特殊顯微鏡結(jié)構(gòu)及操作技術(shù)

關(guān)于特殊顯微鏡結(jié)構(gòu)及操作技術(shù)第1頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五【實(shí)驗(yàn)用品】1．試劑：10μg/mL羅丹明123的磷酸緩沖液（PBS）熒光染料。2．器材：倒置顯微鏡，相差顯微鏡附件（相差物鏡、轉(zhuǎn)盤聚光器、對(duì)中環(huán)形光闌和綠色濾色鏡等），微分干涉顯微鏡附件（起偏鏡、檢偏鏡和渥拉斯頓棱鏡等），熒光顯微鏡附件（熒光發(fā)射器、激發(fā)濾片和阻斷濾片等），載玻片，蓋玻片，牙簽，濾紙條，擦鏡紙，鑷子，滴管。第2頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五【實(shí)驗(yàn)原理和方法】倒置顯微鏡是一種用于生物組織細(xì)胞離體培養(yǎng)觀察的光學(xué)顯微裝置，能直接對(duì)培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶的標(biāo)本進(jìn)行顯微觀察。由于它的物鏡、物體和光源位置剛好與立式顯微鏡顛倒，被稱為倒置顯微鏡。倒置顯微鏡的物鏡在下，聚光器在上，被觀察樣品置于位于上方的聚光器之下，聚光器具有遠(yuǎn)大于物鏡的工作距離。因此，適應(yīng)于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中樣品的觀察。高檔倒置顯微鏡可根據(jù)不同觀察要求，增加相差、微分干涉反差物鏡或熒光發(fā)射裝置，構(gòu)建成相差顯微鏡、微分干涉顯微鏡或熒光顯微鏡。第3頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五一、倒置顯微鏡的構(gòu)造與使用（一）倒置顯微鏡的構(gòu)造倒置顯微鏡由目鏡、透射照明器、聚光器、載物臺(tái)、物鏡和顯微鏡機(jī)體等部件構(gòu)成，以TE2000-U顯微鏡為例介紹。TE2000-U顯微鏡配有：T-DH100W透射照明器、LHS-H100P-112V100W燈室、12V100W鹵素?zé)簟E2-PS100W電源、T-SR矩形載物臺(tái)、T-TD雙目鏡筒D、CFI10X目鏡、T-N6六孔物鏡轉(zhuǎn)換器，系統(tǒng)聚光器、物鏡、電源線等。第4頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五第5頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五1.目鏡筒及目鏡A:屈光度調(diào)節(jié)環(huán)B:目鏡C:目鏡筒轉(zhuǎn)盤O:開B:勃氏鏡(帶有聚焦螺釘)C:關(guān)(光閘)M:2.5倍放大第6頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五2.顯微鏡機(jī)體第7頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五3.透射照明器:透射照明器必須根據(jù)規(guī)定使用燈泡(12V100W或6V30W)。T-DH100W透射照明器需燈室。A：視場(chǎng)光闌調(diào)節(jié)桿B：濾色片滑片C：聚光器再聚焦制動(dòng)器D：聚光器調(diào)焦旋鈕E：聚光器固定螺釘F：聚光器安裝定位孔G：聚光器安裝定位槽H：聚光器轉(zhuǎn)動(dòng)指緊螺釘I：聚光器調(diào)中螺釘J：聚光器安裝(可轉(zhuǎn)動(dòng))支架K：LHS-H100P-112V100W燈室L：燈室固定螺釘M：燈室蓋指緊螺釘N：聚光器支架(可移動(dòng))O：聚光器支架指緊螺釘P：燈室線Q：聚光器支架下降定位螺釘?shù)?頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五第9頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五T-DS30W透射照明器A：防塵滑片(可移動(dòng))B：F堵口滑片(可移動(dòng))C：聚光器安裝支架D：6V30W燈室E：濾色片滑片F(xiàn)：安裝附加裝置M4螺紋孔第10頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五系統(tǒng)聚光器T-DH100W透射照明器A：聚光器孔徑光闌B：聚光器模塊C：聚光器模塊固定螺釘D：聚光鏡(有三種可選：ELWD、LWD、HMC)E：環(huán)形光闌調(diào)中螺釘(僅用于相差模塊中)第11頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五T-DS30W透射照明器(霍夫曼觀察)

