2022甲狀旁腺腫瘤診斷中兩種lncRNA評分模型的構(gòu)建

2022甲狀旁腺腫瘤診斷中兩種IncRNA評分模型的構(gòu)建（全文）

摘要

目的

本課題組前期芯片研究發(fā)現(xiàn)，ENST00000538790.NR.125790等長鏈非

編碼RNA（lncRNA）在甲狀旁腺癌及甲狀旁腺腺瘤組織標本中的表達存在明

顯差異，本研究進一步探討ENST00000538790及NR」25790等IncRNA

及其構(gòu)建的IncRNA評分模型在甲狀旁腺癌中的診斷價值。

方法

收集57例甲狀旁腺功能亢進患者的新鮮組織標本，11例為甲狀旁腺

癌，46例為甲狀旁腺腺瘤，采用實時定量PCR（RT-qPCR）技術檢測

IncRNAENST00000511928.ENST00000538790.

ENST00000618339.NR.125790及ENST00000485384的表達差異,構(gòu)

建IncRNA評分模型，評估模型在甲狀旁腺癌診斷中的價值。

結(jié)果

相比甲狀旁腺腺瘤，ENST00000511928及ENST00000538790在甲狀

旁腺癌組中表達顯著升高（P<0.05）,ENST00000618339>NR.125790

及ENST00000485384表達明顯下降（&0.05）,其中ENST00000538790及

NR.125790為甲狀旁腺癌的獨立危險因素（PV0.05）。聯(lián)合

ENST00000538790及NR.125790構(gòu)建的IncRNA模型”log評分它

logistic決分”在甲狀旁腺癌中受試者工作特征曲線下面積分別為0.935

及0.943,且曲線下面積大于ENST00000538790與NRJL25790及血鈣等

傳統(tǒng)臨床診斷指標單獨診斷面積(戶V0.05)。

結(jié)論

以IncRNAENST00000538790及NR.125790構(gòu)建的IncRNA評分模型

有可能成為甲狀旁腺癌診斷的潛在輔助手段。

原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進癥(primaryhyperpara-thyroidism,簡稱原

發(fā)性甲旁亢)，是內(nèi)分泌系統(tǒng)常見疾病之一。原發(fā)性甲旁亢患者術后病理診

斷中甲狀旁腺腺瘤(parathyroidadenoma)最為常見(80%左右)，甲狀旁

腺癌(parathyroidcarcinoma)相對罕見(1%?5%)。],但甲狀旁腺癌對放

化療不敏感，易出現(xiàn)高鈣危象、術后復發(fā)，預后更差⑵。近期報道發(fā)現(xiàn)，甲

狀旁腺癌有逐年增加趨勢。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，甲狀旁腺癌占比達6.48%[3】。

通常，甲狀旁腺癌只有在復發(fā)、包膜浸潤、淋巴結(jié)或遠處轉(zhuǎn)移時才能被診

斷⑵。單純臨床及術后組織病理早期精準診斷甲狀旁腺癌極為困難，造成

漏診率、誤診率居高不下⑷。本課題組前期將甲狀旁腺癌及甲狀旁腺腺瘤

組織進行長鏈非編碼RNA(longnon-codingRNA,IncRNA)-信使

RNA(messengerRNA,mRNA)芯片掃描，篩選腫瘤通路相關的差異InRNA,

進行甲狀旁腺癌相關機制研究，但未進行標志物篩查【5】。因此，為尋求

更加高效的診斷標志物，本課題組重新分析芯片數(shù)據(jù)，選擇升高

(ENST00000511928.lnc-GLI3-4:1及ENST00000538790)以及降低

(ENST00000618339.NR.125790及ENST00000485384)中位居前3位的

IncRNA進行重新驗證比較，并構(gòu)建IncRNA評分，為尋找甲狀旁腺癌潛在

診斷標志物提供理論依據(jù)。

對象和方法

一、對象

本研究為病例對照研完共納入原發(fā)性甲旁亢患者57例，其中男性20例，

女性37例，平均年齡為(58.26±12.96)歲，術前血鈣為(2.86

±0.05)mmol/L甲狀旁腺激素(parathyroidhormone,PTH)為

(575.25±80.01)pg/mL。其中，甲狀旁腺癌患者11例,甲狀旁腺腺瘤患者

46例。所有患者的診斷由2名病理學專家完成。當患者出現(xiàn)局部浸潤、淋

巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移或復發(fā)時可診斷為甲狀旁腺癌。所有術中新鮮標本均

