課件生化2-蛋白質化學

第二章蛋白質化學

主要內容：介紹蛋白質的構件單位氨基酸的結構、分類、性質及肽的概念，重點討論蛋白質的結構、性質以及結構和功能的相互關系。思考返回目錄第一節(jié)蛋白質通論第二節(jié)蛋白質的基本構件單位──氨基酸第三節(jié)蛋白質的結構第四節(jié)蛋白質的結構與功能第五節(jié)蛋白質的重要性質思考第一節(jié)蛋白質通論一、蛋白質的化學概念和功能的多樣性二、蛋白質的分類三、蛋白質的元素組成四、蛋白質結構的組織層次蛋白質的元素組成

蛋白質平均含N量為16％,這是凱氏定氮法測蛋白質含量的理論依據：

蛋白質含量＝蛋白質含N量×6.25主要元素

C(50%-55%)H(6.9%-7.7%)O(21%-24%)N(15%-17.6%)S(0.3%-2.3%)微量元素

P、Fe、Cu、Zn、Mo、I、Se等。三鹿奶粉事件相關資料

三聚氰胺（Melamine），是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機化合物，重要的氮雜環(huán)有機化工原料。簡稱三胺，又叫2,4,6-三氨基-1,3,5-三嗪分子式C3N6H6或C3N3(NH2)3，分子量126.12。

各個品牌奶粉中蛋白質含量為15-20%，蛋白質中含氮量平均為16%。以某合格牛奶蛋白質含量為2.8%計算，含氮量為0.44%，某合格奶粉蛋白質含量為18%計算，含氮量為2.88%。而三聚氰胺含氮量為66.6%，是牛奶的151倍，是奶粉的23倍。每100g牛奶中添加0.1克三聚氰胺，就能提高0.4%蛋白質。蛋白質的分類根據分子形狀分類球狀蛋白質纖維狀蛋白質結合蛋白質根據組成分類簡單蛋白質活性蛋白質（如酶蛋白、轉運蛋白、運動蛋白、保護和防御蛋白、受體蛋白…...）根據功能分類非活性蛋白質（如硬蛋白、角蛋白）不完全蛋白質根據營養(yǎng)價值分類完全蛋白質根據溶解度分類水溶性蛋白質鹽溶性蛋白質醇蛋性白質堿溶性蛋白質酸溶性蛋白質簡單蛋白質分類結合蛋白質分類蛋白質結構的主要層次一級結構四級結構二級結構三級結構primarystructuresecondarystructureTertiarystructurequariernarystructure蛋白質的主要生理功能

蛋白質（protein）是生活細胞內含量最豐富、功能最復雜的生物大分子，并參與了幾乎所有的生命活動和生命過程。因此，研究蛋白質的結構與功能始終是生命科學最基本的命題。生物體最主要的特征是生命活動，而蛋白質是生命活動的體現(xiàn)者，具有以下主要功能：催化功能；結構功能；調節(jié)功能；防御功能；運動功能；運輸功能；信息功能；儲藏功能第二節(jié)蛋白質的基本構件單位─氨基酸一、生物體內的氨基酸類別二、常見的蛋白質氨基酸的特點及結構通式三、二十種常見的蛋白質氨基酸分類及結構四、氨基酸的性質五、蛋白質的水解生物體內的氨基酸類別

蛋白質氨基酸：蛋白質中常見的20種氨基酸蛋白質中的修飾性氨基酸：蛋白質組成中，除上述20種常見氨基酸外，從少數(shù)蛋白質中還分離出一些稀有氨基酸，它們多是相應常見氨基酸的衍生物。如4-羥脯氨酸、5-羥賴氨酸等、-羧基谷氨酸、6-氮甲基賴氨酸。非蛋白質氨基酸（天然氨基酸）：生物體內不參與蛋白質合成，呈游離或結合態(tài)的氨基酸。如-丙氨酸、

-氨基丁酸、瓜氨酸、鳥氨酸等。-氨基酸的通式

COO-Rgroup

Aminogroup

Carboxylicgroup

H=GlycineCH3=AlanineHN3+HJuangRH(2004)BCbasicsRCaaMirrorimageSamechemicalpropertiesStereoisomersJuangRH(2004)BCbasicsNH3＋NH3＋L－氨基酸D－氨基酸氨基酸的兩種立體異構體二十種常見蛋白質氨基酸的分類、結構及三字符號

據營養(yǎng)學分類

必需ＡＡ非必需ＡＡ據R基團化學結構分類

脂肪族ＡA（R基為脂肪鏈，可能含羥基、巰基或羧基、氨基）芳香族ＡA(Phe、Tyr、Trp)雜環(huán)ＡＡ(His、Pro)據R基團極性分類極性R基團AA非極性R基團AA（８種）不帶電荷（７種）據氨基、羧基數(shù)分類中性：一氨基一羧基ＡＡ酸性：一氨基二羧基ＡＡ(Glu、Asp)堿性：二氨基一羧基ＡＡ(Lys、His、Arg)人的必需氨基酸Lys

Trp

Phe

Val

Met

Leu

Ile

Thr

Arg、His帶電荷：正電荷（３種）負電荷（２種）甘氨酸（Gly,G）丙氨酸（Ala,A）纈氨酸（Val,V）亮氨酸（Lue,L）異亮氨酸（Ile,I）R側鏈含羥基或硫的脂肪族氨基酸絲氨酸（Ser,S）蘇氨酸（Thr,T）半胱氨酸（Cys,C）甲硫氨酸（Met,M）

