應(yīng)；同位素法suppressionviaphysiologicalregulationorfeedback,eg,infusingglucosetosuppressendogenousinsulin生物活性不僅取決于藥物的一級結(jié)構(gòu)，而且與其二級、三級結(jié)構(gòu)有關(guān)：生物檢定法；生物PD-PK模型蛋白肽類藥物樣品檢測方法免疫測定法酶聯(lián)免疫吸附測定法放射免疫測定法免疫放射定量法同位素標記示蹤法生物檢定法高效液相、液質(zhì)聯(lián)用法、毛細血管電泳(CE)、高效毛細血管電泳(HPCE)和毛細血管電泳色普(CEC)；ELISA法優(yōu)點高度的靈敏度:ng—pg/ml;較高的特異性；易于操作、快速、不使用同位素、無輻射源，適用于批處理;試劑使用壽命長；目前最常用的檢測方法。缺點待測蛋白多肽的免疫活性而非生物活性；不能區(qū)別具有抗原決定族的代謝物片斷；不能同時測定代謝物片斷；不同來源抗體結(jié)合性不一；受一些因素的干擾ELISA法一抗（種族特異性）抗原（待測藥物）二抗（酶偶聯(lián)）顯色酶底物酶標儀技術(shù)藥物分類重組DNA藥物重組蛋白質(zhì)藥物生物學活性測定方法分類1） 體外細胞培養(yǎng)測定法2） 離體動物器官測定法3） 體內(nèi)測定法4） 生化酶促反應(yīng)測定法5） 免疫學活性測定法樣品效價=對照品效價X樣品半效稀釋倍數(shù)/對照品半效稀釋倍數(shù)蛋白質(zhì)含量測定可根據(jù)物理化學性質(zhì)采用Folin-酚試劑法（Lowry法）、染色法（Bradford法）、雙縮脲法、紫外吸收法、HPLC法和凱氏定氮等方法。專屬性、準確性、精密性、直線性、測定范圍、測定限度、測量限度、特異性和耐用性不良反應(yīng)過度作用 副作用毒性反應(yīng) 首劑效應(yīng)繼發(fā)反應(yīng) 撤藥反應(yīng)藥物依賴性身體依賴性精神依賴性三致作用 致癌、致畸、致突變遺傳藥理學ADR藥物變態(tài)反應(yīng)（過敏反應(yīng)）基因芯片技術(shù)包括四個主要步驟：芯片制備、樣品制備、雜交反應(yīng)、信號檢測和結(jié)果分析。反義核酸技術(shù)是根據(jù)核酸雜交原理設(shè)計的，以選擇性地抑制特定基因表達為目的的一類核酸研究新技術(shù)包括反義RNA（asRNA）、反義DNA（asDNA）、核酶（Rz）

反義RNA的獲得途徑化學和成法：體外轉(zhuǎn)錄法：細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄法：核酶的分類?剪切型核酶：這類核酶催化自身或者異體RNA的切割，相當于核酸內(nèi)切酶?剪接型核酶：這類核酶具有核酸內(nèi)切酶和連接酶兩種活性-自休催化-自休催化異體雁化乾切型核普丁型肝炎病毒(HDV)核酶

I鏈艷霉線粒體(VS)核酶

根據(jù)催化反應(yīng)」 心asep剪接型核酶-I剪接型核酶-I型內(nèi)含于、II型內(nèi)含子基因工程技術(shù)特點基因體外重組不受生物種類的限制精確細致地控制轉(zhuǎn)基因技術(shù)原理及方法原理外源目的基因的制備，外源目的基因有效地導入生殖細胞或胚胎干細胞；選擇獲得攜有目的基因的細胞，選擇合適的體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動物；轉(zhuǎn)基因細胞胚胎發(fā)育及鑒定；篩選所得的轉(zhuǎn)基因動物品系。方法目的基因的制備和來源目的基因的克隆細胞轉(zhuǎn)染外源基因的方法轉(zhuǎn)染細胞的鑒定基因克隆的載體(3)粘粒載體(1)質(zhì)粒載體(4)人工染色體(2)病毒類載體轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)染方法生物學方法；病毒載體包括DNA病毒載體(腺病毒載體、牛痘病毒載體等)、反轉(zhuǎn)錄病毒載體等。DEAE-葡聚糖法磷酸鈣-DNA共沉淀法脂質(zhì)體載體包埋法電穿孔法微注射法裸露DNA直接注射法胚胎干細胞(embryonicstemcell，ES)是從早期胚胎內(nèi)細胞團(ICM)分離出來的，能在體外培養(yǎng)的一種高度未分化的多能細胞。轉(zhuǎn)基因動物鑒定技術(shù)分子雜交斑點雜交聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)原位雜交組成：離子源、質(zhì)量分析器、檢測器和真空系統(tǒng)。質(zhì)量分析器A、 磁式單聚焦分析器B、 磁式雙聚焦分析器C、 四極桿分析器D、 離子阱分析器E、 飛行時間分析器F、 傅立葉變換回旋共振分析器電子源A電子電離源化學電離源快原子轟擊源電噴霧源大氣壓化學電離源基質(zhì)輔助激光解吸電離源質(zhì)譜分類無機質(zhì)譜有機質(zhì)譜生物質(zhì)譜分子離子峰有如下特點：分子離子是奇電子離子分子離子正電荷的位置質(zhì)譜中，分子離子峰的強度和化合物的結(jié)構(gòu)關(guān)系極大，它取決于分子離子與其裂解后所產(chǎn)生離子的相對穩(wěn)定性。分子離子是分子失去一個電子所得到的離子，所以其數(shù)值等于化合物的相對分子量。斷裂方式：正電荷引發(fā)的斷裂、a斷裂、o斷裂、環(huán)烯的斷裂質(zhì)譜儀掃描方式有兩種：全掃描和選擇離子掃描。依靠質(zhì)譜就可以確定化合物的分子量、分子式和分子結(jié)構(gòu)?！鞍氘惲选薄ⅰ爱惲选?、“均裂”：在離子斷裂過程中，如果自由基離子的一個孤電子轉(zhuǎn)移到一個碎片上，這種斷裂叫“半異裂”；在離子斷裂過程中，如果一個鍵斷開時的一對電子同時轉(zhuǎn)移到同一