豬胃腸道微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性分析,微生物論文

豬胃腸道微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性分析,微生物論文內(nèi)容摘要：我們國(guó)家作為畜牧業(yè)大國(guó),正在經(jīng)歷養(yǎng)殖動(dòng)物健康和畜產(chǎn)品質(zhì)量的升級(jí)。調(diào)節(jié)腸道菌群被以為是能夠減少動(dòng)物疾病的發(fā)生、提高飼料轉(zhuǎn)化率及控制抗生素不當(dāng)使用的有效手段。文章綜述了微生物組技術(shù)在豬腸道微生物研究中的應(yīng)用,相信這些基礎(chǔ)研究成果對(duì)實(shí)際生產(chǎn)養(yǎng)殖會(huì)產(chǎn)生有益的指導(dǎo),并進(jìn)一步促進(jìn)精準(zhǔn)畜牧的發(fā)展和我們國(guó)家養(yǎng)殖業(yè)的總體水平的提高。本文關(guān)鍵詞語(yǔ)：微生物組;豬;腸道微生物;豬是我們國(guó)家畜牧業(yè)生產(chǎn)的重要組成部分,建立合適開(kāi)展豬胃腸道微生物組研究的技術(shù)體系,系統(tǒng)深切進(jìn)入揭示品種(遺傳型)、飼養(yǎng)管理對(duì)胃腸道微生物組成和代謝的影響及途徑,研究胃腸道微生物與宿主的互作機(jī)制,研發(fā)能夠提高飼料資源轉(zhuǎn)化利用效率和生產(chǎn)性能、加強(qiáng)胃腸道功能與宿主健康、提升養(yǎng)殖環(huán)境質(zhì)量、改善肉產(chǎn)品品質(zhì)的微生物組應(yīng)用技術(shù),能顯著降低或者消除抗生素使用量促進(jìn)生態(tài)養(yǎng)殖,整體提升我們國(guó)家畜禽養(yǎng)殖科技水平,顯著提高我們國(guó)家畜禽養(yǎng)殖效益、保障畜禽產(chǎn)品安全、改善生態(tài)環(huán)境、促進(jìn)人類健康。1微生物組微生物組是指一個(gè)特定環(huán)境或者生態(tài)系統(tǒng)中全部微生物及其遺傳信息,包括其細(xì)胞群體和數(shù)量、全部遺傳物質(zhì)(基因組),它界定了涵蓋微生物群及其全部遺傳與生理功能,其包括了微生物與其環(huán)境和宿主的互相作用。2微生物組的研究方式方法微生物遍布于人體所有與外環(huán)境相通器官,尤以腸道微生物數(shù)量諸多,對(duì)人體有著非常重要的生理意義。但因其種類繁多、體型微小,增加了對(duì)其全面、深切進(jìn)入認(rèn)識(shí)的難度。隨著分子生物學(xué)、基因組學(xué)、生物信息學(xué)等學(xué)科的興起,大大促進(jìn)了微生物組研究技術(shù)的發(fā)展。微生物組研究的重點(diǎn):一是多樣性,包括分離、鑒定種類及定量;二是活性,即微生物在其所處環(huán)境中起何種功能作用。圍繞這一主題,微生物組研究方式方法可概括為傳統(tǒng)檢測(cè)方式方法、構(gòu)建基因文庫(kù)法、遺傳指紋圖譜技術(shù)、分子雜交技術(shù)和DNA測(cè)序技術(shù)等。高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使得研究者能夠在對(duì)不同生態(tài)位的微生物群落構(gòu)造和功能進(jìn)行整體研究與分析,宏基因組學(xué)技術(shù)相比于之前研究方式方法具有很強(qiáng)的優(yōu)越性,它能夠獲得愈加全面的微生物群落信息,幫助人們把握豬微生物組的全貌。當(dāng)前常用的高通量測(cè)序方式方法主要是以Illumina公司發(fā)展的為代表的第二代測(cè)序方式方法,以及以Pacbio公司為代表的第三代單分子測(cè)序方式方法。通過(guò)結(jié)合微生物分離培養(yǎng)與高通量擴(kuò)增子測(cè)序,宏基因組測(cè)序(shotgun)以及宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,進(jìn)而對(duì)豬微生物組進(jìn)行全面的群落構(gòu)造與多樣性分析,功能基因注釋與預(yù)測(cè)分析,在特定時(shí)空條件以及不同條件處理的基因表示出情況分析來(lái)全面揭示豬微生物組與健康,豬病發(fā)生與防治,促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)的關(guān)系。