外周血染色體標(biāo)本制作

外周血染色體標(biāo)本制作外周血染色體標(biāo)本制作1/32一、染色體標(biāo)本制備原理在細(xì)胞遺傳學(xué)研究中，為了使細(xì)胞質(zhì)透明，離解胞間層，使組織軟化，且使染色體彼此鋪展開而又能清楚地顯示縊痕，往往需要對正在分裂或已經(jīng)收獲細(xì)胞作一系列預(yù)處理。有時(shí)，在對細(xì)胞進(jìn)行固定時(shí)候，為了使固定劑快速滲透到組織中，方便于研究染色體特殊結(jié)構(gòu)，也需要作預(yù)處理；其目標(biāo)是使細(xì)胞核外條件及染色體本身狀態(tài)更適于分析和研究需要。在細(xì)胞培養(yǎng)（培養(yǎng)基中加有PHA）后72小時(shí)，合成DNA細(xì)胞占總數(shù)45％，有絲分裂速率相當(dāng)于每小時(shí)1%，被激活淋巴細(xì)胞占總數(shù)90%，是收獲分裂期細(xì)胞、制備染色體標(biāo)本最正確時(shí)期。從收獲到制片需經(jīng)過加紡錘體抑制劑、低滲處理、固定、滴片等幾個(gè)主要步驟，現(xiàn)將各步驟原理、所用試劑及相關(guān)注意事項(xiàng)詳述以下。外周血染色體標(biāo)本制作2/321紡錘體抑制劑1.1基本原理和機(jī)制使染色體散開并清楚地展現(xiàn)次縊痕，憑借原理是改變細(xì)胞質(zhì)粘度。因?yàn)樵诩?xì)胞分裂時(shí)，伴隨紡錘體形成，染色體緊靠在一起，極難進(jìn)行分析。紡錘體形成取決于細(xì)胞質(zhì)和紡錘體成份粘度之間平衡。所以，改變細(xì)胞質(zhì)粘度就能破壞紡錘體，使染色體依然呈游離狀態(tài)，或者更確切地說，染色體不再粘附至細(xì)胞內(nèi)任何結(jié)協(xié)力上。所以在隨即制作標(biāo)本時(shí)一旦受到壓力，染色體就很易鋪展開來。同時(shí)，因?yàn)槿旧w不一樣區(qū)段上水合作用能力不一，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)粘度發(fā)生改變時(shí)，就會使縊痕區(qū)顯示得更為清楚。外周血染色體標(biāo)本制作3/321紡錘體抑制劑細(xì)胞分裂中紡錘體是由微管組成。微管管壁由13條原絲縱向平行排列組成，主要成份為微管蛋白，而微管蛋白分α微管蛋白和β微管蛋白兩種。α微管蛋白和β微管蛋白組成異二聚體組成微管亞單位，若干個(gè)異二聚體相接連成原絲。α微管蛋白與β微管蛋白在化學(xué)結(jié)構(gòu)上極為相同，二者42%序列相同。其中β微管蛋白肽鏈中第201位為半胱氨酸，為秋水仙素結(jié)合部位。假如結(jié)合部位被其結(jié)合，微管不但不能繼續(xù)聚合，而且會引發(fā)原有微管解聚。外周血染色體標(biāo)本制作4/321紡錘體抑制劑故秋水仙素含有干擾微管裝配，破壞紡錘體形成和終止細(xì)胞分裂作用。以秋水仙素為代表紡錘體抑制劑能引發(fā)有絲分裂過程中紡錘絲斷裂或抑制紡錘體形成，但不影響染色體復(fù)制和著絲粒分裂使正在分裂細(xì)胞停留在中期，以取得大量分裂相供分析之用。秋水仙素積累分裂中期作用，幾乎對全部植物器官和許多動(dòng)物器官都是十分有效。外周血染色體標(biāo)本制作5/321紡錘體抑制劑1.2主要紡錘體抑制劑及其作用特點(diǎn)秋水仙素秋水仙素（colchicine）是一個(gè)生物堿，因最初從百合科植物秋水仙（Colchicumautumnale）中提取出來，故名。分子式C22H25O6N。純秋水仙素呈黃色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)157℃。易溶于水、乙醇和氯仿，難溶于熱水、乙醚等。味苦，有毒。秋水仙素能抑制有絲分裂，破壞紡錘體，使染色體停滯在分裂中期。這種由秋水仙素引發(fā)不正常分裂，稱為秋水仙素有絲分裂（C-mitosis）。在這么有絲分裂中，染色體即使縱裂，但細(xì)胞不分裂，不能形成兩個(gè)子細(xì)胞，因而使染色體加倍。外周血染色體標(biāo)本制作6/321紡錘體抑制劑秋水仙素作用與其濃度和作用時(shí)間相關(guān)，在高濃度時(shí)能夠延緩著絲點(diǎn)分裂，低濃度時(shí)則抑制細(xì)胞紡錘體形成。