R側鏈中性的脂肪族氨基酸在生理pH條件下酸性氨基酸及酰胺天冬氨酸（Asp,D）谷氨酸（Glu,E）天冬酰胺（Asn,N）谷氨酰胺（Gln,Q）在生理pH條件下堿性氨基酸

賴氨酸（Lys,K）精氨酸（Arg,R）組氨酸（His,H）雜環(huán)氨基酸雜環(huán)氨基酸

組氨酸（His,H）脯氨酸（Pro,P）芳香族氨基酸

苯丙氨酸（Phe,F）酪氨酸（Tyr,Y）色氨酸

（Trg,W）LeuL-C-C-CONH2-C-CONH2-C-COOH-C-C-COOH-H-CH3-C-OH-C-SH-C-C-S-CPPro-C-CCNN+

-C-C-C-C-NH3+-C--C--OH-C-NSouthlineCircularlineCentrallineNorthlineNorthwestlineAliphaticAmideAcidicImino,CircularBasicSulfurHydroxyAromatic-C-C-C-N-C-N

N+=

C-C-C-C

C-C-C-C

CC-C

CCCHNC-COOH

a-C-C

OHGlnQAsnNAspDGluEPheFArgRLysKHisHGlyGAAAlaVValI

IleYTyrSerSThrTMetMCysC氨基酸R基團化學結構TrpWJuangRH(2004)BCbasicsNortheastline非極性R基團氨基酸在生理pH條件下不帶電荷極性R基團氨基酸在生理pH條件下R基團帶電荷氨基酸根據R基團的極性對氨基酸分類POLARNON-POLARTyrHisGlyAcidicNeutralBasicAspGluGlnCysAsnSerThrLysArgAlaValIleLeuMetPheTrpProPolarornon-polar,itisthebasesoftheaminoacidproperties.JuangRH(2003)Biochemistry

四、氨基酸的性質

1、光學活性和光譜性質2、兩性解離性質和等電點3、重要化學反應

與茚三酮反應:用于氨基酸定量定性測定

與2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反應（sanger反應）:用于蛋白質N-端測定.

與苯異硫氰酸（PITC）的反應（Edman反應）：用于蛋白N-端測定，蛋白質順序測定儀設計原理的依據。

與5-二甲基萘-1-磺酰氯反應（DNS反應）：產生有熒光的DNS-氨基酸衍生物，用于蛋白N-端測定。氨基酸的兩性解離性質及等電點（pI）

pH=pI

凈電荷=0

pH<pI凈電荷為正pH>pI凈電荷為負CHRCOOHNH3+CHRCOONH2CHRCOONH3+(pK′1)(pK′2)

當氨基酸溶液某一定pH值時，使某特定氨基酸分子上所帶正負電荷相等，成為兩性離子，在電場中既不向陽極也不向陰極移動，此時溶液的pH值即為該氨基酸的等電點(isoelctricpoint)。H+OH-H+OH-以一氨基一羧基氨基酸為例可以將其視為二元酸：氨基酸的解離常數(shù)和等電點

甘氨酸GlyG氨基酸

丙氨酸AlaA

纈氨酸ValV亮氨酸LeuL

異亮氨酸IleI絲氨酸SerS蘇氨酸Thr

T天冬酰胺AsnB谷氨酰胺GlnZ-COOHpKa-+NH3pKaR基pKapI2.342.342.322.362.362.212.631.712.282.022.179.609.699.629.609.689.1510.4310.789.218.89.135.976.025.975.986.025.686.535.025.755.415.65半胱氨酸CysC甲硫氨酸MetM8.33（SH）氨基酸的解離常數(shù)和等電點(續(xù))精氨酸ArgR氨基酸賴氨酸lysK組氨酸HisH

苯丙氨酸PheF酪氨酸TyrY色氨酸TrpW脯氨酸ProP-COOHpKa-+NH3pKaR基pKapI1.832.202.381.992.092.192.172.181.829.139.119.3910.609.829.679.048.959.1710.60(OH)12.48（胍基）10.53（+NH3）6.00（咪唑基）5.485.665.896.302.973.2210.769.747.59天冬氨酸AspD谷氨酸GluE3.86（COOH）4.25（+NH3）甘氨酸滴定曲線及等電點計算一氨基一羧基氨基酸的等電點計算：pI=2pK′1+pK′2pK1pK2OH-mol數(shù)+3CH2CH2COOHCH2CH2COOHCH2CH2COO-CH2CH2COO-一氨基二羧基氨基酸—谷氨酸解離平衡NH3(CH2)3CH2+2NH3(CH2)3CH2+NH3(CH2)3CH2+NH2(CH2)3CH2pK1pK2pK3二氨基一羧基氨基酸—賴氨酸解離平衡pK1pK2pK3谷氨酸（A）和賴氨酸（B）滴定曲線和等電點計算一氨基二羧基AA的等電點計算：pI=2pK′1+pK′2BApK1pK2pIpIpK3pK3pK2pK1加入的OH-mL數(shù)加入的OH-mL數(shù)pHpH二氨基一羧基AA的等電點計算：pI=2pK′2+pK′3氨基酸光學活性和光譜性質

1、旋光性：除甘氨酸外，所有天然α-氨基酸都有不對稱碳原子，都具有旋光性。2、紫外吸收光譜：參與蛋白質組成的20種氨基酸中色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)的R基團中含有苯環(huán)共軛雙鍵系統(tǒng)，在紫外光區(qū)顯示特征的吸收譜帶，最大光吸收（max）分別為279-280、275-278、和257-259nm。由于大多數(shù)蛋白質都含有這些氨基酸殘基，因此用紫外分光光度法可測定蛋白質含量。TryTyrPhe的紫外吸收光譜

