呼吸道病原體檢測

關(guān)于呼吸道病原體檢測第1頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三呼吸道感染呼吸道感染是指病原體感染人體的鼻腔、咽喉、氣管和支氣管等呼吸系統(tǒng)分為上呼吸道感染和下呼吸道感染第2頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三上呼吸道感染常見急性上呼吸道感染，指鼻腔、咽或喉部急性炎癥的概稱，是呼吸道最常見的一種傳染病常見病因?yàn)椴《荆贁?shù)由細(xì)菌引起?；颊卟环帜挲g、性別、職業(yè)和地區(qū)。不僅具有較強(qiáng)的傳染性，而且可引起嚴(yán)重并發(fā)癥第3頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三下呼吸道感染包括急性氣管/支氣管炎、慢性支氣管炎、肺炎、支氣管擴(kuò)張等由病毒、細(xì)菌、支原體、衣原體、軍團(tuán)菌等微生物引起，其防治應(yīng)遵循預(yù)防為主、準(zhǔn)確診斷、及時(shí)治療的原則，治療時(shí)必須明確引起感染的病原體以選擇有效的抗生素第4頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三呼吸道病原體常見的呼吸道病原體主要有病毒、細(xì)菌、支原體、衣原體和立克次體等據(jù)統(tǒng)計(jì)，90%以上急性呼吸道感染由病毒引起一種病原體可引起多種臨床癥狀，同一臨床表現(xiàn)可由多種病原體引起第5頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三呼吸道病原體細(xì)菌：細(xì)菌引起呼吸道感染的機(jī)會比病毒少。一旦感染，癥狀多較嚴(yán)重，定位比較明顯，如扁桃體炎、中耳炎、鼻竇炎等。由細(xì)菌引起的兒童肺炎往往是流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌或金黃色葡萄球菌第6頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三呼吸道病原體病毒，包括鼻病毒、冠病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、腺病毒等第7頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三呼吸道病原體支原體、衣原體感染導(dǎo)致的呼吸道感染與其它病原體感染的早期臨床表現(xiàn)類似?？赡茉?-3天后咳嗽的癥狀會表現(xiàn)比較突出。在小于30歲的年輕人中，肺炎支原體是最重要的下呼吸道病原體第8頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三非典型呼吸道病原體是指除肺炎鏈球菌以外的病原體，包括嗜肺軍團(tuán)菌(LP)、肺炎支原體(MP)、肺炎衣原體(CP)、Q熱立克次體(貝納柯克斯體)、腺病毒(ADV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒(IFV)和副流感病毒(PIV)等第9頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三非典型呼吸道病原體這些病原體變異快，傳播廣，由于不易形成長期免疫力而難以預(yù)防和控制流感病毒副流感病毒病毒呼吸道合胞病毒腺病毒第10頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三呼吸道病原體檢測現(xiàn)有的主要方法：病毒分離培養(yǎng)抗原檢測抗體檢測分子生物學(xué)方法等第11頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三檢測方法的比較檢測方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)病毒分離培養(yǎng)特異性高，金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件要求高、靈敏度低，標(biāo)本中病原體量少時(shí)，易致假陰性?？乖瓩z測直接免疫熒光法簡便、快速、靈敏度和特異性均較高且可用于疾病的早期診斷需要特異性抗體、熒光顯微鏡，易受采樣限制抗體檢測間接免疫熒光法靈敏度、特異性較高對疾病早期診斷沒有太大幫助酶聯(lián)免疫吸附法較快速，批量篩查特異性不高，假陽性多分子生物學(xué)方法靈敏度和特異性均很高操作繁瑣，價(jià)格昂貴第12頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三抗體、抗原檢測的比較抗體IgM檢測病原體抗原檢測檢測最佳時(shí)間一般在感染一周左右病毒感染出現(xiàn)癥狀后即可檢測出臨床意義回顧性診斷，適用于疾病中后期的診斷，可用于疾病早期診斷，對患者的治療有重要指導(dǎo)意義檢測靈敏度將包被有不同基質(zhì)的生物薄片固定在一個(gè)反應(yīng)區(qū)中，可同時(shí)檢測多種抗不同病原體的抗體檢測方法一般使用ELISA或者間接免疫熒光法，有非特異性熒光一般使用直接免疫熒光法，幾乎沒有非特異性反應(yīng)，敏感性較差第13頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