在秋水仙素作用下，染色單體縮短，著色變深以致外形清楚。但不一樣染色體縮短程度不一，長染色體比短染色體濃縮得更顯著些。從能搜集到足夠中期細(xì)胞考慮，秋水仙素處理時(shí)間宜長些，所用濃度宜高些；但從能得到較為細(xì)長染色體考慮，處理時(shí)間宜短，所用濃度宜低。因而秋水仙素處理方法應(yīng)同時(shí)兼顧這二個(gè)方面。假如處理時(shí)間太短則標(biāo)本中分裂細(xì)胞就少；與此相反，假如處理時(shí)間太長分裂細(xì)胞雖多，但染色體縮得太短，以致形態(tài)含糊，就難以取得優(yōu)良顯帶標(biāo)本。外周血染色體標(biāo)本制作7/321紡錘體抑制劑與其它預(yù)處理化學(xué)物相比較秋水仙素另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，在廣泛溫度范圍內(nèi)都是有活性。在熱帶地域夏季，那怕氣溫高達(dá)43.3℃，對秋水仙素活性也無顯著影響，有些人將秋水仙素加入保留在8—9℃組織中，發(fā)覺中期細(xì)胞數(shù)目比保留在室溫但未加秋水仙素組織要多得多，而且染色體結(jié)構(gòu)也很清楚。乙酰甲基秋水仙堿是人工合成秋水仙素衍生物。它功效跟秋水仙素一樣但對細(xì)胞毒害作用只有秋水仙素1／30一1／40。4—6×10-6濃度即可得到所希望效應(yīng)。除了秋水仙素以外，另一些化學(xué)物也可作為紡錘體抑制劑。如三氯乙醛水合物、六六六、硫酸長春花堿等，它們在人體細(xì)胞均可產(chǎn)生良好效果。外周血染色體標(biāo)本制作8/321紡錘體抑制劑1.3處理過程培養(yǎng)終止前在培養(yǎng)基中加入濃度為20μg/ml秋水仙素0.05~0.1ml（1ml注射器滴垂直3-5滴）使其最終濃度為0.4~0.8μg/ml，置5%CO2、37oC±0.5oC培養(yǎng)箱中處理2~4h。外周血染色體標(biāo)本制作9/321紡錘體抑制劑

1.4注意事項(xiàng)應(yīng)該注意是經(jīng)秋水仙素處理后細(xì)胞雖可用各種不一樣固定液(金屬固定液或非金屬固定液)給予固定，但一定要在固定之前把秋水仙素從組織或細(xì)胞上沖洗掉，不然沉積在細(xì)胞表面秋水仙素不但會影響染色體形態(tài)，而且還會妨礙固定液穿透性。為此，在低滲處理后，應(yīng)盡早地加緊速穿透液，如甲醇—冰醋酸固定液。要不然在固定時(shí)候，細(xì)胞核仍可能進(jìn)入代謝期。外周血染色體標(biāo)本制作10/322低滲溶液

經(jīng)過秋水仙素處理后，細(xì)胞內(nèi)染色體比較適合于觀察了，但還是不能滿足要求。因?yàn)槿祟惣?xì)胞染色體數(shù)目多，形狀小，最大染色體約7—8微米，加之主要觀察與分析均在油鏡下進(jìn)行，這就要求標(biāo)本中染色體彼此散開，而且盡可能處于同一平面上。這些都有賴于低滲處理。外周血染色體標(biāo)本制作11/322低滲溶液2.1基本原理和機(jī)制1965徐道覺發(fā)覺未作低滲處理時(shí)，伴隨染色體一些零亂物質(zhì)類似于核糖核蛋白體顆粒，顯然是有絲分裂中核仁瓦解時(shí)殘余物。而低滲處理后，這些物質(zhì)就消失了?？梢?，低滲處理不只是憑借反滲透作用使細(xì)胞膨脹染色體鋪展，而且還可使粘附于染色體核仁物質(zhì)散開，這么就能看清楚每一個(gè)扭曲染色體?