摩爾吸收系數(shù)波長(nm)279280nm275278nm257259nm氨基酸與茚三酮反應+3H20茚三酮(無色)NH3CO2RCHO+還原性茚三酮紫色化合物(弱酸)加熱+2NH3+還原性茚三酮

茚三酮H氨基酸與2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反應

（sanger反應）DNFB（dinitrofiuorobenzene）DNP-AA(黃色)++HF弱鹼中氨基酸氨基酸與苯異硫氰酯（PITC）的反應

（Edman反應）PITC（phenylisothiocyanate）+苯乙內酰硫脲衍生物(PTH-AA)（phenylisothiohydantion-AA）弱鹼中(400

C)(硝基甲烷400C)H+氨基酸與5-二甲基萘-1-磺酰氯反應的反應（DNS反應）

+DNS（5-dimethyl-amino-naphthalene-1-sulfonylchloride）DNS—氨基酸（黃色，熒光）氨基酸的成肽反應NH2COOH1NH2COOH2NH2C

NCOOHOH21Dehydration-H2OCarbodiimideJuangRH(2004)BCbasics五、蛋白質的水解根據水解程度分類

完全水解氨基酸混合物

不完全水解大小不等的肽和氨基酸

水解方法

酸水解：多數(shù)氨基酸穩(wěn)定，不引起消旋作用；Trp完全被破壞，羥基氨基酸部分分解，Gln和Asn的酰胺基被水解下來。

堿水解：Trp穩(wěn)定；多數(shù)氨基酸被不同程度破壞，且產生消旋現(xiàn)象，Arg脫氨。

酶水解：不產生消旋作用，也不破壞氨基酸，但需多種酶協(xié)同作用。蛋白質結構的層次一級結構四級結構primarystructure二級結構secondarystructure三級結構Tertiarystructurequariernarystructure共價結構三維結構超二級結構結構域

supersecondarystructureStructuredomain蛋白質的共價結構和一級結構

肽(peptide)是氨基酸的線性聚合物，因此也常稱肽鏈(peptidechain)。蛋白質是由一條或多條多肽鏈構成的大分子，蛋白質的共價結構（或化學結構）包括了肽鏈的數(shù)目、末端氨基酸組成、氨基酸排列順序及二硫鍵位置等內容。1969年，國際理論和應用化學會（IUPAC）規(guī)定蛋白質的一級結構是指肽鏈分子中氨基酸排列順序和連接方式，以此與蛋白質的共價結構相區(qū)別。一、蛋白質的一級結構及研究1、蛋白質一級結構即序列結構包含了大分子的基本信息2、肽鍵和肽單位3、天然存在的活性肽4、蛋白質一級結構研究蛋白質的一級結構

蛋白質的一級結構是指肽鏈中的氨基酸的排列順序和連接方式，它是蛋白質分子結構的基礎，包含了決定蛋白質分子所有結構層次構象的全部信息。

例：牛胰島素的一級結構A鏈B鏈A。肽單位天然存在的活性肽

類別：激素、抗菌素、輔助因子

實例：谷胱甘肽(glutathione)

短桿菌肽S

促甲狀腺素釋放因子（TRH）

-天冬氨酰-苯丙氨酸甲酯（甜味劑）

谷胱甘肽在體內參與氧化還原過程，作為某些氧化還原酶的輔因子，或保護巰基酶，或防止過氧化物積累。輔助因子

還原型谷胱甘肽（reducedglutathione）還原型谷胱甘肽(GSH)氧化型谷胱甘肽(GSSG)2H2

毒素鵝膏蕈堿抗生素

短桿菌肽S(鳥氨酸)肽類激素

牛催產素（bovineoxytocin）牛加壓素（bovinevasopressin）

舒緩激肽（bradykinin）

甜味劑

-天冬氨酰-苯丙氨酸甲酯CH2NH2

CHC

NH

CHCOOCH2COOHOCH3蛋白質一級結構研究

●蛋白質的順序分析是揭示生命本質，闡明結構以功能的關系、研究基因表達、克隆和核酸功能的重要內容。

●多肽鏈氨基酸順序測定的開拓者是英國著名的生物化學家Sanger,他用十年的時間確定了胰島素的一級結構，開創(chuàng)了蛋白質研究的新紀元，因此獲得1956年諾貝爾化學獎。

●利用Edman降解反應的原理，成功研制了自動測序儀，免除了手工測序的繁瑣，實現(xiàn)了微量序列分析。質譜技術的發(fā)展為蛋白質測序開辟了新的途徑。將肽段順序進行疊聯(lián)以確定完整的順序

將肽段分離并分別測出順序專一性裂解測定末端氨基酸拆開二硫鍵已純化蛋白質蛋白質序列測定基本方法路線

SHSHSHSHSSSS基本策略

片段重疊法＋氨基酸順序直測法

(1)分離純化蛋白質，測定氨基酸種類、數(shù)目、含量；

(2)

進行末端分析，確定多肽鏈數(shù)目，

(3)

拆分多肽鏈，斷開多肽鏈內二硫鍵；

(4)

用兩種以上方法裂解多肽鏈成較小的片段，分別分離純化

(5)

測定各肽段的氨基酸順序；

(6)

確定半胱氨酸殘基間形成二硫鍵交聯(lián)橋的位置；

(7)

