基因診斷和基因治療

關(guān)于基因診斷和基因治療第1頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三概念：

基因是攜帶生物遺傳信息的基本功能單位，是位于染色體上的一段特定DNA序列。基因的改變，會(huì)導(dǎo)致各種表型的改變，進(jìn)而引起疾病的發(fā)生。

將基因或其組成部分發(fā)生異常的疾病統(tǒng)稱為基因病。第2頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三基因病分為三大類：一、單基因?。河蓡蝹€(gè)基因突變引起的一類疾病。如：血友病、地中海貧血等。二、多基因?。河啥鄠€(gè)基因突變綜合作用引起的疾病。如：惡性腫瘤、高血壓、動(dòng)脈硬化、糖尿病、先天畸形等、三、獲得性基因?。褐竿庠椿颍―NA）侵入，在機(jī)體產(chǎn)生疾病，一旦將其清除便可痊愈。如：艾滋病及各種微生物感染病。第3頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三第一節(jié)基因診斷（DNAdiagnosis）一、基因診斷的概念和基本概況臨床診斷生化學(xué)診斷免疫學(xué)診斷臨床疾病診斷四種方式：以疾病表型改變?yōu)橐罁?jù)。（細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化、代謝產(chǎn)物異常、特定蛋白分子識(shí)別差異等）基因診斷對(duì)患者基因直接分析第4頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三基因診斷定義（概念）：

基因診斷是利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)方法，直接檢測(cè)患者體內(nèi)基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平是否正常，從而對(duì)疾病作出診斷或輔助診斷?；蛟\斷是在DNA/RNA水平檢測(cè)分析基因的存在、結(jié)構(gòu)變異和表達(dá)狀態(tài)，與傳統(tǒng)診斷方法比較有其特點(diǎn)：第5頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三基因診斷的特點(diǎn)：1、病因診斷：直接瞄準(zhǔn)病理基因，不僅對(duì)表型出現(xiàn)的疾病作出診斷，還可能發(fā)現(xiàn)潛在的致病因素，如:確定有遺傳家族史的人攜帶致病基因。2、特異性強(qiáng)、靈敏度高：選用特定基因序列作為探針，單拷貝基因采用高度擴(kuò)增PCR技術(shù)。3、穩(wěn)定性高4、診斷范圍廣，適應(yīng)性強(qiáng)目的基因是否處于活化狀態(tài)均可。樣品可長期保存。可檢測(cè)正在生長的病原體或潛在病原體。（與以疾病表型改變?yōu)橐罁?jù)的診斷技術(shù)相比）第6頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三基因診斷的基本概況：伴隨分子生物學(xué)理論技術(shù)的發(fā)展而建立和發(fā)展。DNA雙螺旋遺傳密碼破譯DNA重組癌基因與抑癌基因研究地中海貧血病基因治療和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體開發(fā)

PCR、分子雜交等一系列技術(shù)發(fā)展第7頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三二、基因診斷的對(duì)象1、病原生物的侵入病原體：病毒、支原體、細(xì)菌、寄生蟲檢查診斷方法：顯微鏡、免疫學(xué)方法、基因診斷等。尤其是當(dāng)無抗體時(shí)，基因診斷成為唯一手段。2、先天遺傳性疾病遺傳性疾病:發(fā)病的原因?yàn)樘囟ɑ虻耐蛔?。?頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三腫瘤的發(fā)生：

發(fā)病機(jī)理尚不請(qǐng)。

初步認(rèn)為是個(gè)別細(xì)胞基因突變而引起的細(xì)胞無限增殖.（包括抑癌基因和癌基因）3、后天基因突變引起的疾病二、基因診斷的對(duì)象第9頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三

（1）用核心順序的串聯(lián)重復(fù)序列組成探針進(jìn)行雜交研究，可同時(shí)檢出具有高度多態(tài)性位點(diǎn)。（2）用southern雜交得到DNA指紋圖譜個(gè)體識(shí)別、親子鑒定、法醫(yī)物證4、其他二、基因診斷的對(duì)象遺傳穩(wěn)定，個(gè)體特異，因而用于法醫(yī)和親子鑒定。第10頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三基因診斷的基本策略：1、檢測(cè)已知的能產(chǎn)生某種特定功能蛋白的基因