3豬腸道微生物的構(gòu)成仔豬腸道微生物區(qū)系隨宿主日齡增加逐步變得復(fù)雜多樣,且構(gòu)成一個(gè)相對(duì)動(dòng)態(tài)平衡、穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng),對(duì)宿主的生長(zhǎng)和健康起著重要作用。豬在出生前胃腸道沒(méi)有細(xì)菌,出生24h內(nèi),腸道內(nèi)定植了雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌、腸球菌等細(xì)菌。隨著日齡的增長(zhǎng),微生物的多樣性與豐富度隨之提高。育肥豬腸道內(nèi)以厭氧菌(雙歧桿菌、乳酸菌等)為主,約占99%,少量為需氧菌或兼性厭氧菌。定植在宿主腸道內(nèi)的微生物及其代謝產(chǎn)物能夠不同程度地影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收、利用。同樣,不同的膳食水平也會(huì)制約著微生物的生長(zhǎng)與增殖。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與微生物之間存在著互作機(jī)制,互相影響,共同進(jìn)化,維持著腸道微生態(tài)平衡。4微生物組的應(yīng)用4.1豬胃腸道微生物群落構(gòu)造及多樣性分析地球上存在超過(guò)55個(gè)細(xì)菌門(mén)類,但只要擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)這兩個(gè)深層進(jìn)化門(mén)類的菌群在胃腸道中占優(yōu)勢(shì),這表示清楚動(dòng)物胃腸道是一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的環(huán)境,其微生物組成與其他生態(tài)環(huán)境有明顯差異不同。Lamendella等(2018)對(duì)豬糞便微生物宏基因組進(jìn)行shotgun測(cè)序的研究表示清楚,豬糞便微生物中占主導(dǎo)地位的是厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén),華而不實(shí)Prevotellaspp.占優(yōu)勢(shì),與其他動(dòng)物宏基因組數(shù)據(jù)的比擬發(fā)現(xiàn),豬糞便菌群的門(mén)類分布與牛瘤胃和雞盲腸最為類似。Yan等(2021)在長(zhǎng)白豬與梅花豬仔豬的研究中發(fā)現(xiàn)相比于梅花豬,長(zhǎng)白豬仔豬的結(jié)腸粘膜中短鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及受體的表示出更高層次,而膽汁酸受體表示出更低;鑒定出8個(gè)細(xì)菌屬及16個(gè)細(xì)菌物種,在2種仔豬結(jié)腸中的相對(duì)豐度存在差異,這些細(xì)菌與結(jié)腸膽汁酸及短鏈脂肪酸的濃度密切相關(guān)。Ramayocaldas等(2021)利用網(wǎng)絡(luò)分析的方式方法初次揭示了豬腸道菌群的互相作用,構(gòu)建了以屬水平微生物和OTU為單位的互相作用網(wǎng)絡(luò),并與人腸道菌群的互相作用進(jìn)行了比擬。對(duì)518頭60日齡健康仔豬的腸道菌群進(jìn)行聚類,并結(jié)合體重和平均日增重等產(chǎn)量性狀,利用Arumugam等開(kāi)發(fā)的腸型分析算法對(duì)518個(gè)小豬樣品的腸道微生物進(jìn)行分析,結(jié)果顯示小豬腸道菌群主要分為2個(gè)類似腸型的類型:第一類為PEA,密螺旋體屬是PEA聚類群的優(yōu)勢(shì)菌;第二類為PEB,普氏菌屬是PEB聚類群的優(yōu)勢(shì)菌。聚類結(jié)果與小豬的平均日增重相關(guān)(P=0.027),不受小豬的性別、生產(chǎn)批次及核心家族影響。4.2豬不同發(fā)育階段胃腸道微生物的變化研究動(dòng)物胃腸道正常微生物區(qū)系在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)、健康、防病、免疫等方面發(fā)揮著重要作用。仔豬哺乳階段是腸道菌群快速建立的階段,而斷奶會(huì)導(dǎo)致仔豬腸道菌群發(fā)生宏大的改變。