凍存于-80。(：冰箱。本研究通過北京世紀壇醫(yī)院倫理委員會審查，同時

患者已經(jīng)簽署知情同意書。

二方法1.IncRNA選擇為保障實時定量PCR(realtimequantitative

PCR,RT-qPCR)驗證的成功率，選擇高表達組中歸一化分析后信號值仍然

大于7且升高及下降倍數(shù)中居前3位的IncRNA。其中l(wèi)nc-GLI3-4:1的

序列與INHBA基因重合，驗證中不能區(qū)分兩者，故除去該指標。

2.RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄：與本課題組前期工作中描述的提取組織標本的總

RNA類似根據(jù)說明書操作步驟采用TRIzol試劑提取法(InvitrogenLife

Technologies，美國)[6]。提取出的總RNA使用Nanodrop

spectrophotometer(ThermoFisherScientific，美國)檢測

A260/A280比值以評估RNA質(zhì)量進一步通過Agilent2100Bioanalyzer

(AgilentTechnologies，美國)檢測RNA完整值(RNAintegrity

number,RIN)評估RNA的完整性。所有標本提取出RNA的RIN值大于

7.0。隨后使用ReverTraAceqPCRKit（T0Y0B0,FSQT01）試劑盒將RNA

逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄程序為37。（：維持15min后，98°C維持5min,

最后4o（：終止反應。

3.RT-qPCR:根據(jù)說明書的操作步驟，使用PowerSYBRGreenPCR

MasterMix（ABI,4368708）試劑在7900HTSequenceDetection

System（ABI,美國）系統(tǒng)中進行PCR反應。PCR引物設計見表L程序設

定為5CTC維持2min,95。＜：變性10min，隨后進行40個循環(huán)

（95°C維持15min,60°C維持1min）。每次實驗獨立重復3次，采

用ACt法分析IncRNA相對表達量。

表1引物序列設計

Tab1Sequencedesignforprimers

基因Gene上游引物Forwardprimer下游引物Reverseprimer

ENST000005119285-GCCTCGAATGCGTAGCTTTC-35-GCGnGGCAGAGGCAGn-3-

5<TGCAGGGTAC/XAGGCCAATAT-3

ENST000006183395JCATTTGTCATCTT(nTGTTGGATCA-3.

ENST00000618339y-CATHGICAICI1(1IGIIGGAICA-3'5-TGCAGGGTACAAGGCCAATAT-3

NR_12579()SACAAATC7TGAAGCCACAAATACAn'G-S,5-TCr?AAAGTGACGGATCTTTr-3

ENST(XXXMM853845-TTGGGACAAACCAAAGAATTGA-35-ATCCrTGGCTAGGTCTCTCATTTC-3

5-AAACCTnTCGCATACACTGATCA-3

CCND25-GGTGTCTGTTTGGTCAGGATGTT-3

BCL7A5-GCTGCGGCTACACATTCCA-35-CACAGCCnCCGGGTTGT-3

GAPDH5-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3-5-CACCCTGnGCrGTAGCCA/XA-3

注：CCND2:周期強白2CyclinD2;BCL7A:晦胞慢性淋巴綢胞性白血病/淋巴187AB,cellchroniclymphocyticIcukcmiiv'lymphoma7A

三、統(tǒng)計學處理定性資料采用數(shù)值或百分比表示，定量資料采用

Mean±SD表示，符合正態(tài)分布及方差齊性的2組資料比較使用t檢驗不

符合正態(tài)分布及方差齊性的樣本使用非參檢驗Mann-WhitneyU檢驗。x2

檢驗用于分析定性資料的差異及相關性，Spearman相關性檢驗用于分析

IncRNA與臨床指標的相關性，使用logistic回歸分析甲狀旁腺癌的危

險因素。"log評分”模型的建立參考本課題組前期發(fā)表文章中的模型，

根據(jù)以下公式計算得出：口0g評分”=(IncRNAENST00000538790-

RQ)X(1/NR_125790-RQ)o其中，RQ為IncRNA相對表達量(relative

quantity),BPIog2轉(zhuǎn)換后的IncRNA表達量[5]。此外，近期有學者通

過logistic回歸模型亦構(gòu)建出miRNA在甲狀旁腺癌中的診斷模型，故本

研究中亦通過logistic回歸模型構(gòu)建第二種IncRNA模型：“l(fā)ogistic

評分”艮Pln[P/(l-P)]=1.876-1.298

xACtENST00000538790+l.225xACtNR_125790o其中，|J為甲狀旁腺癌的

概率，Ct值為RT-qPCR檢驗中的檢測基因的循環(huán)閾值(cycle

threshold),ACt=CtlncRNA-CtGAPDH[7]e上述統(tǒng)計學分析均由

SPSS19.0(IBMCorp，美國)軟件完成圖片由Prism

v6.0(GraphPad,Inc)軟件繪制。受試者工作特征(receiveroperating

characteristic,ROC)曲線用于評估IncRNA的診斷效能，Z檢驗用于

ROC曲線下面積(areaundercurve,AUC)的比較，上述檢驗使用

MedCalc(MedCalcSoftware,Belgium)軟件完成。P<0.05為差異有統(tǒng)

計學意義。

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