這些基因根據(jù)其特定功能已被克隆，并被定位在染色體上，基因序列亦被測(cè)定，致病時(shí)的基因改變亦較清楚。如：已被克隆的病毒、細(xì)菌、霉菌和寄生蟲的基因、與致病有關(guān)的癌基因、抗癌基因、

地中海貧血、苯丙酮尿癥等遺傳病基因。第11頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三2、檢測(cè)與某種遺傳標(biāo)志連鎖的致病基因遺傳連鎖－－同一染色體相鄰的二個(gè)或二個(gè)以上的基因或限制性酶切位點(diǎn)，由于位置十分靠近，在遺傳時(shí)分離幾率很低，常一起遺傳稱連鎖。染色體遺傳連鎖圖－－用限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)作遺傳標(biāo)志，定位與之相連鎖的正常基因與致病基因，建立相應(yīng)的遺傳連鎖圖譜。定位性克?。鶕?jù)遺傳連鎖圖進(jìn)行定位性克隆。比較正常和異?；虻牟顒e，可找出導(dǎo)致遺傳病的分子缺陷。定位性克隆策略是當(dāng)前基因診斷的重要基礎(chǔ)。第12頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三3、檢測(cè)表型克隆基因針對(duì)多基因病（如：重度肥胖、哮喘、高血壓、癲癇、精神病、多種自身免疫性疾病）。表型克隆技術(shù)－－是將有關(guān)表型與基因結(jié)構(gòu)結(jié)合，直接分離該表型的相關(guān)基因，并對(duì)疾病相關(guān)的一組基因進(jìn)行克隆，然后用作多種探針，來診斷多基因遺傳病。該策略既不需預(yù)先知道基因的生化功能或圖譜定位，也不受基因數(shù)目及其相互作用方式的影響。方法：1、DD-RT-PCR：分析正常和異?；蚪M尋找兩者之間的差異序列2、基因組錯(cuò)配篩選技術(shù)：尋找兩者的全同序列，分離、鑒定與疾病相關(guān)的基因，確定導(dǎo)致疾病的分子缺陷第13頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三基因診斷的基本步驟：1、獲得待檢樣品：提取核酸（PCR提高靈敏度)2、制備和標(biāo)記核酸探針3、基因檢測(cè)分析第14頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三三、基因診斷的常用技術(shù)核酸分子雜交聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）限制性片段長度多態(tài)性（RELP）擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）等位基因特異的寡核苷酸（ASO）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）基因芯片第15頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三1、核酸分子雜交原理：利用核酸的變性、復(fù)性及堿基互補(bǔ)的性質(zhì)，用已知基因的核酸序列作探針，與變性后的單鏈基因組DNA/RNA雜交，檢測(cè)核酸樣品中是否存在與探針互補(bǔ)的同源核酸序列，進(jìn)行DNA或RNA定性定量分析?；驒z驗(yàn)的兩個(gè)必要條件：1、必需的特異探針（標(biāo)記的）2、必需的基因組DNA第16頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三核酸分子雜交－－核酸印跡雜交DNA印跡雜交（Southernblot）RNA印跡雜交（Nouthernblot）斑點(diǎn)印跡雜交（Dot-blot）原位雜交(situhybridization)第17頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三核酸印跡雜交基本過程：提取DNA或RNA→酶切→凝膠電泳→膠變

性處理（DNA）→轉(zhuǎn)印核酸片段到NC膜上。

（RNA可直接用變性膠電泳，轉(zhuǎn)膜）1、制備樣品：第18頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三核酸印跡雜交基本過程：（2）制備探針：探針：一段能和待檢測(cè)核酸分子按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則而結(jié)合的核酸分子片段。探針需要標(biāo)記可直接檢測(cè)的元素或分子。

