guan細(xì)胞融合的學(xué)習(xí)材料

guan細(xì)胞融合的學(xué)習(xí)材料第1頁(yè)/共46頁(yè)第四章－1

細(xì)胞融合CellFusion第2頁(yè)/共46頁(yè)細(xì)胞融合概念融合方法融合過(guò)程融合的影響因素細(xì)胞融合第3頁(yè)/共46頁(yè)細(xì)胞融合（cellfusion）：又稱(chēng)somatichybridizationorcellhybridization，指在自然條件下或人工方法使兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞通過(guò)無(wú)性方式融合形成一個(gè)雜合細(xì)胞的過(guò)程。

它能重新組合兩個(gè)親本細(xì)胞的優(yōu)良遺傳信息，是研究細(xì)胞間遺傳信息傳遞、基因在染色體定位、改良動(dòng)物遺傳特性及創(chuàng)造新的符合人類(lèi)需要的新的細(xì)胞系極為有效的手段。自發(fā)融合：受精過(guò)程，成肌細(xì)胞融合，巨噬細(xì)胞融合，體外培養(yǎng)系統(tǒng)中的細(xì)胞融合誘發(fā)融合一、細(xì)胞融合的概念第4頁(yè)/共46頁(yè)1962年Okata發(fā)現(xiàn)仙臺(tái)病毒可誘發(fā)艾氏腹水瘤細(xì)胞融合成多核細(xì)胞體，開(kāi)創(chuàng)動(dòng)物細(xì)胞融合的暫新領(lǐng)域。第5頁(yè)/共46頁(yè)

SingerandNicolson’sModelofmembranestructure:Thefluid-mosaicmodelisthe“centraldogma”ofmembranebiology.Thecorelipidbilayerexistsinafluidstate,capableofdynamicmovement.Membraneproteinsformamosaicofparticlespenetratingthelipidtovaryingdegrees.TheFluidMosaicModel,proposedin1972bySingerandNicolson,hadtwokeyfeatures,bothimpliedinitsname.第6頁(yè)/共46頁(yè)ThechemicalcompositionofmembranesA.MembraneLipids:TheFluidPartoftheModelPhospholipids:Phosphoglyceride磷酸甘油酯andsphingolipidsGlycolipids

Sterols(isonlyfoundinanimals)Membranelipidsareamphipathic.Therearethreemajorclassesoflipids:第7頁(yè)/共46頁(yè)AnOverviewofmembranefunctions

1.Definetheboundariesofthecellanditsorganelles.2.Svidemechanismsforcell-to-cellcontact,communicationandadhesion第8頁(yè)/共46頁(yè)細(xì)胞融合機(jī)理

細(xì)胞融合的關(guān)鍵：脂雙層的接觸靠近,細(xì)胞橋形成,胞質(zhì)滲透－細(xì)胞核融合。膽固醇磷脂糖脂寡糖疏水a(chǎn)螺旋鰲合蛋白極性孔蛋白分子Hydrophobic疏水的Hydrophilic親水的第9頁(yè)/共46頁(yè)二、誘發(fā)細(xì)胞融合的方法病毒化學(xué)－PEG電融合第10頁(yè)/共46頁(yè)1.病毒促進(jìn)細(xì)胞融合

病毒類(lèi)融合劑是研究的最早的促融劑，一些致癌、致病病毒如皰疹病毒、天花病毒、副流感型病毒、副黏液病毒等，都能誘導(dǎo)細(xì)胞融合，但由于毒性大，應(yīng)用上收到很大限制。仙臺(tái)病毒（HVJ）是一類(lèi)被膜病毒，誘導(dǎo)細(xì)胞融合的不是仙臺(tái)病毒內(nèi)部的RNA，而是它的外膜。這一現(xiàn)象對(duì)你有何啟示？第11頁(yè)/共46頁(yè)HVJ促融機(jī)制：當(dāng)病毒位于兩個(gè)細(xì)胞間時(shí)，病毒表面spike上神經(jīng)氨酸酶降解細(xì)胞膜上的糖蛋白，使細(xì)胞膜局部聚集在病毒周?chē)诟遬H和Ca2+條件下局部細(xì)胞膜發(fā)生融合。第12頁(yè)/共46頁(yè)2.化學(xué)融合劑促進(jìn)細(xì)胞融合

1975年Kao和Chayluk報(bào)道PEG(polyethyleneglycol,PEG)可促進(jìn)細(xì)胞融合，Pontecorvo報(bào)道PEG促融效率高于仙臺(tái)病毒100-300倍。

PEG是一種多聚化合物，商品名卡波蠟Carbowax,分子量200－20000，靠醚鍵的聯(lián)結(jié)使其分子末端帶弱負(fù)電荷，目前已衍生達(dá)50多種。第13頁(yè)/共46頁(yè)聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)的細(xì)胞融合