，F(xiàn)在知道，覆蓋在染色體上核仁物質(zhì)大大地妨礙著染色體分散。外周血染色體標(biāo)本制作12/322低滲溶液2.2主要低滲液低滲溶液是指滲透壓和離子強(qiáng)度均低溶液。能夠是水、低滲檸檬酸鈉或氯化鈉、甘油磷酸鉀(0.65mol／L)、氯化鉀(0.075mol／L)、稀釋平衡鹽溶液或培養(yǎng)基。處理時(shí)間普通為8—40分鐘，處理時(shí)溫度為23—37℃。在早期一些研究中，大多用檸檬酸鈉或檸檬酸鉀作為低滲液。也有些學(xué)者主張用稀釋人血清，認(rèn)為這么可使染色體形態(tài)特征更為清楚。自1965年后，人們改用KCl為低滲掖。其優(yōu)點(diǎn)是染色體輪廓清楚，可染色性增強(qiáng)，染色時(shí)間短。在相差顯微鏡下觀察．KCl低滲處理標(biāo)本效果比其它低滲液更加好些，也適合于顯微分光光度分析，當(dāng)用顯帶染色時(shí)能充分顯示帶型特點(diǎn)。KCl濃度以0.075mol／L為宜，但不一樣組織所需處理時(shí)間未必相同。外周血染色體標(biāo)本制作13/322低滲溶液2.3低滲處理過程

秋水仙素處理2-4小時(shí)后，小心地從溫箱取出培養(yǎng)瓶，用滴管將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到10ml離心管并置離心機(jī)內(nèi)離心，轉(zhuǎn)速為1500rpm，離心10min。離心后用滴管吸棄上清液，培養(yǎng)物沉積在管底。然后加入37o溫育低滲液8毫升，用滴管吹打成單個(gè)細(xì)胞懸液，置37oC水浴處理20-30min，使紅細(xì)胞破碎，白細(xì)胞膨脹。外周血染色體標(biāo)本制作14/322低滲溶液2.4影響低滲效果原因影響低滲處理效果是以下三個(gè)原因：低滲溶液化學(xué)組成、低滲強(qiáng)度和處理時(shí)間。處理時(shí)間太短則染色體鋪展不好，處理時(shí)間過長會引發(fā)細(xì)胞破裂甚至因?yàn)槿旧w脹得太大而致形態(tài)結(jié)構(gòu)含糊。所以，在實(shí)際操作中，對某一個(gè)組織終究應(yīng)選取哪一個(gè)低滲溶液，需事先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。外周血染色體標(biāo)本制作15/323固定固定是組織、細(xì)胞或其成份選擇性地固定于某一特定階段過程。其目標(biāo)是殺死細(xì)胞但又要防止所研究成份受到破壞。不一樣物種對固定劑反應(yīng)是不一，哺乳類動(dòng)物染色體固定尤其需要特定方法，這是因?yàn)槊糠N生物細(xì)胞質(zhì)成份彼此各異緣故。生物類型本身復(fù)雜性及多細(xì)胞生物中細(xì)胞內(nèi)改變較大，以致極難在細(xì)胞水平上分析固定效應(yīng)。外周血染色體標(biāo)本制作16/323固定3.1基本原理與機(jī)制用于固定化學(xué)物對細(xì)胞都含有殺死作用，這類化學(xué)物可分成二大類：一類能使染色體固縮，或使核酸和蛋白質(zhì)纖絲相脫離，另一類則可維持染色體結(jié)構(gòu)完整性。為使染色體結(jié)構(gòu)不受破壞，提升染色體可見性及嗜堿性，就需要使染色質(zhì)物質(zhì)沉淀。在活體條件下，細(xì)胞內(nèi)不一樣成份之間相差并不足以使它們成為一個(gè)顯著單位。可是伴隨蛋白質(zhì)凝結(jié)和沉淀，染色體折射系數(shù)將發(fā)生很大改變從而使它們在細(xì)胞內(nèi)成為顯著小體。正因?yàn)槿绱?，迄今所用固定劑都含有交鏈蛋白質(zhì)特征，都能使染色質(zhì)沉淀。盡管慣用染色體固定劑往往是數(shù)種化學(xué)物混合物，但其中最少有一個(gè)化學(xué)物必須具備這一特征。外周血染色體標(biāo)本制作17/323固定固定劑另一主要特征是能快速地穿透組織或細(xì)胞，并在—瞬間內(nèi)殺死它們，這么方能使正在分裂細(xì)胞馬上阻留在各自時(shí)相上。瞬間殺死是很主要，不然核分裂仍可繼續(xù)下去并抵達(dá)所謂“休止相”或“代謝相”，那就無從研究染色體了。外周血染色體標(biāo)本制作18/323固定

