無菌微生物限度檢查及方法驗(yàn)證

微生物試驗(yàn)室的質(zhì)量管理一、試驗(yàn)室設(shè)施與設(shè)備和管理（法規(guī)要求）無菌檢查、微生物限度檢查與抗生素微生物檢定的試驗(yàn)室，應(yīng)嚴(yán)格分開。無菌檢查、微生物限度檢查試驗(yàn)室分無菌操作間和緩沖間。無菌操作間應(yīng)具備相應(yīng)的空調(diào)凈化設(shè)施和環(huán)境，接受局部百級(jí)措施時(shí)，其環(huán)境應(yīng)符合萬級(jí)干凈度要求。進(jìn)入無菌操作間應(yīng)有人流凈化和物流凈化的設(shè)施。無菌操作間應(yīng)依據(jù)檢驗(yàn)品種的須要，保持對(duì)鄰室的相對(duì)正壓或相對(duì)負(fù)壓，并定期檢測干凈度。無菌操作間內(nèi)禁放雜物，并應(yīng)制定地面、門窗、墻壁、設(shè)施等的定期清潔、滅菌規(guī)程。無菌檢查在干凈度100級(jí)單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，其全過程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染。單向流空氣區(qū)與工作臺(tái)面，必需進(jìn)行干凈度驗(yàn)證。微生物限度檢查的全過程，均應(yīng)遵守?zé)o菌操作，嚴(yán)防再污染。微生物試驗(yàn)室的質(zhì)量管理為滿足微生物學(xué)試驗(yàn)要求，微生物試驗(yàn)室應(yīng)具有：嚴(yán)格分開的無菌檢查、微生物限度檢查、無菌采樣室。菌種處理與微生物鑒別室有局部百級(jí)措施。各自分開的抗生素微生物檢定、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查、抗菌作用測定半無菌室。培育室（一般為100，000級(jí)）。試液及培育基的配制室。滅菌室。試驗(yàn)器皿洗滌、烘干室。人員辦公休閑室。試驗(yàn)用品、易耗品貯存室。微生物試驗(yàn)室的質(zhì)量管理設(shè)施和設(shè)備的管理特殊標(biāo)準(zhǔn)品——菌種培育基、緩沖液、試劑消毒劑文件管理培訓(xùn)內(nèi)審微生物試驗(yàn)室的質(zhì)量管理微生物室試驗(yàn)室的質(zhì)量管理制定干凈室（無菌室）的運(yùn)用管理規(guī)程（SOP）菌種處理相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）生物平安柜的運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）帶菌廢棄物的處理標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）環(huán)境消毒標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）環(huán)境清潔、消毒標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）試液及培育基配制的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）試驗(yàn)器皿洗滌標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）建立無菌室運(yùn)用登記冊(cè)運(yùn)用日期，時(shí)間，運(yùn)用人，設(shè)備運(yùn)轉(zhuǎn)狀況，溫、濕度，干凈度狀況（沉降菌數(shù)、浮游菌數(shù)、塵埃粒子數(shù)），報(bào)修緣由，報(bào)修結(jié)果，清潔工作（臺(tái)面、地面、墻面、天花板、傳遞窗、門把手），消毒液名稱等微生物試驗(yàn)室的質(zhì)量管理試驗(yàn)室運(yùn)用管理每天工作前用消毒液消毒工作臺(tái)，開紫外燈（最少半小時(shí)）進(jìn)行空氣消毒，每月定期做徹底清潔工作，適當(dāng)時(shí)用消毒劑進(jìn)行熏蒸。非必要品禁止帶入試驗(yàn)室，必要資料和記錄應(yīng)消毒后進(jìn)入并應(yīng)遠(yuǎn)離操作臺(tái)。試驗(yàn)人員進(jìn)入干凈室（無菌室）不得化妝、戴手表、戒指等首飾；不得吃東西。應(yīng)嚴(yán)格按更衣程序更衣。記錄溫濕度是否在規(guī)定的范圍內(nèi)，每次試驗(yàn)時(shí)，對(duì)操作室和層流臺(tái)做微生物沉降菌落計(jì)數(shù)并記錄；如發(fā)覺問題應(yīng)找緣由，剛好報(bào)修和報(bào)告并將報(bào)修緣由和結(jié)果記錄歸檔。如遇停電，應(yīng)立刻停止試驗(yàn)，重新進(jìn)入無菌室前，至少開啟機(jī)房運(yùn)轉(zhuǎn)1小時(shí)以上。