如：同位素、熒光、生物素等第19頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三核酸印跡雜交基本過程：核酸印跡雜交可檢測(cè)pg水平的靶分子（4）檢測(cè)：方法依標(biāo)記的探針而不同*放射性同位素*生物素*地高辛*熒光素（3）雜交：預(yù)雜交－－封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)雜交－－探針與核酸分子結(jié)合第20頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三核酸印跡雜交基本過程：第21頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三2、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)原理：以待擴(kuò)增DNA為模板，在互補(bǔ)模板兩端序列的寡核苷酸引物介導(dǎo)下，通過耐高溫DNA聚合酶催化下，按半保留復(fù)制機(jī)制延模板鏈延伸，快速、特異地?cái)U(kuò)增特定的DNA。一種體外模擬自然DNA復(fù)制過程的核酸擴(kuò)增技術(shù)。（無細(xì)胞分子克隆技術(shù)）。第22頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三耐高溫DNA聚合酶－－－Taq酶寡核苷酸引物：設(shè)計(jì)引物和確定退火溫度是PCR

成功的關(guān)鍵。PCR的基本過程：（循環(huán)程序）變性（95℃）→退火（55℃－65℃）→延伸（72℃）3～5分40’’～1分100bp/1分源自水棲高溫菌，最適反應(yīng)溫度為72℃，且經(jīng)90℃以上加溫后仍可在溫度恢復(fù)后復(fù)性。第23頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三（呈2n擴(kuò)增速度）PCR基本過程和原理特點(diǎn)：特異性強(qiáng)靈敏度高樣品可以是：毛發(fā)、血痕單細(xì)胞、病原體、腫瘤殘留物、犯罪現(xiàn)場(chǎng)遺留物第24頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三基因診斷中常用的PCR技術(shù)：（1）、DNAPCR：（2）、RT-PCR：以DNA為模板，擴(kuò)增特定核苷酸序列。用于檢測(cè)特定基因片段的存在，分析鑒定基因突變。以總RNA或mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后擴(kuò)增。用于檢測(cè)特定基因表達(dá)水平的主要方法之一。（3）、PCR-SSCP：檢測(cè)基因未知突變的常用技術(shù)。簡(jiǎn)單、快捷、靈敏。第25頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三（4）、多重PCR：指在一次PCR反應(yīng)中加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增DNA序列上不同序列片段的一種PCR技術(shù)。用于一些“超大”基因中大片段缺失分析。（5）、原位PCR：直接用組織切片和細(xì)胞進(jìn)行PCR或RT-PCR，在組織、細(xì)胞原位檢測(cè)單拷貝或低拷貝的特點(diǎn)基因序列。（6）、實(shí)時(shí)定量PCR：借助特異性結(jié)合DNA的熒光染料，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)PCR擴(kuò)增的DNA量的變化。第26頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三其他重要的PCR衍生技術(shù)反向PCR（IPCR）標(biāo)記引物PCR（labelledprimersPCR）錨定PCR（anchoredPCR）差異展示PCR（DD-PCR）（見書“分子生物學(xué)技術(shù)”章節(jié)）第27頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三3、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）檢出方法：Southern印跡概念：用同一限制性內(nèi)切酶完全切割同一物種的不同個(gè)體的基因組DNA，出現(xiàn)分子質(zhì)量不同的同源片段，這種由限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)變化導(dǎo)致的DNA片段差異，稱限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）。人類基因組中由中性突變導(dǎo)致個(gè)體間核苷酸的差異稱－－DNA多態(tài)性第28頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三RFLP類型：2、由于鏈內(nèi)發(fā)生較大片段的缺失、重復(fù)、插入和重排導(dǎo)致DNA順序的變化，因而酶切片段改變－－－序列多態(tài)性。1、單個(gè)堿基的突變引起酶切位點(diǎn)的變化－－－點(diǎn)多態(tài)性致病基因附近或內(nèi)部一般存在RFLP,可用于連鎖分析的基因診斷。第29頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三（四）擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）