可是，伴隨細(xì)胞死亡而出現(xiàn)另一些改變(尤其是蛋白質(zhì)自溶作用)，往往會破壞染色體原來結(jié)構(gòu)。在正常情況下，細(xì)胞內(nèi)酶參加蛋白質(zhì)合成，而當(dāng)細(xì)胞死亡時(shí)，因?yàn)榻橘|(zhì)變?yōu)樗嵝裕@些酶便在相反方向起作用，即使復(fù)合蛋白質(zhì)裂解為簡單氨基酸。因?yàn)槎嚯氖侨旧w主要成份之一，所以這種變性效應(yīng)最終將引發(fā)染色體結(jié)構(gòu)破壞。所以，作為一個(gè)固定劑也應(yīng)能預(yù)防蛋白質(zhì)自溶作用。另外，在細(xì)胞致死同時(shí)，細(xì)菌活動(dòng)致使細(xì)胞內(nèi)成份分解。所以一個(gè)好固定劑應(yīng)該既能起到防腐作用，又能阻止細(xì)菌分解作用。外周血染色體標(biāo)本制作19/323固定最終，理想固定劑還應(yīng)能有利于到達(dá)優(yōu)良染色效果，即能增強(qiáng)染色體嗜堿性。比如，甲醛雖含有優(yōu)良固定劑其它全部特征，但卻會降低染色體嗜堿性，所以不能單獨(dú)用作染色體固定劑。顯而易見，沒有哪一個(gè)化學(xué)物能同時(shí)具備以上這些條件，因而通常是將數(shù)種能夠共存液體混合起來，使之成為染色體研究中真正有效固定劑。盡管如此，那怕是最正確固定劑仍難免有不足之處。首先，細(xì)胞被殺死后發(fā)生基本改變極難給予防止；其次，可能會抽提出一些彌散成份；最終即使操作十分慎重，仍難以保持酶活性不變；另外，一些化學(xué)物還會造成細(xì)胞皺縮。外周血染色體標(biāo)本制作20/323固定細(xì)胞膨脹和染色體皺縮是決定固定劑質(zhì)量兩個(gè)主要原因。以往曾認(rèn)為滲透壓是促使細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)膨脹或破壞決定性因索，為此選取等滲液作為固定劑，其實(shí)這種看法是不正確。事實(shí)證實(shí)，稀釋醋酸含有20個(gè)大氣壓，照?？墒辜?xì)胞和組織膨脹，而只有2.5個(gè)大氣壓苦味酸卻可使組織大大地收縮。這提醒一個(gè)固定劑效果怎樣與滲透壓關(guān)系很小。另首先，苦味酸使蛋白質(zhì)沉淀作用很強(qiáng)而醋酸卻沒有這一作用?？梢?，使蛋白質(zhì)沉淀這一特征在造成染色體收縮方面可能起主要作用。所以，在選取哪些化學(xué)物作為固定劑時(shí)，需要權(quán)衡以上這些原因。外周血染色體標(biāo)本制作21/323固定用作固定劑化學(xué)物有非金屬和金屬兩類。前者如乙醇，甲醇、醋酸、甲醛、丙酸、苦味酸和氯仿等。后者如鉻酸、鋨酸、氯化鉑、氯化汞、硝酸鈾等。其中有幾個(gè)化學(xué)物還可作為蒸氣固定劑，也即在接觸水或其它溶劑之前使可溶性物質(zhì)先轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，這么就可在原位制作標(biāo)本。在細(xì)胞化學(xué)研究上，大多數(shù)非金屬固定劑(除甲醛外)比之于金屬固定劑有一優(yōu)點(diǎn)是，在固定之后無需在水中沖洗標(biāo)本。