在每次試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，應(yīng)用消毒劑剛好按消毒規(guī)程中的要求消毒操作臺(tái)和干凈室（區(qū)），并開啟室內(nèi)紫外燈以殺滅存留微生物。運(yùn)用后的器具如平皿、試管，全部微生物培育物，染菌/帶菌物品等應(yīng)用消毒液浸泡（至少24小時(shí)以上），經(jīng)煮沸或滅菌后清洗或丟棄。微生物試驗(yàn)室的質(zhì)量管理干凈室（無菌室）的運(yùn)用管理每季度定期進(jìn)行清潔度再驗(yàn)證，以確保干凈度符合規(guī)定，保存原始記錄及趨勢(shì)分析資料，定期歸檔保存。至少每年一次定期更換新的紫外燈管并記錄，以確保紫外燈管滅菌持續(xù)有效，定期歸檔保存。至少2年1次，或按干凈度驗(yàn)證明際狀況，定期更換初效、中效、高效頭。以確保凈化系統(tǒng)的功能持續(xù)有效，并同時(shí)在運(yùn)用登記本上做好更換記錄。定期歸檔保存。平常試驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)盡可能削減人員的走動(dòng)或活動(dòng)，通向干凈室的門要關(guān)閉或安裝自動(dòng)閉門器使其保持關(guān)閉狀態(tài)。發(fā)覺干凈度不符合規(guī)定時(shí)，應(yīng)立刻停止運(yùn)用，找尋緣由，徹底清潔、消毒，須經(jīng)清潔度再驗(yàn)證符合規(guī)定后，才再運(yùn)用，并將狀況記錄在無菌室運(yùn)用登記冊(cè)上，定期歸檔保存。非微生物室檢驗(yàn)人員不得進(jìn)入干凈室（無菌室），對(duì)必需進(jìn)入的外來人員或修理人員應(yīng)進(jìn)行指導(dǎo)和監(jiān)督。微生物試驗(yàn)室的質(zhì)量管理一、試驗(yàn)室設(shè)施與設(shè)備和管理設(shè)施—干凈室、凈化工作臺(tái)、生物平安柜。設(shè)備—高壓蒸汽滅菌器、電熱恒溫干烤箱、培育箱、冰箱。試驗(yàn)儀器—全封閉薄膜過濾裝置、電動(dòng)勻漿儀、電熱恒溫水浴箱、離心機(jī)、顯微鏡，及刻度吸管、試管、三角燒瓶、培育皿等。建立主要設(shè)施、設(shè)備、儀器的明細(xì)記錄，內(nèi)容包括名稱、型號(hào)、生產(chǎn)廠家、購買日期。質(zhì)量保證檔案：購買發(fā)票、安裝驗(yàn)收或開箱驗(yàn)收記錄、調(diào)試記錄、計(jì)量檢定或運(yùn)行校驗(yàn)合格證、指定專人負(fù)責(zé)、制訂標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）、建立運(yùn)用登記冊(cè)，修理、保養(yǎng)記錄、改造或更新記錄、直至報(bào)廢記錄。微生物試驗(yàn)室的質(zhì)量管理一、試驗(yàn)室設(shè)施與設(shè)備和管理定期監(jiān)測生物平安柜和（或）超凈工作臺(tái)的內(nèi)表面的微生物學(xué)質(zhì)量及其內(nèi)部的空氣質(zhì)量（粒子和微生物）。運(yùn)用時(shí)檢查壓差指示表。培育箱、冰箱需在設(shè)備的每個(gè)腔室內(nèi)放置經(jīng)校準(zhǔn)過的玻璃溫度計(jì)，每天檢查設(shè)備腔室內(nèi)的溫度狀況并且在日志上做好相應(yīng)的記錄。定期回顧每個(gè)設(shè)備的溫度記錄數(shù)據(jù)，以考察設(shè)備的運(yùn)行狀態(tài)。定期用中性的清潔劑或消毒劑清洗培育箱（或室）、冷藏箱（或室）、冷凍冰箱及水浴的腔室內(nèi)表面。高壓滅菌柜、電熱恒溫干燥箱等須要驗(yàn)證和持續(xù)監(jiān)控。儀器的校準(zhǔn)和確認(rèn)。微生物試驗(yàn)室的質(zhì)量管理須要確認(rèn)和驗(yàn)證試驗(yàn)和持續(xù)的質(zhì)量監(jiān)控的設(shè)備高壓滅菌柜和電熱恒溫干燥去熱原烘箱安裝確認(rèn)（IQ）：要確認(rèn)限制系統(tǒng)及其他儀器儀表的設(shè)計(jì)是否得當(dāng)并經(jīng)過校驗(yàn)。檢查有關(guān)共用介質(zhì)（如蒸氣、水和空氣等）符合滅菌工藝的要求。運(yùn)行確認(rèn)（OQ）：要求證明空載狀態(tài)下驗(yàn)證方案中所述腔室內(nèi)全部關(guān)鍵位置的溫度是否均處在規(guī)定范圍內(nèi)。建立熱分布圖譜?？蛰d狀態(tài)下，濕熱滅菌當(dāng)腔室工作溫度不低于121℃時(shí)，各點(diǎn)溫度與腔室內(nèi)平均溫度之差不超過±1℃，于熱除熱源，當(dāng)運(yùn)行溫度不低于250℃時(shí)，腔室內(nèi)的溫差應(yīng)不得超過±15℃。性能確認(rèn)（PQ）：要求在滿載條件，溫度探頭插入待滅菌物品的內(nèi)部，同時(shí)加入確定濃度的微生物或獨(dú)立的生物指示劑。