三IgMIgG第14頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三機(jī)體產(chǎn)生IgM一般需要一周左右的時(shí)間，而有免疫缺陷或免疫系統(tǒng)不健全的個(gè)體如兒童，特別是3歲以下的小孩，其產(chǎn)生抗體往往需要更久，且抗體產(chǎn)生的水平也較低若檢測的是IgG，則不能很好地區(qū)分既往感染和急性感染第15頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三因此，抗原檢測的方法對嬰幼兒和兒童的呼吸道感染的病因診斷、鑒別診斷和臨床用藥指導(dǎo)比抗體法更有優(yōu)勢檢測抗體IgM比IgG更有臨床意義第16頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三采樣抗原檢測拭子伸入鼻部后向鼻咽部水平伸入，不是向鼻腔伸入。

伸入距離為從耳垂部到鼻尖長度的一半，一般針對兩周歲以下兒童，伸入距離約為拭子絨毛頭的長度兩倍拭子伸入后要輕輕捻動(dòng)拭子轉(zhuǎn)3圈。

取樣后在一小時(shí)之內(nèi)洗脫到生理鹽水中，12小時(shí)內(nèi)送檢第17頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三抗原檢測采樣第18頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三采樣抗體檢測第19頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三采樣對結(jié)果影響較大非典型感染多為干咳，無痰/少痰陽性率低（標(biāo)本問題，病毒顆粒?。┛乖隗w內(nèi)存在時(shí)間短抗原檢測的劣勢第20頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三九項(xiàng)呼吸道感染病原體IgM抗體檢測第21頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三檢測原理間接免疫熒光法（IFA）是基于待測樣本中的抗體與吸附在載玻片上的抗原發(fā)生的反應(yīng)。樣本中存在的特異性抗體和抗原反應(yīng)，未與抗原結(jié)合的免疫球蛋白在洗滌步驟中除去。在下一步驟中，抗原-抗體復(fù)合物與熒光素標(biāo)記的抗人球蛋白反應(yīng)，用免疫熒光顯微鏡觀察結(jié)果第22頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三試劑盒組成組分成分和用途載玻片檢測的物理載體，覆有聚四氟乙烯并包被有針對檢測物的特異性抗原，質(zhì)控品吸附劑羊抗人IgG用來吸附人IgG避免干擾IgM檢測FITC結(jié)合物熒光素標(biāo)記的抗人免疫球蛋白結(jié)合物，和抗原抗體復(fù)合物反應(yīng)，并顯色封閉介質(zhì)甘油緩沖液，便于觀察磷酸鹽緩沖液(PBS)用于洗滌步驟，從反應(yīng)介質(zhì)中除去未結(jié)合的免疫球蛋白和結(jié)合物第23頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三實(shí)驗(yàn)步驟1樣本的稀釋：血清標(biāo)本與PBS按1:1比例稀釋稀釋后的血清加入吸附劑中，徹底混勻。處理后的血清要離心10-15分鐘除去沉淀，以防干擾檢測第24頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三實(shí)驗(yàn)步驟2第25頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三結(jié)果判斷第26頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三陰性結(jié)果熒光圖譜軍團(tuán)菌、肺炎衣原體和立克次體無熒光；支原體、腺病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的細(xì)胞呈現(xiàn)紅色第27頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三陽性結(jié)果熒光圖譜腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒對陽性血清的1-15%細(xì)胞的細(xì)胞核、胞漿或胞膜出現(xiàn)蘋果綠色熒光；軍團(tuán)菌、衣原體或立克次體中所有的細(xì)菌呈現(xiàn)出蘋果綠色熒光；支原體對陽性血清在細(xì)胞外圍呈現(xiàn)蘋果綠色熒光第28頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三病原體形態(tài)或熒光模式嗜肺軍團(tuán)菌桿狀肺炎支原體細(xì)胞外圍熒光模式立克次體球桿狀肺炎衣原體球狀腺病毒混合熒光模式（細(xì)胞核和胞漿或胞膜）呼吸道合胞病毒混合熒光模式（細(xì)胞核和胞漿或胞膜）甲型流感病毒混合熒光模式（細(xì)胞核和胞漿或胞膜）乙型流感病毒混合熒光模式（細