片段重疊法重建完整多肽鏈一級結構。蛋白質一級結構測定一般步驟

胰島素

-巰基乙醇碘乙酸二硫鍵的斷裂多肽N、C-末端氨基酸的測定

N端測定：Sanger法（二硝基氟苯反應）

DNS法（丹磺酰氯反應）

Edman法（苯異硫氰酸酯反應）氨肽酶法

C端測定：肼解法還原法羧肽酶法Edman化學降解法1、偶聯(lián)反應2、環(huán)化反應ATZ（噻唑啉酮苯胺）少一個氨基酸殘基的肽3、轉化反應PTH-氨基酸（苯乙內酰硫尿氨基酸）ATZ(噻唑啉酮苯胺)PTC(氨基酸)丹磺酰氯(dansylchlorid)

末端分析（DNS法）多肽多肽DNS-氨基酸氨基酸混合物+-HCl水解C-末端分析:肼解法NH2NH2DNFPC6H5CHOnDNP-AA(黃色)+Nn(溶于水)(1、2、3…..n-1)（二亞芐衍生物，不溶于水）C6H5C(1、2、3…..n-1)多肽鏈的部分裂解

酶解法：如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶化學法：如溴化氰法羥胺法溴化氰斷裂法溴化氰溴化氰基溴化亞氨內酯肽酰高絲氨酸內酯（N-末端肽段）亞基硫氰酸Br-（C-末端肽段）

H3N-肽+消化道內幾種蛋白酶的專一性（Phe.Tyr.Trp）(Arg.Lys)（脂肪族）胰凝乳蛋白酶胃蛋白酶彈性蛋白酶羧肽酶胰蛋白酶氨肽酶羧肽酶(Phe.Trp)氨基酸序列測定

基本方法：Sanger法

Edman降解法

DNS-Edman測序法蛋白質順序儀測序Edman測序法1、偶聯(lián)反應2、環(huán)化反應ATZ（噻唑啉酮苯胺）少一個氨基酸殘基的肽PTH-氨基酸繼續(xù)測序PTTCPTTC-肽片段重疊法確定肽段在多肽鏈中順序示意

測定一條多肽鏈序列所得資料：氨基末端殘基H

羧基末端殘基S

第一套肽段第二套肽段

OUS

SEO

PS

WTOU

EOVE

VERL

RLA

APS

HOWT

HO確定末端氨基酸殘基和肽段

末端殘基N端：HC端：S末端肽段N端：HOWTC端：APS第一套肽段HOWTOUSEOVERLAPS第二套肽段HOWTOUSEOVERLAPS推斷全順序HOWTOUSEOVERLAPS借助重疊肽確定肽段次序：對角線電泳示意圖Detectionofpeptidesjoinedbydi-sulfidesbydiagonalelectrophoresis.Themixtureofpeptidesiselect-rophoresedinthehorizontaldirectionbefortreatmentwithperformicacidandthenintheverticaldirection.蛋白質的三維結構基本知識

構象和構型研究蛋白質構象重要方法肽鍵的性質及多肽主鏈折疊的空間限制R基團間的相互作用及穩(wěn)定蛋白質三維構象的作用力蛋白質的三維結構層次及其特征

二級結構超二級結構和結構域球狀蛋白質的三級結構球狀蛋白質的四級結構纖維狀蛋白質的結構大分子空間結構有關的兩個概念構象(conformaition):

指分子內各原子或基團之間的相互關系，構象的改變是由于單鍵的旋轉而產生的，不需要共價鍵的變化，只涉及到氫鍵等次級鍵的改變。構型(conforguration):

指立體異構體中取代基團或原子團受某種因素的限制，在空間取不同位置所形成的不同立體結構。構型的改變必須有共價鍵的斷裂。

肽結構研究生物大分子主要方法1、X-射線衍射法：可獲高分辨率的三維結構2、圓二色譜(circulardichroism，CD)：用于二級結構研究，是區(qū)分-螺旋、-折疊和無規(guī)則卷曲構象的靈敏方法。3、傅里葉變換紅外光譜(FT-IR

)：用于監(jiān)測酰胺質子的交換速率，可提供多肽所有氨基酸殘基的信息，交換動力學還可以監(jiān)測蛋白質構象變化。4、核磁共振譜(NuclearMagneticResonance，NMR)：用于肽和小蛋白質共振和結構確證，液相、固相皆可。5、紫外熒光光譜：用于觀察內在的熒光發(fā)色團、熒光輔助因子或標記熒光發(fā)色團，可研究生物分子間的相互作用、蛋白質折疊和構象變化等。

X-射線衍射晶體結構分析示意圖

X-射線管衍射圖（底片）計算機三維電子密度圖象高壓60KVNi濾片單晶=0.154nmDNA的X射線衍射圖譜肽單位肽基的C、O和N原子間的共振作用JuangRH(2004)BCbasics

HCCNCO限制繞肽鍵的自由旋形成酰胺平面產生鍵的平均化肽鍵呈反式構型肽基的C、O和N原子間的共振造成的影響共振雜化體共振形式之一共振形式之二肽鍵共振雜化產生的重要結果限制繞肽鍵的自由旋形成酰胺平面產生鍵的平均化肽鍵呈反式構型酰胺平面與α-碳原子的二面角（φ和ψ角）

