2022甲狀旁腺腫瘤診斷中兩種lncRNA評(píng)分模型的構(gòu)建

2022甲狀旁腺腫瘤診斷中兩種IncRNA評(píng)分模型的構(gòu)建（全文）

摘要

目的

本課題組前期芯片研究發(fā)現(xiàn)，ENST00000538790.NR.125790等長(zhǎng)鏈非

編碼RNA（lncRNA）在甲狀旁腺癌及甲狀旁腺腺瘤組織標(biāo)本中的表達(dá)存在明

顯差異，本研究進(jìn)一步探討ENST00000538790及NR」25790等IncRNA

及其構(gòu)建的IncRNA評(píng)分模型在甲狀旁腺癌中的診斷價(jià)值。

方法

收集57例甲狀旁腺功能亢進(jìn)患者的新鮮組織標(biāo)本，11例為甲狀旁腺

癌，46例為甲狀旁腺腺瘤，采用實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)檢測(cè)

IncRNAENST00000511928.ENST00000538790.

ENST00000618339.NR.125790及ENST00000485384的表達(dá)差異,構(gòu)

建IncRNA評(píng)分模型，評(píng)估模型在甲狀旁腺癌診斷中的價(jià)值。

結(jié)果

相比甲狀旁腺腺瘤，ENST00000511928及ENST00000538790在甲狀

旁腺癌組中表達(dá)顯著升高（P<0.05）,ENST00000618339>NR.125790

及ENST00000485384表達(dá)明顯下降（&0.05）,其中ENST00000538790及

NR.125790為甲狀旁腺癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（PV0.05）。聯(lián)合

ENST00000538790及NR.125790構(gòu)建的IncRNA模型”log評(píng)分它

logistic決分”在甲狀旁腺癌中受試者工作特征曲線下面積分別為0.935

及0.943,且曲線下面積大于ENST00000538790與NRJL25790及血鈣等

傳統(tǒng)臨床診斷指標(biāo)單獨(dú)診斷面積(戶V0.05)。

結(jié)論

以IncRNAENST00000538790及NR.125790構(gòu)建的IncRNA評(píng)分模型

有可能成為甲狀旁腺癌診斷的潛在輔助手段。

原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥(primaryhyperpara-thyroidism,簡(jiǎn)稱原

發(fā)性甲旁亢)，是內(nèi)分泌系統(tǒng)常見疾病之一。原發(fā)性甲旁亢患者術(shù)后病理診

斷中甲狀旁腺腺瘤(parathyroidadenoma)最為常見(80%左右)，甲狀旁

腺癌(parathyroidcarcinoma)相對(duì)罕見(1%?5%)。],但甲狀旁腺癌對(duì)放

化療不敏感，易出現(xiàn)高鈣危象、術(shù)后復(fù)發(fā)，預(yù)后更差⑵。近期報(bào)道發(fā)現(xiàn)，甲

狀旁腺癌有逐年增加趨勢(shì)。國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，甲狀旁腺癌占比達(dá)6.48%[3】。

通常，甲狀旁腺癌只有在復(fù)發(fā)、包膜浸潤(rùn)、淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)才能被診

斷⑵。單純臨床及術(shù)后組織病理早期精準(zhǔn)診斷甲狀旁腺癌極為困難，造成

漏診率、誤診率居高不下⑷。本課題組前期將甲狀旁腺癌及甲狀旁腺腺瘤

組織進(jìn)行長(zhǎng)鏈非編碼RNA(longnon-codingRNA,IncRNA)-信使

RNA(messengerRNA,mRNA)芯片掃描，篩選腫瘤通路相關(guān)的差異InRNA,

進(jìn)行甲狀旁腺癌相關(guān)機(jī)制研究，但未進(jìn)行標(biāo)志物篩查【5】。因此，為尋求

更加高效的診斷標(biāo)志物，本課題組重新分析芯片數(shù)據(jù)，選擇升高

(ENST00000511928.lnc-GLI3-4:1及ENST00000538790)以及降低

(ENST00000618339.NR.125790及ENST00000485384)中位居前3位的

IncRNA進(jìn)行重新驗(yàn)證比較，并構(gòu)建IncRNA評(píng)分，為尋找甲狀旁腺癌潛在

診斷標(biāo)志物提供理論依據(jù)。

對(duì)象和方法

一、對(duì)象

本研究為病例對(duì)照研完共納入原發(fā)性甲旁亢患者57例，其中男性20例，

女性37例，平均年齡為(58.26±12.96)歲，術(shù)前血鈣為(2.86

±0.05)mmol/L甲狀旁腺激素(parathyroidhormone,PTH)為

(575.25±80.01)pg/mL。其中，甲狀旁腺癌患者11例,甲狀旁腺腺瘤患者

46例。所有患者的診斷由2名病理學(xué)專家完成。當(dāng)患者出現(xiàn)局部浸潤(rùn)、淋

巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)時(shí)可診斷為甲狀旁腺癌。所有術(shù)中新鮮標(biāo)本均

凍存于-80。(：冰箱。本研究通過(guò)北京世紀(jì)壇醫(yī)院倫理委員會(huì)審查，同時(shí)

患者已經(jīng)簽署知情同意書。

二方法1.IncRNA選擇為保障實(shí)時(shí)定量PCR(realtimequantitative

PCR,RT-qPCR)驗(yàn)證的成功率，選擇高表達(dá)組中歸一化分析后信號(hào)值仍然

大于7且升高及下降倍數(shù)中居前3位的IncRNA。其中l(wèi)nc-GLI3-4:1的

序列與INHBA基因重合，驗(yàn)證中不能區(qū)分兩者，故除去該指標(biāo)。

2.RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄：與本課題組前期工作中描述的提取組織標(biāo)本的總