原理：PEG帶有大量的負(fù)電荷,和細(xì)胞膜表面的負(fù)電荷在Ca2＋的連接下，形成靜電鍵，促使異源的細(xì)胞膜間的粘著和結(jié)合，在高pH,高Ca2＋溶液的作用下，將Ca2＋和與質(zhì)膜結(jié)合的PEG分子洗脫，導(dǎo)致電荷平衡失調(diào)并重新分配，使兩種細(xì)胞膜上的正負(fù)電荷連接起來(lái)，進(jìn)而形成具有共同質(zhì)膜的融合體。第14頁(yè)/共46頁(yè)第15頁(yè)/共46頁(yè)第16頁(yè)/共46頁(yè)注意事項(xiàng)1PEG融合的關(guān)鍵是作用時(shí)間2PEG規(guī)格和純度與融合效率有關(guān)3融合與細(xì)胞密度有關(guān)4融合液中加入少量CaCl2，即維持一定電導(dǎo)率，對(duì)細(xì)胞也有保護(hù)作用第17頁(yè)/共46頁(yè)3.電融合技術(shù)（Electroporation）

第18頁(yè)/共46頁(yè)第19頁(yè)/共46頁(yè)第20頁(yè)/共46頁(yè)3第21頁(yè)/共46頁(yè)注意事項(xiàng)1）對(duì)介質(zhì)要求高，一般用高純度的蒸餾水并選用適當(dāng)?shù)姆请娊橘|(zhì)溶液，如甘露醇等配制等滲性介質(zhì)。2）注意控制高頻交流電壓和直流脈沖電壓的強(qiáng)度和時(shí)間，以防止細(xì)胞連接成串或發(fā)生可逆性降解。第22頁(yè)/共46頁(yè)融合參數(shù)：主要包括交流電壓、交變電場(chǎng)的振幅頻率、交變電場(chǎng)的處理時(shí)間；直流高頻電壓、脈沖寬度、脈沖次數(shù)等。第23頁(yè)/共46頁(yè)優(yōu)點(diǎn)：融合率高，達(dá)70％－80％，甚至100％融合率＝（融合組多核細(xì)胞的核數(shù)－對(duì)照組多核細(xì)胞的核數(shù)/對(duì)照組的全部細(xì)胞數(shù)）×100％可在顯微鏡下定向誘導(dǎo)細(xì)胞融合可直接挑選雜種細(xì)胞第24頁(yè)/共46頁(yè)

原理：兩種親本細(xì)胞融合的混合物中可能有多種類(lèi)型細(xì)胞，篩選的目的是獲得優(yōu)良的雜種細(xì)胞。

1）親本

2）同核體homokaryon：同源細(xì)胞融合體，它們的基因型和表現(xiàn)型完全一樣。

3）異核體heterokaryon：異源細(xì)胞的融合體，它們含有雙親細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)。

4）多核體：含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體

5）異胞質(zhì)體：具有不同胞質(zhì)來(lái)源的雜合細(xì)胞。

6）核質(zhì)體：有細(xì)胞核而帶有少量細(xì)胞質(zhì)的亞原生質(zhì)體第二節(jié)融合細(xì)胞的篩選第25頁(yè)/共46頁(yè)動(dòng)物細(xì)胞融合的篩選方式：1）利用抗藥性篩選系統(tǒng)：利用生物細(xì)胞對(duì)藥物敏感性差異篩選雜種細(xì)胞。親本A：對(duì)氨芐青霉素敏感，對(duì)卡那霉素不敏感親本B：對(duì)卡那霉素敏感，對(duì)氨芐青霉素不敏感雜種細(xì)胞可以在含有兩種抗生素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)第26頁(yè)/共46頁(yè)2）營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)篩選系統(tǒng)：細(xì)胞在缺乏一種或幾種營(yíng)養(yǎng)成分時(shí)，不能生長(zhǎng)繁殖，即營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞。利用兩種親本細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)作用原理可以篩選雜種細(xì)胞。親本A：色氨酸缺陷型親本B：蘇氨酸缺陷型雜種細(xì)胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，而親本細(xì)胞均會(huì)死亡。第27頁(yè)/共46頁(yè)3）溫度敏感突變型雜種細(xì)胞的篩選：一般的培養(yǎng)細(xì)胞能在37度范圍內(nèi)生長(zhǎng)，但溫度敏感突變型的細(xì)胞能在高溫或低溫下生長(zhǎng)。由此篩選雜種細(xì)胞。親本一：具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生長(zhǎng)。親本二：高溫敏感突變型，但不能抗卡那霉素。雜種細(xì)胞能在高溫和含卡那霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。第28頁(yè)/共46頁(yè)4具有所需性狀雜種細(xì)胞的篩選第29頁(yè)/共46頁(yè)HAT選擇系統(tǒng)－－基于酶缺陷型細(xì)胞和藥物抗性所建立的雜種篩選HAT是含一定濃度次黃嘌呤（Hypoxanthine,H）、氨基喋呤（Aminopterin，A）及胸腺嘧啶核苷（Thymidine，T）的一種選擇性培養(yǎng)基，其中三種成分與細(xì)胞DNA合成有關(guān)。DNA合成途徑有兩種:需兩種酶：胸腺嘧啶核苷激酶TK酶:（催化胸腺嘧啶核苷產(chǎn)生脫氧胸苷酸）次黃嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶HGPRT酶:（催化次黃嘌呤產(chǎn)生肌苷）主要途徑由氨基酸和其他小分子化合物合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA，葉酸是必不可少的媒介，參與嘌呤和嘧啶甲基合成，氨基蝶呤抑制FH2活性，阻斷FH2到FH4合成。第30頁(yè)/共46頁(yè)雜交瘤技術(shù)中，常選用次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷（HPRT-）骨髓瘤細(xì)胞或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤細(xì)胞為親本之一。HPRT-細(xì)胞的嘌呤只能由全合成途徑產(chǎn)生；TK-