對(duì)不同的工藝條件（物品、包裝和裝載方式、滅菌參數(shù)等），分別進(jìn)行性能確認(rèn)試驗(yàn)，包括熱穿透試驗(yàn)和生物指示劑挑戰(zhàn)試驗(yàn)。包括：高壓滅菌柜、除熱源電熱恒溫干燥箱、自動(dòng)微生物鑒別系統(tǒng)和計(jì)數(shù)系統(tǒng)。微生物試驗(yàn)室的質(zhì)量管理品種：5~20倍稀釋的碘伏水溶液0.10%新潔爾滅簡潔1:50的84消毒液75%乙醇溶液3%碘酒溶液5%石碳酸（來蘇兒）消毒溶液2%戊二醛水溶液尼泊金酒精消毒液等應(yīng)定期更換消毒劑品種，按標(biāo)準(zhǔn)精確配制。清潔、消毒劑的管理微生物試驗(yàn)室的質(zhì)量管理一、菌種的保存與管理菌種—特殊的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)保持基生長特性和削減污染，是微生物試驗(yàn)結(jié)果一樣性的重要保證。制定菌種保藏管理制度微生物試驗(yàn)室應(yīng)制定菌種的保藏管理規(guī)程來規(guī)范菌種的來源、申購、保管、轉(zhuǎn)種傳代、存儲(chǔ)和領(lǐng)用等方面的要求，確保菌種的溯源性和穩(wěn)定性；防止試驗(yàn)用菌種因多次傳代而失去典型生物學(xué)特征發(fā)生變異或死亡，保證菌種長期正確、穩(wěn)定，從而確保試驗(yàn)的靈敏度和重現(xiàn)性。菌種名稱：金黃色葡萄球菌菌種系列號(hào)：[CMCC(B)26003]傳代次數(shù)：第

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代有效期：年月日制備日期：年月日傳代人：王熙鳳微生物試驗(yàn)室的質(zhì)量管理菌種保存應(yīng)有專人負(fù)責(zé)，加鎖保存于冰箱中。試驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)來自CMCC（中國藥品生物制品檢定所醫(yī)學(xué)菌種保藏中心或ATCC（美國菌種保藏中心）等國際法定菌種保藏機(jī)構(gòu)。有接收、確認(rèn)記錄。菌種的轉(zhuǎn)種等均應(yīng)在超凈工作臺(tái)進(jìn)行，以防污染。各種菌種應(yīng)按規(guī)定時(shí)間接種，全部保藏的菌種均應(yīng)貼有相應(yīng)的標(biāo)簽，有菌種清單。驗(yàn)證明驗(yàn)常用菌種枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]生孢梭菌[CMCC（B）64941]銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]大腸埃希菌[CMCC（B）44102]乙型副傷寒沙門菌[CMCC（B）50094]白色念珠菌[CMCC（B）98001]黑曲霉[CMCC（B）9003]菌種保藏步驟干燥菌種復(fù)蘇，劃平板選擇特征典型的純菌菌落；（制菌懸液運(yùn)用）確定保藏的合格菌體形態(tài)；選擇最適宜的保存方法，定期對(duì)保藏菌種進(jìn)行檢查，視察是否發(fā)生變更，若有變更，須變更保藏方法。保藏期滿應(yīng)剛好進(jìn)行移種。菌種的接收標(biāo)準(zhǔn)菌種一般是玻璃安平裝的凍干粉劑接收時(shí)應(yīng)檢查名稱/數(shù)量和完整性。貼好標(biāo)簽后儲(chǔ)存于-20℃一般安平凍干品可在5年之內(nèi)運(yùn)用運(yùn)用時(shí)應(yīng)按（菌種保藏中心供應(yīng)的）相關(guān)資料的要求進(jìn)行復(fù)溶、培育和保存。菌種的復(fù)活菌種的復(fù)活用70%的酒精擦拭清潔安瓿，自然風(fēng)干用一小砂輪在安瓿的上部劃一條線，用手輕輕將安瓿開無菌操作，用一無菌吸管無菌移取1~2ml適宜的液體培育基到瓿中；輕輕地旋轉(zhuǎn)安瓿以使凍干菌種和液體培育基充分混合并完全溶解；用無菌吸管將安瓶內(nèi)菌液轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的液體培育基中，依據(jù)不同菌種類型而將其培育于適宜的溫度下24-72小時(shí)。菌種的確認(rèn)菌種復(fù)活后，應(yīng)確認(rèn)菌種的純度與特性從培育肉湯中取細(xì)菌培育物接種到平板上，上劃線分別出單個(gè)菌落。培育后視察其是否具有典型的菌落形態(tài)然后挑取單一的純菌落，進(jìn)行革蘭染色、鏡檢，視察其染色特性及菌形。最終再做生化試驗(yàn)以進(jìn)一步鑒定該菌種，或用API鑒定系統(tǒng)做鑒定工作。對(duì)已經(jīng)過鑒定確認(rèn)的菌種就可以進(jìn)行菌種的傳代和保藏了。菌種的傳代和保藏菌種的保藏方法使菌種的代謝處于最不活躍或相對(duì)靜止的狀態(tài)，從而在確定時(shí)間內(nèi)不發(fā)生變異并保持生命活力。