第12頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五ELWD-S聚光器A：調(diào)中桿指緊螺釘B：調(diào)中桿C：轉(zhuǎn)盤第13頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五SLWD聚光器第14頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五T-SR矩形載物臺(tái)A：載物環(huán)灣B：載物臺(tái)Y軸方向移動(dòng)控制旋鈕

C：載物臺(tái)X軸方向移動(dòng)控制旋鈕第15頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五（二）由TE2000-U，100W透射照明器，系統(tǒng)聚光器，以及T-TD目鏡筒D組成的顯微鏡系統(tǒng)。

明視場(chǎng)(BF)鏡檢關(guān)鍵點(diǎn)：從光路中卸下其它形式觀察需要的所有光學(xué)組件，聚光器調(diào)節(jié)好（調(diào)節(jié)聚焦和對(duì)中），轉(zhuǎn)動(dòng)孔徑光闌調(diào)節(jié)好像的清晰度。第16頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五1.復(fù)位1）逆時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)，松開透射照明器中的“聚光器再聚焦指緊螺釘”。2）把“目鏡筒轉(zhuǎn)盤”設(shè)置到＜O＞位。3）把顯微鏡右側(cè)的“中間放大倍數(shù)刻度盤”打到＜1X＞。4）逆時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)，松開顯微鏡右側(cè)粗∕微調(diào)旋鈕后面的“物鏡再聚焦定位環(huán)”第17頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五第18頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五2.打開透射照明器1）把電源后部的“外部開關(guān)”打到開的位置；2）把電源“電源開關(guān)”打開。(把開關(guān)撥至│)；3）按下顯微鏡左側(cè)的“照明器開關(guān)”接通燈泡。第19頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五第20頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五3.調(diào)節(jié)燈泡亮度保證色彩真實(shí)。1）把顯微鏡左側(cè)的“亮度調(diào)節(jié)盤”設(shè)置成＜12V100W＞；2）把透射照明器中的“NCB11濾色片”插入光路中；3）把透射照明器中的“ND4濾色片”插入光路中。第21頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五4.調(diào)節(jié)光路1）把10X物鏡轉(zhuǎn)到光路中。2）把顯微鏡右側(cè)的“光路轉(zhuǎn)換盤”轉(zhuǎn)到＜1＞的位置。（100%光到觀察口）3）向上推透射照明器上的“視場(chǎng)光闌桿”完全打開視場(chǎng)光闌。4）將系統(tǒng)聚光器上的“孔徑光闌桿”轉(zhuǎn)至右側(cè)極限處把“孔徑光闌”完全打開。5）轉(zhuǎn)動(dòng)聚光器調(diào)焦旋鈕把聚光器調(diào)至最低位置。第22頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五第23頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五5.明視場(chǎng)觀察時(shí)對(duì)顯微鏡的調(diào)整把“聚光器轉(zhuǎn)盤”轉(zhuǎn)到＜A＞位置。第24頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五6．調(diào)節(jié)視度及瞳距1）將顯微鏡前部的“攝影取景框轉(zhuǎn)盤”逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)，使攝影取景框進(jìn)入光路。2）用左眼對(duì)著左側(cè)目鏡，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡“屈光度調(diào)節(jié)環(huán)”，使取景框中的雙十字線清晰成像。3）用右眼對(duì)著右側(cè)目鏡，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡“屈光度調(diào)節(jié)環(huán)”，使取景框中的雙十字線清晰成像。4）將顯微鏡前部的“攝影取景框轉(zhuǎn)盤”順時(shí)針旋轉(zhuǎn)，使其退出光路。