RNA類似根據(jù)說(shuō)明書操作步驟采用TRIzol試劑提取法(InvitrogenLife

Technologies，美國(guó))[6]。提取出的總RNA使用Nanodrop

spectrophotometer(ThermoFisherScientific，美國(guó))檢測(cè)

A260/A280比值以評(píng)估RNA質(zhì)量進(jìn)一步通過(guò)Agilent2100Bioanalyzer

(AgilentTechnologies，美國(guó))檢測(cè)RNA完整值(RNAintegrity

number,RIN)評(píng)估RNA的完整性。所有標(biāo)本提取出RNA的RIN值大于

7.0。隨后使用ReverTraAceqPCRKit（T0Y0B0,FSQT01）試劑盒將RNA

逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄程序?yàn)?7。（：維持15min后，98°C維持5min,

最后4o（：終止反應(yīng)。

3.RT-qPCR:根據(jù)說(shuō)明書的操作步驟，使用PowerSYBRGreenPCR

MasterMix（ABI,4368708）試劑在7900HTSequenceDetection

System（ABI,美國(guó)）系統(tǒng)中進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR引物設(shè)計(jì)見表L程序設(shè)

定為5CTC維持2min,95。＜：變性10min，隨后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)

（95°C維持15min,60°C維持1min）。每次實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，采

用ACt法分析IncRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1引物序列設(shè)計(jì)

Tab1Sequencedesignforprimers

基因Gene上游引物Forwardprimer下游引物Reverseprimer

ENST000005119285-GCCTCGAATGCGTAGCTTTC-35-GCGnGGCAGAGGCAGn-3-

5<TGCAGGGTAC/XAGGCCAATAT-3

ENST000006183395JCATTTGTCATCTT(nTGTTGGATCA-3.

ENST00000618339y-CATHGICAICI1(1IGIIGGAICA-3'5-TGCAGGGTACAAGGCCAATAT-3

NR_12579()SACAAATC7TGAAGCCACAAATACAn'G-S,5-TCr?AAAGTGACGGATCTTTr-3

ENST(XXXMM853845-TTGGGACAAACCAAAGAATTGA-35-ATCCrTGGCTAGGTCTCTCATTTC-3

5-AAACCTnTCGCATACACTGATCA-3

CCND25-GGTGTCTGTTTGGTCAGGATGTT-3

BCL7A5-GCTGCGGCTACACATTCCA-35-CACAGCCnCCGGGTTGT-3

GAPDH5-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3-5-CACCCTGnGCrGTAGCCA/XA-3

注：CCND2:周期強(qiáng)白2CyclinD2;BCL7A:晦胞慢性淋巴綢胞性白血病/淋巴187AB,cellchroniclymphocyticIcukcmiiv'lymphoma7A

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理定性資料采用數(shù)值或百分比表示，定量資料采用

Mean±SD表示，符合正態(tài)分布及方差齊性的2組資料比較使用t檢驗(yàn)不

符合正態(tài)分布及方差齊性的樣本使用非參檢驗(yàn)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。x2

檢驗(yàn)用于分析定性資料的差異及相關(guān)性，Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)用于分析

IncRNA與臨床指標(biāo)的相關(guān)性，使用logistic回歸分析甲狀旁腺癌的危

險(xiǎn)因素。"log評(píng)分”模型的建立參考本課題組前期發(fā)表文章中的模型，

根據(jù)以下公式計(jì)算得出：口0g評(píng)分”=(IncRNAENST00000538790-

RQ)X(1/NR_125790-RQ)o其中，RQ為IncRNA相對(duì)表達(dá)量(relative

quantity),BPIog2轉(zhuǎn)換后的IncRNA表達(dá)量[5]。此外，近期有學(xué)者通

過(guò)logistic回歸模型亦構(gòu)建出miRNA在甲狀旁腺癌中的診斷模型，故本

研究中亦通過(guò)logistic回歸模型構(gòu)建第二種IncRNA模型：“l(fā)ogistic

評(píng)分”艮Pln[P/(l-P)]=1.876-1.298

xACtENST00000538790+l.225xACtNR_125790o其中，|J為甲狀旁腺癌的

概率，Ct值為RT-qPCR檢驗(yàn)中的檢測(cè)基因的循環(huán)閾值(cycle

threshold),ACt=CtlncRNA-CtGAPDH[7]e上述統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均由

SPSS19.0(IBMCorp，美國(guó))軟件完成圖片由Prism

v6.0(GraphPad,Inc)軟件繪制。受試者工作特征(receiveroperating

characteristic,ROC)曲線用于評(píng)估IncRNA的診斷效能，Z檢驗(yàn)用于

ROC曲線下面積(areaundercurve,AUC)的比較，上述檢驗(yàn)使用

MedCalc(MedCalcSoftware,Belgium)軟件完成。P<0.05為差異有統(tǒng)

計(jì)學(xué)意義。

M

E

E

H

K

a

?

S

M

c

N

N

;

u

f

p

M

-

S

S

J

r

>

ff

c

i

E

n豐

g

T

R

T

N

u

IIJCRNA的表達(dá)

G

H

T

l

S

a

0

0

T

t

&

T

a

*

c

SExpress沁nofIncRNA一

m

O

d

0整

N

0

b

s

O

n

(ACt)053

0

?

O

0

m

s

O

u

0

A甬