二面角

兩相鄰酰胺平面之間，能以共同的Cα為定點而旋轉，繞Cα-N鍵旋轉的角度稱φ角，繞C-Cα鍵旋轉的角度稱ψ角。φ和ψ稱作二面角，亦稱構象角。

Φ=1800，ψ=1800時

完全伸展的多肽主鏈構象α-碳原子酰胺平面Φ=00，ψ=00時多肽主鏈構象酰胺平面R側鏈非鍵合原子接觸半徑R基團間的相互作用及穩(wěn)定蛋白質三維構象的作用力

a.鹽鍵b.氫鍵c.疏水鍵d.范得華力e.二硫鍵多肽鏈蛋白質的二級結構

(１)α－螺旋（α－h(huán)elix）(２)β－折疊（β-pleatedsheet）(３)β－轉角（β-turn）(４)無規(guī)則卷曲（nonregularcoil）

蛋白質的二級結構（secondarystructure）指肽鏈主鏈骨架上所含的羰基和亞氨基，在主鏈骨架盤繞折疊時可以形成氫鍵，通過這些氫鍵的維持固定，多肽鏈主鏈骨架上的若干肽段可以形成有規(guī)律的空間排布，作為蛋白質高級結構的構象單元，二級結構主要有以下類型：特征：1、每隔3.6個AA殘基主鏈骨架以右手螺旋上升一圈，螺距0.54nm;2、螺旋體中所有氨基酸殘基R側鏈都伸向外側，鏈中的全部>C=0和>N-H幾乎都平行于螺旋軸;3、每個氨基酸殘基的>N-H與前面第四個氨基酸殘基的>C=0形成氫鍵，肽鏈上所有的肽鍵都參與氫鍵的形成。

α－螺旋（α－h(huán)elix）形成因素：與ＡＡ組成和排列順序直接相關。多態(tài)性：多數(shù)為右手（較穩(wěn)定），亦有少數(shù)左手螺旋存在(不穩(wěn)定)；存在尺寸不同的螺旋(3.613,310,4.416)。

-螺旋結構的國際表示法（ns）3.613螺旋310螺旋4.416螺旋β－折疊（β-pleatedsheet）

特征：兩條或多條伸展的多肽鏈（或一條多肽鏈的若干肽段）側向集聚，通過相鄰肽鏈主鏈上的N-H與C=O之間有規(guī)則的氫鍵，形成鋸齒狀片層結構，即β－折疊片。類別：平行反平行

β－轉角（β-turn）

特征：多肽鏈中氨基酸殘基n的羰基上的氧與殘基（n+3）的氮原上的氫之間形成氫鍵，肽鍵回折1800。無規(guī)則卷曲示意圖無規(guī)則卷曲細胞色素C的三級結構根據二級結構的蛋白質分類類型二級結構種類舉例型只含-螺旋結構肌紅蛋白血紅蛋白型只含-折疊結構免疫球蛋白+型-螺旋結構和-折疊結構肽段相獨立胰島素、溶菌酶/型-螺旋結構和-折疊結構相間存在磷酸丙糖異構酶黃素氧還蛋白

超二級結構

(super-secondarystructure)

在蛋白質分子中，特別是球狀蛋白質中，由若干相鄰的二級結構單元（即α—螺旋、β—折疊片和β—轉角等）彼此相互作用組合在一起，，形成有規(guī)則、在空間上能辨認的二級結構組合體，充當三級結構的構件單元，稱超二級結構。這些二級元件的組合也稱為模體(motif)。

類型：卷曲的卷曲α-螺旋；βαβ單元；βXβ單元；

β-迂回；回形拓撲結構一些已知功能的超二級結構:

螺旋-回折-螺旋（helix-turn-helix，HTH）

鋅指（ZineFinger,ZF）

亮氨酸拉鏈（leucinezipper,LZ）

螺旋-環(huán)-螺旋（helix-loop-helix,HLH）

EF手（EF-hand）超二級結構類型βββααβ×β12345

52341

Β-鏈βαββ-迂回回形拓撲結構回形拓撲結構β-迂回螺旋區(qū)-回折-螺旋識別特定的DNA堿基序列

COOHNH2識別螺旋鋅指（ZineFinger）基元Zn2+PheHisHisArgCysCysLeu鋅指基元中Cys和His殘基構成結合鋅的位點鋅指與DNA的作用DNA鋅指亮氨酸拉鏈（leucinezipper）基元

（亮氨酸拉鏈蛋白結合在一個回文的靶DNA序列上的模式圖）回文的靶DNA序列亮氨酸拉鏈蛋白螺旋區(qū)-環(huán)-螺旋（HLH）和DNA的相互作用HLH同源二聚體螺旋螺旋環(huán)EF手圖象(鈣調蛋白的鈣結合位點的螺旋區(qū)-泡區(qū)-螺旋區(qū)結構)

Ca2+

Ehelix

FhelixEFCa2+結構域(structuredomail)

類型：α-螺旋域；β-折疊域；α+β域；α/β域；無規(guī)則卷曲+β-回折域；無規(guī)則卷曲+α-螺旋結構域

結構域形成的意義：結構域本身都是緊密裝配的，結構域之間通過松散的肽鍵形成牢固而又柔韌的連接，為域間較大幅度的相對運動提供了可能，這種結構調整與其整體功能的行使密切相關。

對于較大的蛋白質分子或亞基，多肽鏈往往由兩個或兩個以上相對獨立的三維實體締合而成三級結構，這種相對獨立的三維實體稱結構域。現(xiàn)在,結構域的概念有三種不同而又相互聯(lián)系的涵義:即獨立的結構單位、獨立的功能單位和獨立的折疊單位。卵溶菌酶的三級結構中的兩個結構域-螺旋-轉角-折疊二硫鍵結構域1結構域2具有兩個結構域結構域的蛋白質分子模型蚯蚓血紅蛋白中四個-螺旋組成的結構域