應(yīng)用于基因突變性質(zhì)不明的連鎖分析。AFLP－－串聯(lián)重復(fù)的短片段的長度多態(tài)性通過PCR擴(kuò)增,經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后電泳,產(chǎn)生顯示擴(kuò)增片段多態(tài)性。第30頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三AFLP原理：首先利用可產(chǎn)生粘性末端的限制性內(nèi)切酶酶切研究對(duì)象的基因組序列，產(chǎn)生不同長度的酶切片段。然后，將這些酶切片段與含有與其有共同粘性末段的人工接頭連接，形成模板。為達(dá)到選擇性擴(kuò)增的目的，再在模板末端添加具有選擇性核苷酸（1～3個(gè)）的不同引物，然后PCR擴(kuò)增，結(jié)果只有那些兩端序列與選擇性核苷酸配對(duì)的酶切片段被擴(kuò)增。最后將被擴(kuò)增的片段在高分辨率的測(cè)序凝膠上電泳，這樣其多態(tài)性即根據(jù)擴(kuò)增片段的長度與數(shù)量的不同而被分開。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物即等位片段之間差別只有幾個(gè)bp。第31頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三5、等位基因特異的寡核苷酸（ASO）方法：1、合成兩種探針：①已知突變位點(diǎn)的核苷酸序列（M）

②正?；驂A基序列（N）2、雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果：M+N-受檢者是突變基因的純合子M-N+受檢者是不存在突變基因M-N-受檢者的缺陷基因可能是一種新的突變類型M+N+受檢者是突變基因的雜合子原理：

已知基因突變部位和性質(zhì)，合成基因特異的核苷酸探針（20bp），標(biāo)記后與受檢者DNA雜交診斷。（可與PCR聯(lián)用：PCR-ASO）第32頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三6、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）日本Orita等研究發(fā)現(xiàn)，單鏈DNA片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，當(dāng)有一個(gè)堿基發(fā)生改變時(shí)，會(huì)或多或少地影響其空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變，空間構(gòu)象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻大小不同.因此，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，可以非常敏銳地將構(gòu)象上有差異的分子分離開.PCR-SSCP第33頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三PCR-SSCP基本過程①PCR擴(kuò)增靶DNA②將特異的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性后快速復(fù)性;③將單鏈DNA進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳;④通過放射性自顯影、銀染或溴化乙錠顯色分析結(jié)果.若發(fā)現(xiàn)單鏈DNA帶遷移率與正常對(duì)照的相比發(fā)生改變，就可以判定該鏈構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而推斷該DNA片段中有堿基突變.第34頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三7、基因芯片

將指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)根據(jù)雜交分子和未雜交分子信號(hào)的強(qiáng)弱進(jìn)而判斷樣品中靶分子的數(shù)量?；驹恚海ㄉ锛赡ＦNA陣列、或寡核苷酸微芯片）第35頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三基因芯片技術(shù)：第36頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三目的：檢測(cè)外源性基因的侵入目標(biāo)：1、微生物2、病毒如：HIV（致艾滋病AIDS）3、寄生蟲、4、不易體外培養(yǎng)的病原體（毒性大腸桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌）5、實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的病原體（克立氏體）四、基因診斷的臨床應(yīng)用:1、在感染性疾病檢測(cè)中應(yīng)用第37頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三艾滋病與HIV病毒艾滋病由HIV通過接觸、血液、血制品及母嬰傳播感染所致。HIV特異地侵犯輔助性T細(xì)胞（CD4），引起人體細(xì)胞免疫嚴(yán)重缺陷，導(dǎo)致頑固的機(jī)會(huì)性感染，惡性腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)損傷。HIV感染后，95%感染者5個(gè)月可檢出抗體（也有3-4年仍不能檢出抗體）。有必要進(jìn)行PCR技術(shù)檢測(cè)。第38頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三艾滋病與HIV病毒檢測(cè)技術(shù)：巢式-PCR、Southern、DNA序列分析引物的設(shè)計(jì)：應(yīng)在保守區(qū)（基因：pol,env,gag,tat)病毒特點(diǎn)：HIV病毒由兩條單鏈RNA組成，9.7k/RNA，主要基因結(jié)構(gòu)和組成形成與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒相同，但較之復(fù)雜，故稱復(fù)雜反轉(zhuǎn)錄病毒HIV屬反轉(zhuǎn)錄病毒－－－即單鏈RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA，進(jìn)入宿主細(xì)胞染色體。第39頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三非典型性肺炎（SARS）由一種新型冠狀病毒（SARS-CoV）引起，多種途徑傳播，傳染性強(qiáng)、高致死率的急性疾病。診斷依靠：流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)、放射診斷、血清學(xué)（熒光免疫、ELISA）PCR作為一種靈敏的早期病原學(xué)診斷必不可少（關(guān)鍵是引物的合成）第40頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三2、在遺傳病檢測(cè)中的應(yīng)用