一般來說，低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝實(shí)力降低的三個(gè)重要因素?zé)o論運(yùn)用那種菌種保藏方法，都應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證，以確保在相應(yīng)保存條件下的菌種不會(huì)變異并且性能穩(wěn)定。菌種的傳代次數(shù)（自原始菌種凍干粉起）不得超過5代（GMP，藥典）將微生物接種至一簇新培育基上/內(nèi)，每萌發(fā)一次即稱為“一代”。冷凍真空干燥保藏法主要是將待保藏菌種混于有疼惜作用介質(zhì)內(nèi)制成菌液，分裝在安瓿中于冷凍條件下使其快速凍結(jié)，因凍結(jié)可使晶型細(xì)致，不致?lián)p傷活菌細(xì)胞。然后用真空抽氣減壓，是安瓿內(nèi)的冰晶液體升華，水氣快速被真空抽走，冰晶型的菌液很快變成疏松的干燥固體物，最終在真空狀態(tài)下熔封管口，使干燥物在局部真空條件下封存，并置冷暗處，在很長時(shí)間內(nèi)菌種仍可維持活力不變。甘油冷凍管保藏法將待保藏菌接種至平板或瓊脂斜面，培育用無菌接種環(huán)輕輕刮取菌臺(tái)，用接種環(huán)使細(xì)菌充分?jǐn)U散到預(yù)先裝于試管中的無菌蒸餾水中調(diào)整菌液濃度，使其等同于麥?zhǔn)媳葷峁艿?0號(hào)管向已制備好的菌懸液中加入等體積、濃度為20%的無菌甘油，得到10%甘油菌懸液。輕輕振搖小管，使內(nèi)容物充分混合，分裝于無菌小試管。制好的甘油冷凍管最好在-30℃條件下貯存。有效期至少為2年。氧細(xì)菌和酵母菌可用此法保藏，霉菌和厭氧菌則不適于用此法保藏。液體石蠟覆蓋保藏法將菌種穿刺接種于半固體高層培育基中培育，無菌操作在層流臺(tái)下用無菌吸管吸取無菌液體石蠟至培育好的菌種管內(nèi)，并使石蠟高出菌種表面約1cm，將試管直立，置于2~8℃冰箱中或室溫下保存，如銅綠假單胞菌。此法保藏霉菌、放線菌、芽胞桿菌可保藏兩年以上，酵母菌可保藏1~2年，一般無芽胞細(xì)菌也可保藏1年左右。此法制備簡潔，不須要其他特殊設(shè)備，并且效果好，是傳代培育的變相方法，可適當(dāng)延長保藏時(shí)間。瓊脂斜面低溫保藏法保藏法（廠家常用）將菌種接種在適宜的固體斜面培育基上，生長充分后，移至2~8℃冰箱中保藏。保藏時(shí)間：霉菌、放線菌及芽胞的菌保存2~4個(gè)月，移種一次；酵母菌2個(gè)月移種一次；細(xì)菌最好每1月移種一次。優(yōu)點(diǎn)：操作簡潔，運(yùn)用便利，不需特殊設(shè)備，對(duì)大多數(shù)微生物都適用。缺點(diǎn)：保藏期太短；傳代次數(shù)多，易發(fā)生變異及污染。此法為試驗(yàn)室工作用菌種的最常用的保藏方法，僅能用于工作用菌種的短期保藏。保藏芽胞液對(duì)產(chǎn)芽胞的微生物宜制成芽胞菌懸液后再保藏，無菌操作，取1ml孢子液接入茄形瓶或培育皿內(nèi)，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)使菌液勻整分布于培育基表面。將培育皿在適當(dāng)?shù)臏囟认屡嘤Ｒ话沩氁?天或更長時(shí)間在層流臺(tái)下，取3~5ml氯化鈉磷酸鹽緩沖液（pH7.0）加入培育皿內(nèi)用無菌玻璃L棒輕輕刮下菌苔，留意不要?jiǎng)澠婆嘤?。用無菌注射器或無菌吸管吸取菌懸液，收集于試管中。將收集的芽胞液放在80~90℃水浴中加熱15分鐘，冷卻。做好標(biāo)記，放至2~8℃冰箱中保藏。原始芽胞液可保存1年。每次運(yùn)用前用平皿法重新標(biāo)定其濃度。微生物菌種的傳代保藏過程按菌種說明書要求復(fù)溶菌粉菌（標(biāo)準(zhǔn)菌株），轉(zhuǎn)種于適當(dāng)?shù)脑鼍嘤鶅?nèi)（此為第一代G1），復(fù)壯后轉(zhuǎn)接至平板上，并于適當(dāng)溫度下培育適當(dāng)時(shí)間，分別出單個(gè)純種菌落（此為其次代G2）菌種鑒定完成后，挑取純菌落制成濃菌懸液用于制備甘油冷凍管，冷凍或低溫保存（標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株G2）；同時(shí)挑取純菌落轉(zhuǎn)接斜面菌種作為工作用菌種（工作菌株W3），于適當(dāng)溫度下培育適當(dāng)時(shí)間后可用于試驗(yàn)，直至轉(zhuǎn)為W5為止，需重新開啟安瓶，再重復(fù)上述操作程序。菌種被分為兩類，傳代用菌種和工作用菌種，傳代用菌種（標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株）用甘油冷凍管法保藏工作用菌種（工作菌株）用斜面低溫保藏法保藏試驗(yàn)用菌液的制備傳代：取菌液0.1ml接種至10ml液體培育基，按規(guī)定培育、稀釋比照用菌種在運(yùn)用過程中，亦應(yīng)檢查其生物學(xué)特性。