免疫球蛋白VLβ-折疊結構域兩個鐵原子α/β結構域

丙酮酸激酶結構域4乳酸脫氫酶結構域1α+β結構域3-P-甘油醛脫氫酶結構域2無規(guī)則卷曲+α-螺旋結構域木瓜蛋白酶結構域1無規(guī)則卷曲+β-回折結構域木瓜蛋白酶結構域2超二級結構類型

丙酮酸激酶結構域4

羧肽酶

腺苷酸激酶

(a)(b)

丙糖磷酸異構酶乳酸脫氫酶結構域1黃素蛋白平行-折疊的結構比較（a）-園桶形排布，（b）馬蹄形排布

球狀蛋白質的三級結構

三級結構（tertiarystructure

）是指球狀蛋白質的多肽鍵在二級結構的基礎上，通過側鏈基團的相互作用進一步卷曲折疊，借助次級鍵維系使α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)則卷曲等二級結構相互配置而形成特定的構象。三級結構的形成使肽鏈中所有的原子都達到空間上的重新排布。β-折疊β-轉角無規(guī)則卷曲空穴

特征：含多種二級結構單元；有明顯的折疊層次；是緊密的球狀或橢球狀實體；分子表面有一空穴(活性部位)；疏水側鏈埋藏在分子內部，親水側鏈暴露在分子表面。實例：肌紅蛋白，核糖核酸酶α-螺旋抹香鯨肌紅蛋白（Myoglobin）的三級結構氨基酸殘基數(shù)：150相對分子量：1780075%為-螺旋，8個螺旋段血紅素輔基

N

His12CHis119Lys41His12Lys41His119絲狀帶結構圖原子堆積結構圖核糖核酸酶三級結構示意圖

蛋白質亞基締合與四級結構

四級結構(quarternarystructure)指由相同或不同的稱作亞基（subunit）的亞單位按照一定排布方式締合而成的蛋白質結構，維持四級結構穩(wěn)定的作用力是疏水鍵、離子鍵、氫鍵、范得華力。亞基本身都具有球狀三級結構，一般只包含一條多肽鏈，也有的由二條或二條以上由二硫鍵連接的肽鏈組成。對稱性是四級結構蛋白質最重要的性質之一。

四級締合在結構和功能上有很多優(yōu)越性：增強結構穩(wěn)定性；提高遺傳經濟性和效率；使催化劑基團匯集在一起；具有協(xié)同性和別構效應。實例：血紅蛋白

煙草花葉病毒的外殼蛋白四級結構四級結構中相同單體亞基的幾種可能對稱排列

假設的單體C2對稱C3對稱C4對稱D2對稱D3對稱四級結構中相同單體亞基的幾種可能對稱排列（續(xù)前）

四面體對稱八面體對稱螺旋對稱二十面體對稱血紅蛋白四級結構

AB煙草花葉病毒外殼蛋白四級結構的自我組裝

人免疫缺陷病毒（HIV-1）結構的面圖剖

單鏈RNA寄主蛋白質被膜（脂雙層）反轉錄酶gp120gp41毛發(fā)橫切面和毛發(fā)(-角蛋白的結構)

原纖維

細胞-螺旋角質層（鱗狀細胞）

微纖維

微纖維

大纖維纖維蛋白質右手螺旋左手螺旋氨基酸組成特點:富含疏水性氨基酸及Cys

A.堆積的-折疊片的三維結構絲心蛋白(fibroin)

(-角蛋白的結構)

B.交替層中的Ala(或Ser)殘基和Gly殘基側鏈(H原子)的連鎖纖維蛋白質

一股原膠原蛋白分子膠原纖維原膠原蛋白的頭膠原纖維(collagenfibril)中原膠原蛋白分子的排列

纖維蛋白質多肽鏈特點：含[Gly-X-Y-]重復結構，X多為Pro,Y為任意氨基酸，包括羥Pro-和羥Lys單鏈為左手螺旋第四節(jié)蛋白質的分子結構與功能一、蛋白質一級結構決定其高級結構二、蛋白質的一級結構與功能

1、同功能蛋白質中氨基酸順序的種屬差異與分子進化

2、蛋白質一級結構差別愈小，其功能相似性愈大

3、一級結構上的細微變化可直接影響其功能

三．蛋白質的空間結構和功能

1、血紅蛋白的結構與功能

2、免疫球蛋白的結構與功能

3、胰島素原的激活

蛋白質復雜的組成和結構是其多種多樣生物學功能的基礎；而蛋白質獨特的性質和功能則是其結構的反映。研究生物大分子如蛋白質、核酸的結構和功能的關系，是探索生命奧秘的突破口，是從分子水平上認識生命現(xiàn)象的最終目標。核糖核酸酶(RNase)變性與復性

有活性的核糖核酸酶失去活性的核糖核酸酶

有活性的核糖核酸酶8mol尿素巰基乙醇透析、氧化微量的巰基乙醇

有活性的核糖核酸酶

二硫鍵錯配的核糖核酸酶8mol尿素中氧化C.Anfinsen的經典實驗例：細胞色素c(CytC)的分子進化細胞色素c的氨基酸序列的種屬差異和分子進化細胞色素c一級結構的保守性及其與空間構象