外周血染色體標(biāo)本制作22/323固定3.2固定液種類醋酸作為混合固定液一個(gè)成份，醋酸優(yōu)點(diǎn)在于：（1）能夠與已知任何一個(gè)固定劑同時(shí)使用，而且能夠和任意百分比水、乙醇或甲醇混合；（2）濃度能夠很低（1%）也能夠很高（99%）；（3）含有很強(qiáng)穿透性能，比乙醇穿透性還高。醋酸能使核酸沉淀使組蛋白溶解，但卻不能固定細(xì)胞質(zhì)蛋白。在染色體結(jié)構(gòu)研究中，醋酸主要用途是阻止染色體收縮，使染色體結(jié)構(gòu)免于被破壞。經(jīng)醋酸固定物質(zhì)還能抵銷乙醇硬化作用。外周血染色體標(biāo)本制作23/323固定醋酸是染色體一個(gè)理想固定劑，它可使染色體結(jié)構(gòu)保持完整，且多半不致破壞核蛋白。這種固定劑一個(gè)缺點(diǎn)是會造成染色體片段過分膨脹，所以假如要研究染色體詳細(xì)結(jié)構(gòu)，必須把它與乙醇或類似化學(xué)物一道使用，后者能使組織收縮和硬化。在研究減數(shù)分裂染色體時(shí)，假如目標(biāo)是了解染色體行為，而不是其結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，用醋酸作為固定劑當(dāng)然是十分恰當(dāng)。在分析粗線期染色體時(shí)要求染色體細(xì)節(jié)清楚，醋酸也不愧是一個(gè)理想固定劑。另外，醋酸還是苯胺類染料一個(gè)優(yōu)良溶劑。正因?yàn)楹羞@一特征，它是染料和固定液混合物中必需一個(gè)成份，比如醋酸—洋紅、醋酸—奧辛和醋酸—間苯二酚藍(lán)等。外周血染色體標(biāo)本制作24/323固定甲醇在植物染色體研究中極少應(yīng)用，可是卻廣泛地用于動(dòng)物染色體固定。甲醇是從木材分解蒸餾制得，是焦木酸一個(gè)成份。即使乙醇會使染色體收縮得很厲害，而甲醇卻可使染色體膨脹。在制備固定液時(shí)往往需要一個(gè)膨脹劑以賠償另一些化學(xué)品收縮效應(yīng)，所以甲醇這一特征是非常有用。它有效濃度為70％至100％。它是一個(gè)無色有毒液體且能夠任何百分比與水混合。但不能與氧化劑一道，不然很快會氧化成甲酸。外周血染色體標(biāo)本制作25/323固定乙醇廣泛地用作染色體固定劑一個(gè)成份。它有效濃度與甲醇一樣。乙醇有一個(gè)最主要優(yōu)點(diǎn)是能快速地穿透人組織。它能夠沉淀蛋白質(zhì)，還含有脫水性．可使蛋白質(zhì)出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)變性，還能使組織硬化。作為一個(gè)還原劑，在有氧化劑存在時(shí)乙醇會很快被氧化為乙酸。所以它不能與許多金屬固定劑(鉻酸或四氯化鋨)相混用。乙醇不能有效地固定染色質(zhì)，標(biāo)準(zhǔn)上不能與醋酸、甲醛或氯仿混合使用。可是冷乙醇固定法往往能保留一些酶，因?yàn)槊阜磻?yīng)基團(tuán)—般是不受它破壞。在對染色體酶進(jìn)行研究時(shí)，宜用80％冷乙醇固定1小時(shí)或更多時(shí)間；如用于單層培養(yǎng)物，往往以純乙醇或95％乙醇固定1-15分鐘為宜。外周血染色體標(biāo)本制作26/323固定卡諾固定液?？ㄖZ固定液由1份冰醋酸和3份甲醇或乙醇混合而成。這種固定液適合用于全部動(dòng)植物和人類染色體固定。固定時(shí)間為15分鐘到二十四小時(shí)，溫度為室溫或稍冷。必要時(shí)能夠改變酸和醇百分比，比如改成1:2或1:4等。伴隨醋酸百分比增高，固定液膨脹效能加大，有利于染色體鋪展；不過假如控制不妥則會造成細(xì)胞破碎，反而不利于分析?？ㄖZ固定液一個(gè)缺點(diǎn)是經(jīng)這種方式固定組織不能被許多堿性染料水溶液染上色，除非用一些特殊媒染劑。這是因?yàn)楣潭ㄒ褐腥狈τ欣谌旧w嗜堿性金屬成份。外周血染色體標(biāo)本制作27/323固定3.3固定過程預(yù)固定：低滲30分鐘后，