(xì)胞核和胞漿或胞膜）副流感病毒混合熒光模式（細(xì)胞核和胞漿或胞膜）第29頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三嗜肺軍團(tuán)菌陰性：熒光弱、少、不規(guī)則第30頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三嗜肺軍團(tuán)菌陽性：熒光密集，且亮度較好，桿狀形態(tài)第31頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三肺炎支原體陰性：紅色細(xì)胞周圍無或少量熒光，亮度弱第32頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三肺炎支原體陽性：熒光占視野50%以上，亮度好，形態(tài)為明顯的細(xì)胞膜或胞漿第33頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三Q熱立克次體陰性：熒光弱、少、不規(guī)則第34頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三Q熱立克次體陽性：熒光亮度強(qiáng)且數(shù)量多，形態(tài)典型第35頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三肺炎衣原體陰性：熒光弱、少第36頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三肺炎衣原體陽性：熒光密集，且亮度較好第37頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三腺病毒陰性：熒光弱、少第38頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三腺病毒陽性：熒光亮度強(qiáng)且數(shù)量多，平均每個(gè)視野的陽性細(xì)胞>3-5個(gè)第39頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三呼吸道合胞病毒陰性：熒光弱、少第40頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三呼吸道合胞病毒陽性：熒光亮度強(qiáng)且數(shù)量多，平均每個(gè)視野的陽性細(xì)胞>3-5個(gè)第41頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三甲型流感病毒陰性：熒光弱、少第42頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三甲型流感病毒陽性：熒光亮度強(qiáng)且數(shù)量多，平均每個(gè)視野的陽性細(xì)胞>3-5個(gè)第43頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三乙型流感病毒陰性：熒光弱、少第44頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三乙型流感病毒陽性：熒光亮度強(qiáng)且數(shù)量多，平均每個(gè)視野的陽性細(xì)胞>3-5個(gè)第45頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三副流感病毒陰性：熒光弱、少第46頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三副流感病毒陽性：熒光亮度強(qiáng)且數(shù)量多，平均每個(gè)視野的陽性細(xì)胞>3-5個(gè)第47頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三方法的局限性抗體水平無顯著上升時(shí)不能排除感染的可能性單一樣本抗體檢測結(jié)果不能幫助作出近期感染的診斷。應(yīng)采集雙份樣本（急性期和康復(fù)期）同時(shí)檢測來觀察血清轉(zhuǎn)化或抗體水平的明顯升高第48頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三方法的局限性對患有自身免疫性疾病病人的血清，用IFA檢測時(shí)，支原體、腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒，會在細(xì)胞上發(fā)生非特異性反應(yīng)，這些血清不能用此方法評價(jià)質(zhì)控孔用于檢測這種現(xiàn)象第49頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三方法的局限性在嗜肺軍團(tuán)菌和Q熱立克次體中，有時(shí)血清會含有與卵抗原反應(yīng)的抗體，所以使用卵黃囊固定抗原會出現(xiàn)非特異性熒光。當(dāng)出現(xiàn)這種情況時(shí)，該血清就不能用IFA進(jìn)行分析了第50頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三臨床實(shí)際效果圖第51頁，共60頁，2023年，2月20日，星期三第52頁，共60頁，2023年，2月