和生物功能的關系同功能蛋白質中氨基酸順序的種屬差異與分子進化生物與人不同的AA數(shù)目黑猩猩0恒河猴1兔9袋鼠10牛、豬、羊、狗11馬12雞、火雞13響尾蛇14海龜15金槍魚21角餃23小蠅25蛾31小麥35粗早鏈孢霉43酵母44

根據細胞色素C的順序種屬差異建立起來的進化樹不同生物與人的Cytc的AA差異數(shù)目可變殘基(variableresidues)不同生物來源的細胞色素c中不變的AA殘基14106100134323029271817675952514845413887848280706891GlyGlyPheCysGlyGlyGlyArgLysGlyCysLysPheHisProLeuGlyArgTyrAlaAsnTrpTyr707580LysLysLysProProTyrIleGlyThrMetAsnLeu血紅素細胞色素c分子的空間結構不變的AA殘基

28個不變的AA殘基，是CytC的生物功能所不可缺少的。其中有的可能參加維持分子構象；有的可能參與電子傳遞；有的可能參與“識別”并結合細胞色素還原酶和氧化酶。保守殘基(invariantresidues)例：異常血紅蛋白與分子病分子病的概念鐮刀狀紅細胞貧血病其他血紅蛋白病蛋白質一級結構上的細微變化可直接影響其功能

由于遺傳基因的突變導致了蛋白質分子結構的改變或某種蛋白質的缺乏所引起的疾病。一級結構相同的蛋白質的功能相同Ac-Ser-Tyr-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-（ACTH）

Ser-Tyr-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-(-MSH)促腎上腺皮質激素（ACTH）和促黑激素(-MSH)的N-端結構乙?；z氨酸

如果將ACTH從C端逐漸切割，僅剩下N端的13個氨基酸，則ACTH的活性消失，而具有-MSH的活性。正常紅細胞與鐮刀形紅細胞的掃描電鏡圖-鏈N端氨基酸排列順序12345678

Hb-A（正常人）Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys…Hb-S（患者）Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys…正常紅細胞鐮刀形紅細胞正常血紅蛋白與異常血紅蛋白序列比較血紅蛋白S線性締合的分子基礎脫氧HbS聚集成纖維狀結構6條脫氧HbS纖維狀纏繞成長管狀結構EF-拐彎Val6人血紅蛋白中氨基酸的置換情況舉例

不正常的-鏈不正常的-鏈

殘基不正常Hb命名在HbA中的不正常Hb殘基不正常Hb命名在HbA中的不正常Hb順序號殘基（正常）中的殘基順序號殘基（正常）中的殘基

16ILysAsp6CGluLys30G檀香山6SGluValG新加坡GluGly7G圣約翰GluGlyG香港26EGluLys57諾福克GlyAsp63M薩斯卡通HisTyr58波士頓HisTyrM愛牟利HisTyr68G菲利普AspLys63蘇黎克HisArgG布里斯托爾AspLys67M密爾瓦斯LysGlu116O印尼GluLys121D勞庶普GluGlu1、血紅蛋白（Hemoglobin，Hb）的結構與功能

（1）Hb的結構特點及輔基血紅素（2）

Hb與氧結合的協(xié)同性和輸氧功能（3）

Hb的變構效應與O2的運輸變構效應（allostericeffect）

某些小分子化合物(別構效應物,allostericeffectors)可以結合于蛋白質的活性部位，誘導出蛋白質的某種構象，使該蛋白質的活性受到影響，從而調節(jié)蛋白者的生物功能，此效應稱為變構效應，亦稱別構效應。具有別構效應的蛋白質成為別構蛋白。Hb的變構效應與O2的運輸

①Hb的變構效應

氧合作用顯著改變Hb的四級結構血紅素Fe2+的微小移動導致Hb構象的變化②

BPG對血紅蛋白氧親和力的影響③

H+、CO2對Hb氧親和力的影響(Bohr效應)肌紅蛋白分子和血紅蛋白的-亞基一級結構有較大的差異，但它們的空間構象極其相似

myoglobin(Mb)

βchainhemoglobin(Hb)血紅蛋白的結構模型及血紅素輔基氧合血紅蛋白中血紅素Fe2+的六個配體d2sp3血紅素(heme)Mb的氧合曲線

Mb+O2MbO2

令:氧飽和度（1）將（2）帶入（1）式，得：

Y對Po2

作圖得氧合曲線可推得：則（2）Hb的氧合曲線

（1）將（2）帶入（1）式，得：

Y對Po2作圖得氧合曲線Hb+nO2Hb(O2)n求得：

令:氧飽和度（2）則:血紅蛋白與氧結合的協(xié)同性和輸氧功能Hb+nO2Hb(O2)nMbHbMb+O2MbO2血紅蛋白和肌紅蛋白的氧合曲線

Hb的氧飽和度：

Mb的氧飽和度血紅蛋白輸氧功能和構象變化2(R)relaxedstate(T)tensestate血紅蛋白肺部O2肌紅蛋白肌肉靜脈動脈Whenenvironmental[O2]increases,HbbindsoxygenefficientlyWhenenvironmental[O2]decreases,HbreleasesoxygentoMbAnyonesubunitreceivesanoxygenmoleculewillincreasetheoxygen-bindingaffinityoftheothersJuangRH(2004)BCbasics動脈

協(xié)同效應（cooperativeeffect）:一個效應物分子結合于蛋白質的變構中心后對第二個效應物分子結合的影響稱為協(xié)同效應。020406080100120100806040200O2

