重組人神經生長因子的表達及其應用,神經生物學論文

重組人神經生長因子的表達及其應用,神經生物學論文神經生長因子〔Nervegrowthfactor,NGF〕是神經系統(tǒng)非常重要的生物活性分子之一，對調節(jié)神經元的生長、發(fā)育、分化、存活及損傷神經的再生修復具有重要作用和臨床意義[1-2].當前的基礎研究表示清楚NGF可應用于神經中毒、周圍神經損傷、糖尿病性周圍神經病變、老年性癡呆病、帕金森氏病、面神經炎以及神經損傷〔包括脊髓損傷、高位截癱、斷指再植和腦損傷等中樞及外圍神經系統(tǒng)的損傷〕等神經系統(tǒng)疾病，是當前唯一可應用于臨床的神經系統(tǒng)蛋白質因子。NGF從早期發(fā)現(xiàn)到醫(yī)學應用的歷史經過，已逾半個世紀。人神經生長因子〔Humannervegrowthfactor,hNGF〕是在人體中發(fā)現(xiàn)的一種對正常神經細胞有營養(yǎng)作用，對損傷神經修復機能有調節(jié)作用的生物活性因子，它可維持交感神經和感覺神經的生存，促進神經細胞的分化，決定軸突的伸展方向，對促進大腦的發(fā)育、神經系統(tǒng)的生長、損傷神經的再生和功能恢復具有決定性作用。1神經生長因子NGF的構造和其應用當前NGF已經被廣泛應用于臨床醫(yī)學中，對于治療正己烷中毒性周圍神經病、視神經視網膜損傷等的藥效已經得到確認；在糖尿病周圍神經病變、面癱等領域的應用尚在臨床研究階段，由于試驗數(shù)量及質量等諸多因素的影響，其效果有待綜合評估[3];這些研究成果是在基礎研究的產品開發(fā)上建立的。1.1NGF的構造NGF基因轉錄生成NGFmR-NA,mRNA翻譯后先合成NGF的前體蛋白[4].前體蛋白包括長的、短的兩種前體蛋白，即7SNGF和2.5SNGF.短的前體蛋白水解加工成2.5NGF,為通常所指的NGF,整個NGF的生物活性全依靠亞單位。長的前體蛋白水解加工后為7SNGF,是22三種亞單位的復合體，相對分子質量為140000左右。當前雄性小鼠頜下腺是純化NGF和分析其生物活性的主要供體。以22形式存在完好的hNGF分子由1個亞單位、2個亞單位和2個亞單位以非共價鍵結合而成，分子中還有2個Zn2+,旨在加強復合體的穩(wěn)定性。亞單位由兩個一樣肽鏈組成，每個肽鏈含118個氨基酸殘基，相對分子質量為26518,pI為9.3,通過非共價鍵結合構成二聚體。有二硫鍵存在于6個半胱氨基酸殘基之間，對維持NGF的生物活性特別重要；一旦二硫鍵被毀壞，NGF的生物活性將全部喪失。rhNGF的三維構造圖見圖1.NGF是由兩個具有活性形式的雙體平行亞單位通過一個平面軸組成，兩個單體的接觸面是疏水的，通過分布于三個部分的氨基酸殘基，二硫鍵組成NGF單體的疏水核心，rhNGF的平面構造圖見圖2.近年來人們對NGF構造與神經損傷相關部位的成效有了更廣泛深切進入的研究和認識。如NGF基因變異的影響[5]、NGF的信號傳遞途徑[6]、NGF在炎癥疼痛及修復經過中的作用[7]、NGF之間的協(xié)同作用[8]、NGF的基因表示出影響因子[9]、NGF與受體之間的互相作用[10]、NGF及受體在腫瘤的構成和腫瘤疼痛中的角色[11]、人工神經支架的改進試驗[12]以及結合神經生長因子各種載體的基因表示出[13]等等方面都開展了研究。隨著對NGF功能的了解，對該類藥物及NGF拮抗劑藥物[14]用于治療某些慢性疾病或者疼痛也進行了很多試驗和探尋求索，但將這些理論成果最終應用于臨床，仍有待時日。1.2鼠神經生長因子的開發(fā)當前NGF的上市產品主要由小鼠的頜下腺提取獲得，而雄性小鼠頜下腺是純化NGF和分析其生物活性的主要供體。從頜下腺勻漿中，以離子交換色譜分析法，在中性酸堿度條件下，能夠分離出NGF.2002年首個小鼠頜下腺提取的NGF獲得新藥證書；2003年武漢海特生物制藥股份有限公司〔與武漢大學醫(yī)學院聯(lián)合開發(fā)注射用鼠神經生長因子〕獲得試生產批文；2006年廈門北大之路生物工程有限公司〔與蘭州生物制品研究所有限責任公司聯(lián)合開發(fā)注射用鼠神經生長因子〕獲得了SFDA頒發(fā)的生產批文，商品名為恩經復同年SFDA也批準了武漢海特生物制藥股份有限公司的注射用鼠生長因子和舒泰神〔北京〕藥業(yè)的30g注射用鼠神經生長因子生產，分別以金路捷和蘇肽生上市；2018年麗珠基團研制的麗康樂獲批生產。