產(chǎn)前診斷檢測(cè)妊娠8－12周的絨毛DNA或羊水細(xì)胞

PCR診斷一系列遺傳疾病鐮刀狀細(xì)胞貧血的診斷方法：－RFLP診斷

MstⅡ酶切識(shí)別序列：CCTNAGG切割正常β鏈序列：CCTGAGG不切割突變序列：CCTGTGG

－ASO探針診斷第41頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三3、在腫瘤檢測(cè)中的應(yīng)用原癌基因生物正常細(xì)胞基因中編碼關(guān)鍵性調(diào)控蛋白的癌基因抑癌基因一類抑制細(xì)胞增殖的基因，其失活可引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化。兩類基因協(xié)同調(diào)控，使細(xì)胞生長處于平衡狀態(tài)。第42頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三癌基因激活變化及檢測(cè)：1、基因擴(kuò)增：即染色體某區(qū)段基因拷貝數(shù)增加，或癌基因的擴(kuò)增。檢測(cè)方法：Southern雜交定量PCR2、基因的過量表達(dá)：包括基因擴(kuò)增基礎(chǔ)上的過量表達(dá)及非

DNA水平的過量表達(dá)。檢測(cè)方法：Northern雜交RT-PCR3、點(diǎn)突變：檢測(cè)方法為各種基于PCR的方法。第43頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三抑癌基因的檢測(cè)：SouthernPCR大片段的缺失、和點(diǎn)突變*兩個(gè)等位抑癌基因突變才能引起腫瘤，需檢出兩個(gè)等位抑癌基因。方法：RFLP結(jié)合PCR，進(jìn)行缺失檢測(cè)

點(diǎn)突變主要采用PCR第44頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三腫瘤標(biāo)志物：指特征性存在于惡性腫瘤或由惡性腫瘤細(xì)胞異常產(chǎn)生的物質(zhì)或宿主對(duì)腫瘤反應(yīng)而產(chǎn)生的物質(zhì)。（1）酶類腫瘤標(biāo)志物（2）激素類標(biāo)志物（3）胚胎抗原（4）特殊蛋白標(biāo)志物（5）糖蛋白類抗原（6）血中癌基因蛋白（7）唾液酸和唾液酸?；D(zhuǎn)移酶（8）多胺免疫組化篩選提高檢出率第45頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三法醫(yī)學(xué)鑒定針對(duì)人類DNA遺傳差異進(jìn)行的個(gè)體識(shí)別和親子鑒定。常用技術(shù):DNA指紋分析（VNTR）短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）遺傳特征分析PCR-擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AmP-FLP)PCR-mtDNA技術(shù)根據(jù)可變串聯(lián)重復(fù)序列（小衛(wèi)星DNA）多態(tài)性

高度的個(gè)體特異性第46頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三DNA指紋（圖譜）分析：⑴、選擇核心序列作探針，選在核心序列上無切割位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶，酶解樣品，Southernblot得到DNA指紋圖譜。針對(duì)可變串聯(lián)重復(fù)序列（VNTR）（VNTR是判斷個(gè)體的遺傳標(biāo)志）⑵、針對(duì)VNTR側(cè)翼保守區(qū)序列設(shè)計(jì)探針，用PCR

對(duì)該區(qū)擴(kuò)增，電泳得到個(gè)體之間長度不同的條帶圖譜。（VNTR片段較長PCR不易擴(kuò)增）。第47頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)基因治療（genetherapuy)概念：