飽和度氧分壓

(pO2,mmHg)MuscleinexercisingRelaxingmuscle肌紅蛋白血紅蛋白動脈(肺泡)[O2]靜脈(肌肉)[O2]血紅蛋白和肌紅蛋白的氧合曲線AdaptedfromGarrett&Grisham(1999)Biochemistry(2e)p.480

脫氧血紅蛋白亞基間的交聯(lián)鍵

血紅蛋白四級結構的旋轉變化血紅蛋白四級結構的滑動變化

Oxygenation氧合過程中血紅素鐵原子的變化氧合過程中鐵原子位移引發(fā)的構象改變O2F8His空間排斥FemeFHelixFemeFeF8HistidineO2

Fe2+移動時，拖動HisF8殘基,并進而引起螺旋F和拐彎EF和FG的位移。這些移動傳遞到亞基的界面，引發(fā)構象的重調，導致四級結構的改變。（TR）EFFG2+非氧合狀態(tài)Fe2+高自旋半徑大氧合狀態(tài)Fe2+高自旋半徑小

BPG在脫氧Hb中的結合位點

BPGbindingsiteBPG對Hb的變構效應物功能NoBPGWithBPGCOO-HC-O-PO3=CH2OPO3=2,3-二磷酸甘油酸（BPG）為什么人到了高原血液中BPG含量升高？為什么胎兒血與氧的親和力比成人高？波爾效應

Hb-O2+H++CO2

H+Hb+O2CO2在肌肉中pH7.2(Hb脫氧結合CO2)

在肺部pH7.6(Hb結合氧釋放CO2)pH對Hb與氧親和力的影響結語

氧的S形曲線結合，波爾效應以及BPG效應物的調節(jié)使得血紅蛋白的輸氧能力達到最高效應。同時由于能在較窄的氧分壓范圍內完成輸氧功能，因此使肌體的氧水平不致有很大的起伏。此外血紅蛋白使肌體內的pH也維持在一個較穩(wěn)定的水平。血紅蛋白的別構效應充分地反映了它的生物學適應性、結構與功能的高度統(tǒng)一性。2、免疫系統(tǒng)和免疫球蛋白功能

免疫(immunity)是人類和脊椎動物最重要的防御機制，免疫系統(tǒng)能在分子水平上識別“自我”和“非我”，然后破壞那些被鑒定為非我的實體。在生理水平上免疫系統(tǒng)對入侵的反應或應答（respone）是多種類型的蛋白質、分子和細胞之間的一套復雜而協(xié)同的相互作用，然而在個別蛋白質水平上免疫反應是配體與蛋白質可逆結合的一個生化系統(tǒng)。1．抗原、抗體和免疫球蛋白的概念2．免疫球蛋白結構3．免疫球蛋白的類別4．抗體的高度特異性和功能的多樣性抗原、抗體和免疫球蛋白

當外源物性物質，如蛋白質、毒素、糖蛋白、脂蛋白、核酸、多糖、顆粒（細菌、細胞、病毒）進入人或動物體內時，機體的免疫系統(tǒng)便產生相應的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)，并以之結合，以消除異物的毒害。此反應稱為免疫反應，此異物便是抗原(antigen)

，此球蛋白便是抗體(antibody)

。免疫球蛋白IgG的一級結構

variableregionsvariableregionsheavychainconstantregionsLightchainLightchain抗原結合區(qū)補體結合區(qū)木瓜蛋白酶和胃蛋白酶對IgG的作用木瓜蛋白酶胃蛋白酶抗原結合部位IgG的空間結構

可變區(qū)結構域FabunitFabunitFcunitAntigen-bindingsiteAntigen-bindingsiteCarbohydrateChain人免疫球蛋白的分類

IgGIgAIgMIgDIgE重鏈類別

μ

δ

ξ輕鏈類別

或

或

或

或

或鏈的組成

IgM的一級結構IgG與抗原形成

的交聯(lián)晶格

AntigenIgGH鏈蘭色，L鏈黃色，E綠色（分子中一個Glu為紅色）溶菌酶與抗體Fab片段結合模型

B細胞和T細胞上抗原的膜受體B細胞TH細胞TC細胞CD4CD8T細胞受體T細胞受體受體（膜結合抗體）細胞膜細胞膜MHC蛋白質分子圖解MHC-蛋白內側1結合抗原肽的裂隙結合抗原肽的裂隙2-微球蛋白232112內側外側外側質膜質膜MHC-蛋白抗原呈遞細胞上的MHC蛋白-抗原肽復合物與T細胞上的T-細胞受體的相互作用MHC-蛋白MHC-蛋白抗原呈遞細胞CD8或CD4抗原肽T細胞受體（巨噬細胞、B細胞或靶細胞）CD3蛋白復合體T細胞多克隆抗體和單克隆抗體

如果給動物注射抗原,雖然抗原與各種抗體產生細胞的親和性有所不同,但是還是有大量抗體產生細胞將與之結合,結果血液中出現(xiàn)的抗體源于數(shù)種不同的細胞克隆，這些抗體就是多克隆抗體（polyclonalantibodies）。如果可以分離到抗體產生細胞的單克隆，然后使所有的抗體均來自同樣的克隆，這樣制備的抗體稱為單克隆抗體（monoclonalantibodies）。由于單抗細胞的壽命有限，嚴重限制了單抗的常規(guī)制備。1975年，Milsetein和Kohler創(chuàng)建了不受限制地大量制備針對特異抗原的單抗技術，將可產生專一性抗體的B淋巴細胞與