當前注射用鼠神經生長因子主要應用的臨床適應證有中毒性周圍神經損傷、外傷性周圍神經損傷、糖尿病性周圍神經損傷、面神經炎、中小面積燒傷和瘢痕整形術中周圍神經損傷、本身免疫性周圍神經損傷、帕金森綜合癥等，近年來也開展了更多的適應證和給藥方式的臨床研究試驗，如對前部缺血性視神經病變患者的綜合治療[15]、對腦卒中患者的穴位注射試驗[16]、聯(lián)合電腦中頻對面神經炎患者的治療[17]、治療腰椎間盤突出癥[18]等等。2重組人神經生長因子的表示出及其應用重組人神經生長因子〔rhNGF〕的研發(fā)在國外已有二十年之久，國內外學者對其表示出體系進行太多種研究，但在產品的純化和表征方面還有很多問題，當前該研究領域主要集中在高水平表示出和有效適應證的應用兩個方面。2.1重組人神經生長因子〔rhNGF〕的表示出hNGF分子的亞基可完全表現(xiàn)NGF的生物學活性，經序列分析發(fā)現(xiàn)其N端含有較多的大腸桿菌稀有密碼子編碼的殘基，因而通常原核系統(tǒng)表示出hNGF亞基只能得到低表示出的低活性蛋白。怎樣通過原核或真核表示出系統(tǒng)獲得高表示出、高生物活性的hNGF是人們一直關注和研究的問題。姜靜等[19]等致力于將E.coli體系包容體表示出和體外復性后的rhNGF-與CHO表示出系統(tǒng)分泌的rhNGF-比擬，以為兩者具有一致的理化性質和生物學活性，HPLC純度均大于95%、生物學比活不低于1.8U/ng,顯示E.coli表示出體系可生產質量均一、生物學活性高的rhNGF-。王革等構建了表示出質粒pPIC9K/rhNGF,轉化畢赤酵母，得到高表示出、高外泌的工程菌，并確定了純化步驟，經疏水層析和陽離子交換層析純化后，獲得活性、純度較高的rhNGF.電泳結果顯示，工程菌表示出分泌的rhNGF量約為50mg/L,約占外泌蛋白的50%,活性測定結果表示清楚，分泌蛋白的活性約為104U/mL.樂偉等[21]構建了高表示出rhNGF的CHO-DG44單克隆細胞株。經過兩步法純化獲得了純度大于98%的精制rhNGF制品，單克隆細胞株在最佳收獲時重組人神經生長因子表示出水平能夠到達50mg/L以上。陳勇等[22]在CHO細胞表示出二氫葉酸復原酶〔DHFR〕基因及人神經生長因子亞基〔-hNGF〕基因，并對表示出產物進行鑒定和生物活性分析。結果顯示人神經生長因子在CHO細胞中得到較高表示出，表示出量達0.13g/mL,且表示出產物具有良好的生物學活性。李佳楠等[23]構建的rh-NGF桿狀病毒表示出質粒，是利用脂質體cellfectionⅡ將質粒轉染至昆蟲細胞Sf9中，用轉染細胞的上清反復感染Sf9細胞，大量收獲含目的蛋白的培養(yǎng)上清，應用離子交換層析和分子篩層析純化rh-NGF,證實重組病毒感染的Sf9細胞可表示出rh-NGF;純化的rh-NGF蛋白經SDS分析，可見相對分子質量約14200的單一條帶，純度大于98%,能與兔抗人NGF單克隆抗體特異性結合，并能刺激神經節(jié)突起生長，其比活性約為0.6U/ng,在昆蟲細胞中表示出了有生物學活性的rh-NGF.Xiao等[24]嘗試將含整合rhNGF基因的腺病毒分別直接注入到山羊和兔的乳腺中，在羊和兔奶中都檢測到rhNGF,其最大含量分別達196.8mg/L、346.0mg/L,實驗者以為這是一條利用哺乳動物大量生產rhNGF的可能途徑。Fan等[25]在兔骨髓間充質干細胞中表示出了rhNGF,其最大表示出量達126.8pg/106cells,且有較好的生物學活性。He等[26]使用全基因合成的方式方法，選擇E.coli偏愛的密碼子，合成得到了的rhNGFcDNA,將所獲cDNA插入表示出載體pthioHisA,得到rhNGF工程菌。rhNGF表示出水平占菌體總蛋白的10%~20%,并且使用了thioredoxin催化rhNGF復性的創(chuàng)新工藝，將產物分泌、切割、純化，得到了天然生物學活性正確折疊的rhNGF.