將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因缺陷和異?；蛞鸬募膊?，達(dá)到治療目的。導(dǎo)入的基因可以與缺陷基因?qū)?yīng)、在體內(nèi)表達(dá)具有特異功能的同源基因、也可以是與缺陷基因無關(guān)的治療基因。概念的擴(kuò)展：凡是采用分子生物學(xué)方法原理，將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，達(dá)到治療目的的方法，都可稱為基因治療。第48頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三基因治療策略:總原則：－－直接補(bǔ)替缺陷基因－－抑制非正常基因產(chǎn)物表達(dá)－－間接調(diào)節(jié)機(jī)體本身免疫系統(tǒng)的抗病能力。－－利用外源基因?qū)Σ∽兗?xì)胞造成特異性殺傷第49頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三1、基因矯正－－將致病基因的堿基進(jìn)行糾正，而正常部分予以保留。2、基因置換－－用正?；蛲ㄟ^體內(nèi)基因同源重組，原位置換病變細(xì)胞內(nèi)的致病基因，使細(xì)胞內(nèi)的DNA完全恢復(fù)正常3、基因增補(bǔ)－－將目的基因?qū)氩∽兗?xì)胞或其它細(xì)胞，不去除異?；?，而是通過目的基因的非定點(diǎn)整合，使其表達(dá)產(chǎn)物補(bǔ)償缺陷基因的功能或使原有功能得以加強(qiáng)。4、基因失活－－利用反義技術(shù)特異封閉基因表達(dá)，抑制有害基因的表達(dá)。5、免疫調(diào)節(jié)－－將抗體、抗原或細(xì)胞因子的基因?qū)氩∪梭w內(nèi)，改變病人免疫狀態(tài)，達(dá)到預(yù)防和治療的目的。基因治療的策略：第50頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三6、調(diào)節(jié)性基因治療：導(dǎo)入編碼調(diào)控蛋白的基因，治療基因表答異常的疾病7、化療保護(hù)性基因治療：導(dǎo)入單相或多相細(xì)胞毒性藥物的抗性基因，使正常細(xì)胞耐受化療藥物的能力大大提高。8、特異性細(xì)胞殺傷性基因治療：利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建特異性殺傷靶細(xì)胞為目標(biāo)的“奇異彈頭”，“彈頭”部分是分子重組的各種生物細(xì)胞毒素，它們以酶催化方式發(fā)揮抑制蛋白合成作用，造成細(xì)胞殺傷。9、生殖細(xì)胞基因治療：生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞補(bǔ)償性治療第51頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三基因治療基本程序;方法：1、體外法（exvivo):2、體內(nèi)法

(invivo):將受體細(xì)胞在體外培養(yǎng)，轉(zhuǎn)入外源基因，經(jīng)適當(dāng)選擇系統(tǒng)，將重組的受體細(xì)胞回輸患者體內(nèi)，以改善癥狀。（普遍采用）直接將外源基因?qū)塍w內(nèi)有關(guān)的組織器官,使其進(jìn)入相應(yīng)的細(xì)胞并轉(zhuǎn)錄、表達(dá)而發(fā)揮治療作用?；境绦颍哼x擇目的基因選擇基因載體選擇靶細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移外源基因表達(dá)及檢測(cè)回輸體內(nèi)第52頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三治療基因的來源：1、野生型基因：

單基因缺陷遺傳病基因

反義核酸封閉活化的原癌基因

轉(zhuǎn)入相關(guān)的抑癌基因，抑制腫瘤2、重組DNA和分子克隆技術(shù)，人工合成特異基因。1、選擇治療的目的基因第53頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三用于基因治療的基因應(yīng)滿足以下條件：（1）體內(nèi)僅少量表達(dá)就可顯著改善癥狀。（2）該基因的過量表達(dá)不會(huì)對(duì)機(jī)體造成危害、（3）在抗病毒和抗病原體的基因治療中，所選擇的靶基因應(yīng)在病毒和病原體的生活史中起重要作用，并且該序列是特異的。第54頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三理想的載體具有以下特征：1、容易生產(chǎn)

商業(yè)化生產(chǎn)，廣泛應(yīng)用，易運(yùn)輸，易保存2、持續(xù)表達(dá)

一旦轉(zhuǎn)入體內(nèi)，應(yīng)能在一定時(shí)間內(nèi)持續(xù)表達(dá)基因產(chǎn)物，或能通過某種方法精細(xì)調(diào)節(jié)其表達(dá)。3、弱免疫源