如菌落形態(tài)（在可能狀況下，用選擇性培育基進(jìn)行生長檢查）、革蘭染色、鏡檢菌體形態(tài)、主要生化特性（必要時(shí)應(yīng)作菌種鑒定試驗(yàn)）。如發(fā)覺染菌或或變異，衰退等現(xiàn)象時(shí)，應(yīng)剛好處理。為保證試驗(yàn)的牢靠性和精確性，試驗(yàn)室還應(yīng)嚴(yán)格依據(jù)相關(guān)規(guī)程制備和運(yùn)用菌種，并對(duì)每種微生物的存貯條件（需/厭氧狀態(tài)、溫度和時(shí)間）進(jìn)行確認(rèn)。室溫下菌懸液應(yīng)在制備后的2小時(shí)內(nèi)運(yùn)用低溫保存（2-8℃）時(shí)細(xì)菌和酵母菌的菌懸液應(yīng)在制備后的24小時(shí)內(nèi)運(yùn)用霉菌孢子液則應(yīng)在制備后的7天內(nèi)運(yùn)用（黑曲霉孢子懸液可保存在2~8℃，在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)運(yùn)用）在運(yùn)用時(shí)（在24小時(shí)之內(nèi)）均應(yīng)同時(shí)進(jìn)行菌數(shù)復(fù)核檢查。試驗(yàn)時(shí)可接受分光光度法或麥?zhǔn)媳葷岱ü烙?jì)菌液濃度。4、菌種運(yùn)用記錄當(dāng)菌種超過有效期或被污染以后應(yīng)滅菌后丟棄?！跏恰醴裾f明：試驗(yàn)室菌種編號(hào)原則：名稱+傳代代數(shù)+制備日期培育基管理一般接受購自中國藥品生物制品檢定所合格的商品脫水培育基。同時(shí)依據(jù)運(yùn)用說明書進(jìn)行配制，需留意培育基的pH值應(yīng)符合規(guī)定，否則必需校正后，按說明書規(guī)定滅菌。商品脫水培育基應(yīng)在有效期內(nèi)運(yùn)用，運(yùn)用前應(yīng)留意核對(duì)名稱，檢查外觀，遇有結(jié)塊、吸潮現(xiàn)象，應(yīng)廢棄。簇新培育基的配制，應(yīng)按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的配方進(jìn)行，對(duì)培育基的原材料要進(jìn)行選擇，試劑應(yīng)為化學(xué)純?cè)噭┮?guī)格。制成的培育基要求無沉淀。必要時(shí)以適當(dāng)方法過濾，調(diào)整pH值，分裝滅菌備用。滅菌：應(yīng)閱歷證合格的滅菌程序（確定裝載方式下滅菌方法和條件）。驗(yàn)證：無菌性試驗(yàn)，促生長試驗(yàn)，滅菌器蒸汽循環(huán)系統(tǒng)。培育基的質(zhì)量限制建立質(zhì)量限制程序全部配好的培育基均需進(jìn)行質(zhì)量限制（pH、適用性檢查試驗(yàn)）培育基有效期的確定：定期的穩(wěn)定性檢查以確定有效期（2~25℃，避光，非密閉容器3周內(nèi)運(yùn)用，密閉容器1年內(nèi)運(yùn)用。質(zhì)量限制的頻率：用同1批脫水培育基，接受閱歷證的配制和滅菌方法制備的培育基，可只做1次靈敏度檢驗(yàn)。質(zhì)量限制菌株的選擇（養(yǎng)分、靈敏、代表性）對(duì)無菌培育基的無菌性、靈敏度檢查與比照培育基進(jìn)行比較無菌檢查用需氣厭氣培育基的指示劑氧化層不得超過培育基深度的1/5，否則須經(jīng)水浴煮沸10分鐘，但只限加熱一次。無菌檢查結(jié)束時(shí)，指示劑氧化層應(yīng)不超過培育基深度的1/2。大腸埃希菌檢查用MUG培育基配制前應(yīng)選擇無熒光的試管進(jìn)行配制，視察結(jié)果時(shí)應(yīng)用同批培育基配制的空白管和陽性菌管同時(shí)視察。培育基的靈敏度檢查：已知菌生長試驗(yàn)①細(xì)菌組：取每管裝量為12ml硫乙醇酸鹽液體培育基9支，分別接種小于100cfu試驗(yàn)菌各2支；菌種：金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌生孢梭菌空白比照：另一支不接種，培育24~72小時(shí)逐日視察結(jié)果②霉菌組：取每管裝量為9ml的改良馬丁液體培育基5支，分別接種小于100cfu試驗(yàn)菌各2支；菌種：白色念珠菌黑曲霉空白比照：另一支不接種，培育5天逐日視察結(jié)果結(jié)果判定空白管培育基無菌生長加菌的培育基管均生長良好判靈敏度檢查合格。培育基管理配制好的培育基，按無菌要求進(jìn)行滅菌。培育基的配制須有記錄，記錄內(nèi)容含有：配制日期和配制人員的標(biāo)識(shí)；培育基/溶液的類型、體積；成分、每個(gè)成分物質(zhì)的含量、制造商、批號(hào)；pH（最初和最終）值無菌措施，包括實(shí)施的方式、時(shí)間和溫度。按日期編制滅菌后的培育基編號(hào)將制備完畢的培育基按品種放置在陰涼的指定位置，備用。