姜靜等[19]以為，比擬而言，哺乳動物表示出系統(tǒng)的CHO具有分泌正確裝配、折疊與糖基化等特點，其缺點是表示出量低、生產周期長，成本高；而E.coli生產周期短、成本低、易線性放大、表示出產物以不溶性包容體存在，若突破包容體重折疊瓶頸獲得構象均一產物將是規(guī)模化生產的首選方式。2.2重組人神經生長因子〔rhNGF〕的應用美國RD等多家公司已有規(guī)?；a的rhNGF及rhNGF-ELISA檢測試劑盒，近年來國內也有不少生物技術及醫(yī)藥公司生產rhNGF檢測試劑盒，但均標明僅供科研之用。當前全球很多科學家對rhNGF進行過動物藥效學和人體臨床試驗，如Stuart等[27]1997-1999年對糖尿病性多神經病患者的療效和安全性進行了隨機對照試驗，實驗模型和II期臨床試驗的結果均顯示了rhNGF治療外周神經病變的療效，雖因III期臨床試驗沒有能證明rhNGF治療糖尿病性多神經病具有顯著有益的效果，后期主要是引發(fā)視網膜退化的加劇而終止了臨床試驗，但在治療糖尿病周圍神經病變的臨床試驗中，rhNGF還是當前唯一被應用的神經營養(yǎng)因子。Ferrari等[28]應用rhNGF的滴眼液梯度劑量法進行的安全性和藥代動力學雙盲隨機臨床試驗，結果表示清楚該滴眼液的耐受性較好，無不良反響，為rhNGF在眼科的應用奠定了基礎。Li等[29]采取rhNGF腺病毒注射的方式對神經壓傷受損的小鼠進行的rhNGF基因轉移試驗表示清楚，rhNGF能夠促進神經細胞的再生，與Pa-gani等[30]的類似試驗所得出的結果基本一樣。Lapchak等[31]進行過一系列關于rhNGF增加突觸前神經元損傷、中樞神經元損傷后膽堿功能及對治療阿爾茨海默癥的影響研究；Gu等[32]的小鼠模型試驗結果表示清楚，攜帶rhNGF的微球是治療阿爾茨海默病〔Alzheimersdisease,AD〕的一條有效途徑。戚其學等[33]采用腦內給予rhNGF對阿爾茨海默病模型鼠進行治療，結果發(fā)現(xiàn)治療后，AD模型鼠的大腦額葉、基底節(jié)和海馬ChAT活性比未給予rhNGF治療的對照組有明顯升高，神經元凋亡的發(fā)生也明顯減少，因而以為，rhNGF在AD模型鼠中主要起到恢復病變區(qū)膽堿能神經活性，及減少神經元凋亡的作用。3瞻望從鼠源的NGF的臨床使用情況來看，除了注射部位疼痛為常見的副作用外，還偶見蕁麻疹、偶至結膜充血或轉氨酶升高等。其重要原因是小鼠頜下腺提取獲得的NGF由于原料問題，可能一定程度限制了最終蛋白純度和比活性，現(xiàn)有的上市藥品鼠源NGF中較高標準為蛋白純度〔98%〕、比活性〔22.5萬AU/mg蛋白〕。出于對鼠源異質抗原性和病毒污染可能性的考量，當前美國和歐洲等發(fā)達國家和地區(qū)都不允許用動物組織提取的成分直接作為人用生物制品治療性藥品，這使人們最終會轉向使用基因工程手段生產NGF.固然當前原核和真核系統(tǒng)表示出的rhNGF亞基這兩種方式方法都存在產量低、成本高、制備工藝不易產業(yè)化等問題，但用基因工程的方式方法生產rhNGF還是備選方案之一。王妍[4]以為當前rhNGF未在世界上市，可能主要有下面幾個原因：①開發(fā)難度大。NGF獨特的蛋白質空間構造及與其活性之間的關系，使得現(xiàn)有的表示出系統(tǒng)暫時還難于保證其穩(wěn)定高效的表示出，阻礙其快速產業(yè)化的進程；②用藥的途徑和方式以及評價標準一直得不到徹底解決；③適應證的有效性驗證和安全性評估復雜。綜上所述，將來有關NGF的研究及應用發(fā)展可能主要在如下幾個方向：①深切進入開展對鼠源NGF的臨床應用研究。隨著我們國家注射用鼠源NGF在臨床病例使用中的增加，對其總體使用情況有必要開展全面系統(tǒng)的比擬分析。根據(jù)臨床病癥類型、年齡、給藥方式、治愈程度等進行統(tǒng)計，采用計算機軟件等多種技術手段，綜合評估使用鼠源NGF的治療效果和其產生的不良反響。在試驗研究基礎上，不斷改良給藥方式，開展綜合治療。在rhNGF上市之前，鼠源NGF還有很大的應用空間；②隨著基因工程制備rhNGF的技術工藝逐步的成熟，最終到達規(guī)?；a水平。rhNGF因其化學本質和分子構造具有更高層次同源性，且