豬腸道內(nèi)含有細(xì)菌、真菌、病毒等多種微生物,種類不同的微生物根據(jù)一定的比例組合,各微生物間互相協(xié)同與拮抗,在質(zhì)和量上構(gòu)成一種生態(tài)平衡。在人體微生物組研究中,已有從嬰兒到老年時(shí)期不同年齡的人體菌群變化研究。那豬的腸道菌群隨年齡怎樣變化?Chen等(2021)討論了豬不同年齡的腸道菌群構(gòu)造變異,分別在仔豬斷奶前10天,斷奶日,斷奶后10天,斷奶21天收集新鮮糞便,通過(guò)16S測(cè)序分析表示清楚仔豬在斷奶后,腸道菌群快速改變,并在10天內(nèi)到達(dá)相對(duì)穩(wěn)定的水平,多樣性隨時(shí)間增長(zhǎng)顯著增加;仍在接受哺乳的仔豬的腸道菌群主要由梭桿菌屬、乳桿菌屬、擬桿菌屬、埃希氏菌屬/志賀氏菌屬、巨型球菌屬組成;斷奶后的仔豬的腸道菌群主要由Blautia、梭菌屬XIVa、Paraprevotella等菌屬組成。Zhao等(2021)選取1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月以及6個(gè)月大的豬作為試驗(yàn)對(duì)象,檢測(cè)微生物在豬腸道中的動(dòng)態(tài)變化,結(jié)果表示清楚高年齡段豬糞便中厚壁菌門(mén)微生物比例顯著高于低年齡段,并且在豬發(fā)育經(jīng)過(guò)中,微生物組成趨于穩(wěn)定;在成年豬中,腸道不同位置微生物組成差異顯著。PCA主成分分析結(jié)果表示清楚1月大豬中微生物組成與其他三個(gè)年齡段顯著不同,而6月大豬的不同胃腸道樣本可因?qū)偎轿⑸锝M成聚為3類:小腸(空腸和結(jié)腸)、大腸(回腸和盲腸)和糞便。Koenig等(2018)關(guān)于嬰兒腸道微生物的研究指出兒童腸道微生物群落在2.5歲后基本趨于穩(wěn)定。高通量測(cè)序的宏基因組技術(shù)為研究各個(gè)發(fā)育階段微生物提供了充足的數(shù)據(jù)支持,使得整個(gè)發(fā)育階段微生物變化脈絡(luò)愈加清楚明晰完備,且研究愈加簡(jiǎn)單易行。4.3豬腸道微生物與機(jī)體營(yíng)養(yǎng)代謝4.3.1日糧組成對(duì)豬胃腸道微生物的影響近年來(lái),動(dòng)物科學(xué)家開(kāi)場(chǎng)對(duì)動(dòng)物飼養(yǎng)策略的優(yōu)化以及動(dòng)物健康狀況的改善進(jìn)行深切進(jìn)入的微生物組研究。Tilocca等(2021)采用16SrRNA基因測(cè)序和宏蛋白組學(xué)方式方法對(duì)飲食改變引發(fā)的豬糞便微生物群的構(gòu)造和功能變化進(jìn)行分析,OTU豐度和蛋白質(zhì)定量分析發(fā)現(xiàn),以第一天為零點(diǎn),第1、2周為代謝期,第3、4周為平衡期;僅在平衡期時(shí),菌群因CaP的添加量不同而表現(xiàn)出顯著差異;以大豆或豌豆作為不同蛋白來(lái)源的飼料對(duì)菌群無(wú)顯著影響;隨著食物構(gòu)造的改變,菌群的組成和功能在數(shù)周內(nèi)逐步重排,對(duì)營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究具有重要意義。膳食蛋白質(zhì)是家畜氨基酸的基本來(lái)源。以前的研究報(bào)告指出低蛋白飲食能夠降低豬糞便和尿液中氨-氮的濃度,但它對(duì)生長(zhǎng)性能和腸道健康的影響還沒(méi)有得到充分驗(yàn)證。Fan等(2021)在調(diào)查膳食蛋白水平對(duì)腸道細(xì)菌群落和腸道屏障的影響中發(fā)現(xiàn),適度減少膳食蛋白質(zhì)濃度(13%CP)能夠改善成品豬回腸和結(jié)腸中的細(xì)菌群落構(gòu)造,增加Peptostreptococcaceae的比例,回腸屏障功能加強(qiáng),并解釋了由不同濃度的膳食蛋白質(zhì)引起的腸道細(xì)菌綜合變異的基本機(jī)制,指出特定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)要到達(dá)一個(gè)平衡比例,可能才是最有利于機(jī)體和相關(guān)菌群所需的。豬胃腸道微生物穩(wěn)態(tài)受多方面的影響,華而不實(shí)不同日糧組成對(duì)腸道微生物影響顯著。在日糧組成對(duì)豬腸道微生物影響的相關(guān)研究方面,采用基于高通量測(cè)序的宏基因組技術(shù),對(duì)不同日糧處理的豬腸道樣本檢測(cè)后,可獲得遠(yuǎn)多于傳統(tǒng)方式方法的大量微生物的生物學(xué)信息,便于更準(zhǔn)確的分析日糧與腸道微生物的關(guān)系。