留意保存期滅菌法濕熱高壓蒸汽滅菌法：依115℃、121℃或132℃，應(yīng)用于培育基滅菌、試驗(yàn)器械、工作服、橡膠物品和試驗(yàn)室廢棄物，也可用于玻璃器皿的滅菌。一般121℃30min干熱法：利用物理學(xué)，171℃-1小時(shí)，160℃-2小時(shí)、121℃-3小時(shí)：玻璃器皿濕熱：蛋白質(zhì)簡潔凝固干熱：氧化檢驗(yàn)方法學(xué)驗(yàn)證：在化學(xué)測試中，藥品的測定方法須要驗(yàn)證，與此相應(yīng)，當(dāng)建立藥品的無菌、微生物限度檢查法時(shí)，也應(yīng)進(jìn)行分析方法的驗(yàn)證，以證明所接受的方法適合于該產(chǎn)品的無菌、微生物限度檢查。證明接受藥典的某種方法和檢驗(yàn)條件，在該供試品的檢驗(yàn)量、檢驗(yàn)條件下，無抑菌活性或活性已消逝，保證檢驗(yàn)結(jié)果的精確性。檢驗(yàn)方法學(xué)驗(yàn)證：驗(yàn)證時(shí)機(jī)；建立檢驗(yàn)方法時(shí)；修訂檢驗(yàn)方法時(shí)；組分和檢驗(yàn)條件發(fā)生變更時(shí)；定期再驗(yàn)證。人員人是無菌藥品生產(chǎn)中的主要污染源，在管理比較到位。生產(chǎn)設(shè)備自動(dòng)化程度較好，操作人員素養(yǎng)較高的企業(yè)，人員操作所致的污染率超過70%。具微生物專業(yè)學(xué)問經(jīng)無菌技術(shù)培訓(xùn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果能進(jìn)行充分全面的評(píng)價(jià)。其它重要影響因素藥品本身的抑菌性；培育基的促菌生長實(shí)力；培育條件（溫度、濕度及需氧或厭氧）；過濾系統(tǒng)的材質(zhì)檢驗(yàn)的進(jìn)展強(qiáng)調(diào)檢驗(yàn)的過程限制，提高檢出率，保證檢驗(yàn)結(jié)果的牢靠性。人員的要求環(huán)境、設(shè)施要求培育基適用性檢驗(yàn)數(shù)量方法驗(yàn)證培育時(shí)間試驗(yàn)用菌全封閉過濾培育器、隔離系統(tǒng)檢驗(yàn)結(jié)果的保證要求有一個(gè)取樣支配來涵蓋整個(gè)批號(hào)有足夠的取樣量和檢驗(yàn)量選擇適用的培育基接受閱歷證的無菌檢驗(yàn)方法良好的環(huán)境監(jiān)控人員保證無菌檢查無菌檢查定義：無菌原料藥是指法定藥品標(biāo)準(zhǔn)中列有無菌檢查項(xiàng)目的制劑和原料藥，包括無菌制劑和無菌原料藥。無菌檢查是檢查要求無菌的藥品、醫(yī)療器具、原料、輔料以及要求無菌的其他物品是否染有活菌的一種方法。符合無菌檢查法的規(guī)定僅表明白供試品在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)覺細(xì)菌和真菌污染。無菌檢查法建立在批產(chǎn)品受微生物污染是勻整的假設(shè)上（其實(shí)非勻整）。無菌檢出低污染的概率極低的。因此，無菌檢查存在風(fēng)險(xiǎn)和局限性。無菌檢查的局限性無法對(duì)整批產(chǎn)品進(jìn)行100%檢驗(yàn)只進(jìn)行細(xì)菌和真菌的檢驗(yàn)培育基培育條件（如溫度和時(shí)間）是有限的我們的工作環(huán)境及操作是在相對(duì)無菌的狀態(tài)。無菌檢查：注射劑、植入劑、部特殊用藥鼻用制劑：用于手術(shù)或創(chuàng)傷的鼻用制劑。凝膠劑：用于嚴(yán)峻創(chuàng)傷的凝膠劑。乳膏劑：用于燒傷或嚴(yán)峻創(chuàng)傷的乳膏劑。新增的無菌檢查中藥制劑散劑：用于燒傷或嚴(yán)峻創(chuàng)傷的外用散劑。鼻用制劑：用于嚴(yán)峻創(chuàng)傷的鼻用制劑。眼用制劑：用于傷口的眼用制劑。軟膏劑：用于燒傷或嚴(yán)峻創(chuàng)傷的乳膏劑。氣霧劑、噴霧劑：用于燒傷或嚴(yán)峻創(chuàng)傷的氣霧劑、噴霧劑。GMP—取樣取樣留意事項(xiàng)，包括為降低取樣過程產(chǎn)生的各種風(fēng)險(xiǎn)所實(shí)行的預(yù)防措施，尤其是無菌或有害物料的取樣以及防止取樣過程中污染和交叉污染的留意事項(xiàng)；在生產(chǎn)的每一階段，應(yīng)當(dāng)疼惜產(chǎn)品和物料免受微生物和其他污染。附錄1無菌藥品質(zhì)量限制第八十條無菌檢查的取樣支配應(yīng)當(dāng)依據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果制定，樣品應(yīng)當(dāng)包括微生物污染風(fēng)險(xiǎn)最大的產(chǎn)品。