轉(zhuǎn)入后不應(yīng)引起免疫反應(yīng)。4、組織靶向性

定向輸入某種細(xì)胞。5、包裝容量載體對(duì)轉(zhuǎn)染基因的大小應(yīng)沒有限制。6、復(fù)制、分裂和整合能力：特異性定位整合，或以游離基因形式存在于細(xì)胞核內(nèi)。7、能感染分裂期細(xì)胞和未分裂期細(xì)胞2、選擇基因載體：第55頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三基因載體：非病毒載體（裸DNA、脂質(zhì)體）

病毒載體

（反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒）分類：優(yōu)點(diǎn)：大量生產(chǎn)，毒性小，低免疫性缺點(diǎn)：效率低。優(yōu)點(diǎn)：多數(shù)病毒可感染特異細(xì)胞，不易降解，

RNA病毒能整合到宿主染色體，表達(dá)水平高等。第56頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移1、逆轉(zhuǎn)錄病毒：正鏈RNA病毒第57頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu):基因組組成：（1）5’－帽子；3’－尾巴；（2）每個(gè)單鏈RNA含6個(gè)區(qū)：5’-LTR（長末端重復(fù)序列）

Ψ+（組裝所需的非編碼序列）gag（編碼衣殼結(jié)構(gòu)蛋白基因）pol（編碼反轉(zhuǎn)錄酶基因）env（編碼外殼蛋白基因）3’-LTR第58頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三逆轉(zhuǎn)錄病毒生活周期:1、感染靶細(xì)胞2、利用自身編碼的逆反轉(zhuǎn)錄酶，以RNA為模板合成DNA。3、將病毒DNA轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主細(xì)胞核4、病毒DNA整合到宿主染色體5、以病毒DNA為模板轉(zhuǎn)錄RNA6、在細(xì)胞中翻譯Gag、Pol和Env蛋白7、形成衣殼，RNA單鏈和反轉(zhuǎn)錄酶一起包裝進(jìn)衣殼。8、形成病毒顆粒并分泌到胞外。第59頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三逆轉(zhuǎn)錄病毒病毒RNA宿主細(xì)胞RTRT逆轉(zhuǎn)錄酶cDNA雙鏈插入基因組DNA逆轉(zhuǎn)錄病毒感染過程病毒RNA第60頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體：（1）構(gòu)建重組野生性病毒：插入相關(guān)外源基因，改造成DNA載體（包括插入選擇性標(biāo)記），替代病毒的編碼基因。（2）制備輔助細(xì)胞（293T細(xì)胞），為載體DNA提供其喪失的功能。（3）載體DNA導(dǎo)入輔助細(xì)胞，產(chǎn)生病毒載體。（4）用病毒載體感染細(xì)胞，外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)。第61頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的缺陷：1、只能轉(zhuǎn)染處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞2、所攜帶的外源基因不能太大。3、感染依賴靶細(xì)胞表面受體的限制4、理論上不擴(kuò)散其它細(xì)胞，但某些情況會(huì)造成野生型病毒爆發(fā)。5、有致細(xì)胞癌變的可能。6、逆轉(zhuǎn)錄病毒不能耐受純化和濃縮過程。第62頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三腺相關(guān)病毒(AVV)一種小的、非致病的、單鏈DNA病毒。是從屬病毒，需要其他基因才能復(fù)制。結(jié)構(gòu)：rep基因－－編碼病毒的復(fù)制、整合功能所需蛋白

cap基因－－編碼病毒結(jié)構(gòu)組分

ITRs序列－－反向末端重復(fù)，定義基因的開始和結(jié)束，制約DNA序列大小，包裹入衣殼。細(xì)胞對(duì)AVV病毒的親和力高，AVV載體適用范圍廣泛。第63頁，共73頁，2023年，2月20日，星期三骨髓細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肌細(xì)胞選擇原則:1、較堅(jiān)固，耐受處理，易于由人體分離，便于輸回體內(nèi)。2、具有增殖優(yōu)勢(shì)，生命周期長，能存活幾個(gè)月或幾年，至病人的整個(gè)生命。3、易于受外源遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。4、在選用病毒載體時(shí)，目的基因具表達(dá)最好具有組織特異性的細(xì)胞3、選擇靶細(xì)胞（禁止使用生殖細(xì)胞，只能用體細(xì)胞）第64頁，共73頁，2023年，2月20日，星期