4.3.2飼料添加劑對(duì)豬胃腸道微生物的影響飼料添加劑是指在飼料生產(chǎn)加工、使用經(jīng)過(guò)中添加的少量或微量物質(zhì),在飼料中用量很少但作用顯著。飼料添加劑是當(dāng)代飼料工業(yè)必然使用的原料,對(duì)強(qiáng)化基礎(chǔ)飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,提高動(dòng)物生產(chǎn)性能,保證動(dòng)物健康,節(jié)省飼料成本,改善畜產(chǎn)品品質(zhì)等方面有明顯的效果。Yu等(2021)的研究中,在對(duì)照飲食,高ZnO(3000mg/kg)或抗生素(300mg/kg金霉素和60mg/kg硫酸粘桿菌素)喂養(yǎng)的仔豬的回腸和結(jié)腸進(jìn)行微生物群落分析,結(jié)果顯示斷奶仔豬的日糧中補(bǔ)充高氧化鋅(ZnO,3000mg/kg)或抗生素,均可顯著增加回腸螺旋體門(mén)、柔壁菌門(mén)、廣古菌門(mén)、疣微菌門(mén)和TM7門(mén)數(shù)量,降低衣原體門(mén)數(shù)量;相比對(duì)照組,ZnO和抗生素組的回腸菌群中,條件致病菌彎曲菌目數(shù)量降低,腸桿菌目數(shù)量增加;ZnO組的結(jié)腸菌群中,廣古菌門(mén)、甲烷短桿菌屬、史氏甲烷短桿菌種顯著高于其他組;飲食中高含量的ZnO和抗生素增加回腸菌群多樣性且效果類似,影響非主要菌群,并降低結(jié)腸菌群多樣性。果膠包含3種不同類別的多糖:半乳糖醛酸聚糖、鼠李半乳糖醛酸聚糖和替代半乳糖醛酸聚糖,其特點(diǎn)是較高的保水能力、黏性和緩沖能力,在盲腸不被酶解,并且可在后腸發(fā)酵,有助于減少仔豬腸道末端未被消化的飼料,進(jìn)而降低病原菌增殖。而日糧中添加果膠的效果取決于所添加的果膠的理化特性,或間接取決于其對(duì)腸道發(fā)酵和菌群調(diào)控的影響。Tian等(2021)通過(guò)16S測(cè)序研究三種不同果膠對(duì)其他碳水化合物消化、豬腸道菌群組成和短鏈脂肪酸水平的影響,發(fā)現(xiàn)LMP顯著降低淀粉的回腸消化效率,導(dǎo)致更多淀粉在近端結(jié)腸發(fā)酵;在回腸,LMP比HMP更容易被菌群發(fā)酵,HMP主要是被近端結(jié)腸的菌群發(fā)酵;大豆粉主要在近端結(jié)腸發(fā)酵,引起橫結(jié)腸中SCFA水平升高;LMP,HMP和aSBM降低結(jié)腸乳酸菌和增加普氏菌的相對(duì)豐度,這可能對(duì)身體有益。4.4抗生素對(duì)豬腸道微生物的影響腸道微生物菌群通過(guò)定植腸道,增加抵抗力,幫助機(jī)體防御病原菌的入侵?？梢酝ㄟ^(guò)加強(qiáng)機(jī)體對(duì)病原菌的免疫應(yīng)答和阻止病原菌在腸道的附著,幫助機(jī)體免受外來(lái)病原菌感染。研究證實(shí),無(wú)菌動(dòng)物比腸道內(nèi)微生物菌群正常的動(dòng)物更容易遭受病原菌感染,因而抗生素可能是通過(guò)抑制某些有害菌,進(jìn)而給更多有益菌增加了繁衍的空間,最終發(fā)揮作用。Looft等(2020)通過(guò)16SrRNA基因序列和宏基因組分析揭示了進(jìn)食抗生素對(duì)不同腸道位置的微生物群的影響,發(fā)如今回腸中富集厚壁菌門(mén)和噬菌體編碼基因,而大腸微生物群則編碼了很多降解植物細(xì)胞壁的基因,回腸粘膜比內(nèi)腔的微生物多樣性更豐富,且與大腸粘膜類似,表示清楚大多數(shù)腸道微生物可與粘膜結(jié)合,抗生素喂養(yǎng)的動(dòng)物的微生物群體顯著的變化是回腸中的大腸桿菌,所有腸道位置中的拉氏梭菌屬以及抗生素的抗性基因的增加,在不同腸道位置。對(duì)不同的代謝能力和反響進(jìn)行描繪敘述,將有助于提供改善腸道健康和食品安全的策略。將來(lái)的工作應(yīng)該超越遺傳變化,對(duì)基因表示出的影響,甚至是蛋白質(zhì)和代謝物的影響。除此之外,系統(tǒng)生物學(xué)對(duì)于將微生物變化與宿主改變相結(jié)合至關(guān)重要。關(guān)于在農(nóng)業(yè)中使用抗生素的爭(zhēng)議可能會(huì)持續(xù)下去,但了解抗生素怎樣影響腸道細(xì)菌群落,可能會(huì)提供保存性能優(yōu)勢(shì)的替代策略,同時(shí)降低對(duì)人類和動(dòng)物健康的潛在風(fēng)險(xiǎn)5