肺泡上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cell)的分離步驟

肺泡上皮細(xì)胞(alveolarepithelialcell)的分離步驟一、取得完全無(wú)血液殘留的肺臟：實(shí)驗(yàn)前j將大鼠全身血液放凈，取得完全無(wú)血液殘留的肺臟二、消化肺組織：常用于細(xì)胞消化的酶有胰蛋白酶、彈性蛋白酶、膠原酶。胰蛋白酶是最早用于消化、分離上皮細(xì)胞的酶，現(xiàn)在一般用損傷性小的彈性蛋白酶來(lái)替代胰蛋白酶。但這種酶卻有活性不穩(wěn)定，有效作用時(shí)間短暫，容易自我降解等問(wèn)題。DobbsLG等認(rèn)為彈性蛋白酶能更有選擇性的消化分離上皮細(xì)胞［9］。胰蛋白酶消化沒(méi)有選擇性，會(huì)帶來(lái)像內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞等一些不能在后面的分離步驟中去除的雜質(zhì)細(xì)胞，因此彈性蛋白酶更有助于提高上皮細(xì)胞的純度和產(chǎn)量。與此相反，CunninghamAC等發(fā)現(xiàn)，與彈性蛋白酶相比，用胰蛋白酶可以獲得更大產(chǎn)量的II型上皮細(xì)胞［10］。膠原酶可以用來(lái)輔助消化細(xì)胞間質(zhì)。用幾種酶混合的方法比單一酶消化效果更好，但目前還沒(méi)有文獻(xiàn)定量描述最優(yōu)化的酶消化方法。FinkelsteinJN等發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)支氣管把酶灌注到完整的肺中消化，或把肺組織剪碎放入消化液中消化。前者比后者更有效。作者在自己的實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)了通過(guò)支氣管把酶灌注到完整的肺中消化效果更好。三、分離純化細(xì)胞：上皮細(xì)胞的分離純化技術(shù)經(jīng)過(guò)二三十年的發(fā)展日漸成熟，呈現(xiàn)多樣化的特點(diǎn)。目前對(duì)細(xì)胞的分離純化主要有以下幾種方法。1、密度梯度離心：密度梯度離心分離細(xì)胞的原理是不同細(xì)胞的沉降系數(shù)不同，在密度梯度離心中細(xì)胞所處的位置也相應(yīng)不同。這是最早用于分離II型上皮細(xì)胞的方法，至今仍在使用。用ficoll或percoll不連續(xù)梯度離心，豬肺泡II型細(xì)胞最終純度可以達(dá)^U70%?85%左右［11-12］。沉降系數(shù)與細(xì)胞的直徑和天然密度有關(guān)。由于II型細(xì)胞與其他細(xì)胞存在密度和大小的交叉（如巨噬細(xì)胞），僅僅通過(guò)離心并不能有效去除雜細(xì)胞。Kikkawa（1974）讓巨噬細(xì)胞吞噬一些重顆粒（如硫酸鋇），改變其密度，可以幫助區(qū)分巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞。離心后的純度達(dá)到94%,但產(chǎn)量明顯減少［8］。上皮細(xì)胞的大小和密度變化范圍較大，用密度梯度離心要丟掉和其他細(xì)胞重疊的細(xì)胞層，這必然會(huì)造成某些密度大的II型細(xì)胞損失，產(chǎn)量大大降低。2、濾膜分離：濾膜分離的原理是根據(jù)細(xì)胞的大小不同來(lái)進(jìn)行分離。II型上皮細(xì)胞約10um，比巨噬細(xì)胞（約25um）和1型細(xì)胞（50umT00um）小，用150卩m孔徑的濾膜初濾除去大的組織碎片，30um-40um孔徑的濾膜除去全部II型細(xì)胞和部分巨噬細(xì)胞［13］，采用15um的濾膜精濾。用濾膜分離操作簡(jiǎn)單，它和其他分離方法聯(lián)合使用可以提高純度。3、流式細(xì)胞技術(shù)：流式細(xì)胞技術(shù)分離的原理是根據(jù)不同細(xì)胞之間的熒光差異。根據(jù)不同種細(xì)胞的特征識(shí)別，用熒光物質(zhì)標(biāo)記篩選。上皮細(xì)胞內(nèi)含有豐富的脂類物質(zhì)，用親脂性熒光素標(biāo)記，可以得到純度很高的細(xì)胞。FunkhouserJD等用抗II型上皮細(xì)胞的單抗進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，再用流式細(xì)胞儀進(jìn)行篩選，得到96%的II型上皮細(xì)胞［14］。但熒光素對(duì)被標(biāo)記細(xì)胞有害。RochatTR等發(fā)現(xiàn)自然熒光和直角光散射可以區(qū)分巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞，這給不經(jīng)熒光標(biāo)記分離上皮細(xì)胞提供了可能［15］。流式技術(shù)分離細(xì)胞的產(chǎn)量很低，但純度極高。這種技術(shù)經(jīng)過(guò)完善在將來(lái)會(huì)更有吸引力。4、免疫黏附：免疫黏附的原理是各種細(xì)胞的膜表面有不同的免疫活性物質(zhì)。巨噬細(xì)胞和其他大多數(shù)非II型細(xì)胞表面都有IgG上的Fc片段的受體。Uhal(1989)用IgG包被塑料板，把細(xì)胞懸液置于板上，巨噬細(xì)胞和其他大多數(shù)非II型細(xì)胞因?yàn)楹蠪c片段的受體而與IgG結(jié)合，吸附到板上，不黏附的II型細(xì)胞被沖洗下來(lái)［16］。經(jīng)過(guò)多年的摸索，這種方法近幾年已開(kāi)始應(yīng)用，簡(jiǎn)便易行，可除去絕大多數(shù)的巨噬細(xì)胞，有效的提高上皮細(xì)胞的純度。5、