無菌檢查樣品的取樣至少應(yīng)當(dāng)符合以下要求：（一）無菌灌裝產(chǎn)品的樣品必需包括最初、最終灌裝的產(chǎn)品以及灌裝過程中發(fā)生較大偏差后的產(chǎn)品；（二）最終滅菌產(chǎn)品應(yīng)當(dāng)從可能的滅菌冷點(diǎn)處取樣；（三）同一批產(chǎn)品經(jīng)多個(gè)滅菌設(shè)備或同一滅菌設(shè)備分次滅菌的，樣品應(yīng)當(dāng)從各個(gè)/次滅菌設(shè)備中抽取。一般隨機(jī)抽樣，保證樣品的代表性和原始性，復(fù)試樣品應(yīng)盡量重現(xiàn)原取樣。留意事項(xiàng)只要供試品的性狀允許，應(yīng)接受薄膜過濾法（首選）只要供試品的性狀允許（溶解性、抑菌性），應(yīng)將全部容器內(nèi)的全部內(nèi)容物過濾驗(yàn)證用供試品用最大量陽性比照分開培育大腸埃希菌代替銅綠假單胞菌（G+敏感，保證結(jié)果有效）無菌檢測14天（補(bǔ)償生長條件、潛在的低生長者、修復(fù)受損細(xì)胞）優(yōu)先選用密閉式過濾器，或一次性過濾器濾膜材質(zhì)（抗用低吸附），濾膜的完整性，沖洗量。干脆法接種供試品體積不得大于培育基體積的10%，每管裝量硫乙醇酸鹽流體培育基不少于15ml，改良馬丁培育基不少于10ml，可用濃縮培育基，或增加培育容器數(shù)。結(jié)果推斷陽性管生長良好，陰性管不得長菌，否則試驗(yàn)無效。以一次檢出為準(zhǔn)，不得復(fù)試。（低檢出率，試驗(yàn)環(huán)境、條件改善當(dāng)符合下列至少一個(gè)條件時(shí)，方可判試驗(yàn)結(jié)果無效；無菌檢查試驗(yàn)所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無菌檢查法的要求?；仡櫉o菌試驗(yàn)過程中，發(fā)覺有可能引起微生物污染的因素。陰性比照管有菌生長。供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后，確認(rèn)是因無菌試驗(yàn)中所運(yùn)用的物品和（或）無菌操作技術(shù)不當(dāng)引起的。結(jié)果保證有效的結(jié)果牢靠的結(jié)論培育基保證結(jié)果推斷SOP操作人方法驗(yàn)證的一般程序與環(huán)節(jié)需前處理不需前處理有抑菌作用樣品無抑菌作用去除抑菌作用檢查①驗(yàn)證前處理方法對(duì)污染菌生長、檢出的影響。②可以通過驗(yàn)證明驗(yàn)推斷③驗(yàn)證抑菌活性去除的有效性，以及去除方法對(duì)污染菌生長、檢出的影響。無菌檢查驗(yàn)證明驗(yàn)：供試品干脆接種法薄膜過濾法100ml/筒①試驗(yàn)組（供試品+菌）金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸、枯草桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉②培育基比照組③陽性菌比照組（加菌同試驗(yàn)組）規(guī)定T培育3~5天視察結(jié)果書寫驗(yàn)證報(bào)告④稀釋劑比照組微生物限度檢查微生物限度檢查：口服、外用限制項(xiàng)目雜菌數(shù)：細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)。限制菌（致病菌）：大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、梭菌、白色念珠菌。制定原則：非無菌藥品的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)是基于藥品的給藥途徑及對(duì)患者潛在的危害而制定的。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)檢查限制菌不含藥材原粉的制劑含藥材原粉的制劑：丸劑含動(dòng)物藥的制劑外用制劑滴眼劑一般局部用藥直腸給藥制劑尿道、陰道給藥制劑滴鼻劑不同制劑的限度留意事項(xiàng)接受稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合運(yùn)用這些方法消退供試品的抑菌活性供試液從制備到加入檢驗(yàn)用培育基不得超過1小時(shí)供試液制備若需用水浴加溫時(shí)，溫度不應(yīng)超過45℃供試品須符合微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報(bào)告規(guī)則，應(yīng)接受使微生物生長的更高稀釋級(jí)進(jìn)行驗(yàn)證。（10-3，1000）無合適方法消退抑菌性的檢驗(yàn)方法，選擇回收率更接近要求的方法和條件應(yīng)對(duì)生產(chǎn)工藝和產(chǎn)品特性進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，保證檢驗(yàn)結(jié)果的精確性和產(chǎn)品質(zhì)量。