細(xì)胞的嘧啶只能由全合成途徑合成。含氨基喋呤A培養(yǎng)基抑制了細(xì)胞內(nèi)嘌呤和嘧啶的全合成途徑。第31頁(yè)/共46頁(yè)基于HAT培養(yǎng)基的篩選系統(tǒng)H（Hypoxanthine次黃嘌呤）應(yīng)急途徑中所提供之外源核苷酸前體A（Aminopterin，氨基喋呤）阻斷核苷酸的從頭合成T（Thymidine，胸腺嘧啶）應(yīng)急途徑中所提供之外源核苷酸前體HGPRT酶缺陷型細(xì)胞株（長(zhǎng)期培養(yǎng)系）不能在HAT培養(yǎng)液中生長(zhǎng)正常細(xì)胞體外生存能力有限，最終也將死亡融合細(xì)胞最后，只有融合細(xì)胞在HAT培養(yǎng)液中存活第32頁(yè)/共46頁(yè)第三節(jié)融合細(xì)胞克隆化利用單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)選育出遺傳穩(wěn)定的分泌特異抗體的細(xì)胞系。在培養(yǎng)過(guò)程中，一般要加能釋放某些生長(zhǎng)因子促進(jìn)雜交瘤生長(zhǎng)的飼養(yǎng)細(xì)胞，如小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞或胸腺細(xì)胞等。方法有有限稀釋法、軟瓊脂培養(yǎng)法、顯微操作法、應(yīng)用熒光激活分選儀等。第33頁(yè)/共46頁(yè)通過(guò)適當(dāng)?shù)南♂屵_(dá)到分離單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的目的1）取出陽(yáng)性孔內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)2）用培液將其稀釋到例如每毫升內(nèi)10個(gè)細(xì)胞。3）如果在96孔板內(nèi)每孔加0.1ml，每孔內(nèi)將為一個(gè)細(xì)胞4）加入一定數(shù)量的飼養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)8~12天后，可觀察到有集落生長(zhǎng)的孔。5）根據(jù)檢測(cè)的陽(yáng)性結(jié)果再次進(jìn)行克隆化。有限稀釋法第34頁(yè)/共46頁(yè)在加入飼養(yǎng)細(xì)胞的無(wú)菌平皿內(nèi)鋪上一層0.5％的瓊脂，待凝固后再鋪上一層混有雜交瘤細(xì)胞的0.25％的軟瓊脂。待細(xì)胞長(zhǎng)成集落后，用毛細(xì)管吸出移種于含飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板內(nèi)。軟瓊脂培養(yǎng)法第35頁(yè)/共46頁(yè)第四節(jié)雜種細(xì)胞在細(xì)胞生物學(xué)研究中的應(yīng)用1）基因定位

不同種屬的細(xì)胞融合時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)一個(gè)親本細(xì)胞的染色體被優(yōu)先排除，而另一個(gè)親本的染色體被選擇性留下，即染色體分離的現(xiàn)象。由此，可根據(jù)表型和與表型特征相對(duì)應(yīng)的基因在特定染色體上。例如：HGPRT－人細(xì)胞與TK－的小鼠細(xì)胞融合后，可用HAT培養(yǎng)基分離得到一種僅含一條人E組染色體的雜種細(xì)胞，具有TK活性，由此得到人的TK基因是在E組染色體上的。第36頁(yè)/共46頁(yè)2）體細(xì)胞雜種的致瘤性分析通過(guò)正常二倍體細(xì)胞和致瘤性或病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞的融合來(lái)進(jìn)行致瘤性的遺傳分析。3）遺傳缺陷的基因互補(bǔ)基于雜種細(xì)胞的基因互補(bǔ)作用，可分為基因間和基因內(nèi)的互補(bǔ)作用，即雜種細(xì)胞可以具有兩種親本在遺傳上缺陷的基因表型。通過(guò)這種基因互補(bǔ)，可以用正?；騺?lái)治療由于基因突變或基因缺