報(bào)告規(guī)則（平均數(shù)，300cfu）培育溫度、培育時(shí)間變更檢驗(yàn)量（中藥膜劑，沙門菌）樣品稀釋級(jí)的選擇（驗(yàn)證）離心法500轉(zhuǎn)/分，3分鐘（中藥混懸劑重新驗(yàn)證，只適用細(xì)菌）限制菌-培育基的適用性（促生長實(shí)力、指標(biāo)實(shí)力和抑制實(shí)力）—參照培育基（比較菌落形態(tài)、大小、指標(biāo)劑反應(yīng)、生長速度）—最長（抑）、最短（生）培育時(shí)間。疑似菌確認(rèn)，選擇認(rèn)可的菌種鑒定方法，陽性比照試驗(yàn)至少進(jìn)行到分別的步驟。微生物限度檢查法驗(yàn)證細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證定量——回收率測定試驗(yàn)限制菌檢查方法驗(yàn)證定性——能否生長、專屬性試驗(yàn)回收率計(jì)算試驗(yàn)組的菌回收率=[（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品組平均菌落數(shù)）/菌液組平均菌落數(shù)]﹡100%稀釋級(jí)比照組的菌回收率=[（稀釋劑比照組的平均菌落數(shù)/菌液組的平均菌落數(shù)）]﹡100%在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑比照組、試驗(yàn)組的回收率均不低于70%，若任一次試驗(yàn)中回收率低于70@，應(yīng)重新選擇方法再驗(yàn)證。方法驗(yàn)證：限制菌限制菌：大腸埃希菌，銅綠假單胞菌、沙門菌、大腸菌群、生孢梭菌計(jì)數(shù)方法：平皿法、薄膜過濾法。特殊：生孢梭菌（加菌量：10~100cfu，只要求生長不要求回收率制定原則：非無菌藥品的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)是基于藥品的給藥途徑及對(duì)患者潛在的危害而制定的。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)檢查限制菌原料藥/賦形劑量微生物檢查微生物能否在原料或賦形劑中生長或存活？供應(yīng)支持?jǐn)?shù)據(jù)，不必做微生物限度檢查和制定認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)原料或賦形劑是否無菌？不需進(jìn)一步做微生物限度檢查法或制定認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)原料/賦形劑合成/工藝相關(guān)步驟本身是否會(huì)削減微生物依據(jù)協(xié)議后藥典各論制訂微生物限度認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)協(xié)議后藥典各論制訂微生物限度認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)逐批檢查微生物限度和指示菌抽批檢驗(yàn)微生物限度和指示菌是否有科學(xué)證明削減步驟會(huì)造成原料/輔料中微生物量認(rèn)可限度（未檢出覺指示菌）？供應(yīng)支持?jǐn)?shù)據(jù)，不必做微生物限度檢查和制訂認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)所監(jiān)控的微生物量/指示菌量是否都低于規(guī)定限度？是否是是是否是是非無菌制劑的微生物檢查制劑中是否含防腐劑或本身是否有抗微生物實(shí)力？制訂防腐劑認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)和認(rèn)證在低于或等于指定的最小防腐劑濃度時(shí)是否有效，并證明制劑本身的抗微生物實(shí)力逐批進(jìn)行微生物限度試驗(yàn)依據(jù)協(xié)議后藥典各論制訂微生物限度認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)不必做微生物限度檢查和制訂認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)是否每批都符合微生物限度標(biāo)準(zhǔn)？供應(yīng)支持?jǐn)?shù)據(jù)，不必做微生物限度檢查和制訂認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)是否是否是制劑是否為固體劑型？是否有科學(xué)證據(jù)證明制劑有抑制微生物生長的特性？否否是保證藥品微生物檢驗(yàn)結(jié)果牢靠的有效途徑藥品微生物試驗(yàn)環(huán)境微生物的監(jiān)測環(huán)境微生物的監(jiān)測環(huán)境細(xì)菌與藥品細(xì)菌的比較結(jié)論2010版藥典無菌檢查法的主要