5）調(diào)節(jié)目鏡瞳距，將兩目鏡視場(chǎng)所見的影像重合在一起。第25頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五第26頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五7.調(diào)焦1）將樣品放置載物臺(tái)中。2）轉(zhuǎn)動(dòng)同軸粗微調(diào)旋鈕，將標(biāo)本對(duì)好焦。第27頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五8.聚光器中心調(diào)節(jié)1）確信10X物鏡在光路中。2）將“視場(chǎng)光闌調(diào)節(jié)桿”降低直到能從目鏡看到視場(chǎng)光闌像。3）轉(zhuǎn)動(dòng)“聚光器調(diào)焦鈕”升降聚光器，使視場(chǎng)光闌像清晰地成象在標(biāo)本面上。4）轉(zhuǎn)動(dòng)兩個(gè)“聚光器中心調(diào)節(jié)螺釘”，使視場(chǎng)光闌像在視場(chǎng)中心。5）更換40X物鏡。6）調(diào)節(jié)“視場(chǎng)光闌調(diào)節(jié)桿”，使視場(chǎng)光闌的象與視場(chǎng)大致相同。7）轉(zhuǎn)動(dòng)兩個(gè)“聚光器中心調(diào)節(jié)螺釘”，使視場(chǎng)光闌像在視場(chǎng)正中。第28頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五第29頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五9.進(jìn)行觀察1）選擇要使用的物鏡2）移動(dòng)系統(tǒng)聚光器上的“孔徑光闌調(diào)節(jié)桿”，使孔徑為物鏡數(shù)值孔徑的70－80%。（“把目鏡筒轉(zhuǎn)盤”設(shè)到＜B＞位置，轉(zhuǎn)動(dòng)勃氏鏡調(diào)焦螺釘使其聚焦，當(dāng)觀察到物鏡的出瞳和孔徑光欄的象時(shí)，調(diào)節(jié)其大小。）3）調(diào)節(jié)“視場(chǎng)光闌調(diào)節(jié)桿”使視場(chǎng)光闌像與視場(chǎng)相大致相同。4）把透射照明器里的“ND減光片”進(jìn)入或退出光路以調(diào)節(jié)視場(chǎng)亮度。第30頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五第31頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五10.更換樣品利用顯微鏡主體上的“物鏡再聚焦定位環(huán)”，照明器上的“傾斜裝置”，“聚光器再聚焦指緊螺釘，可容易更換樣品。第32頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五11.顯微鏡操作結(jié)束后1)關(guān)閉電源開關(guān)(開關(guān)撥至O)2)燈室冷卻后，把顯微鏡上的聚乙烯防塵罩蓋好。第33頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五相差（PH）顯微術(shù)觀察透明細(xì)胞或其他透明樣品，需配相襯聚光器、相襯物鏡、相襯環(huán)等附件。相襯板將衍射光推遲1/4波長(zhǎng)，振幅相減，樣品暗，背景亮，稱正反差或暗反差，分正低（DL）、正低低（DLL）和中型暗相差（DM）。折光率較強(qiáng)的樣品用后者。相襯板將直射光推遲1/4波長(zhǎng)，振幅相加，樣品亮，背景暗，稱負(fù)反差或明反差，分負(fù)中（NM）和負(fù)高（NH）。折光率較小的樣品用后者。第34頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五關(guān)鍵點(diǎn)：將有ph標(biāo)記的物鏡與物鏡相同ph標(biāo)記的聚光器模塊一起送入光路，在進(jìn)行顯微術(shù)前，校正(對(duì)中)物鏡里的相差板及聚光器模塊里的環(huán)形光闌。第35頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五1.用明視場(chǎng)（BF）顯微術(shù)對(duì)樣品聚焦。

2.相差觀察時(shí)對(duì)顯微鏡的調(diào)整。1)將ph物鏡轉(zhuǎn)入光路。2)轉(zhuǎn)動(dòng)“聚光器轉(zhuǎn)盤”，使其與在光路中的物鏡(步驟1中所安置的)具有相同的ph標(biāo)記。3)向右轉(zhuǎn)動(dòng)聚光器上的“孔徑光闌調(diào)節(jié)桿”，完全打開孔徑光闌。第36頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五第37頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五3.對(duì)中環(huán)形光闌1)把“目鏡筒轉(zhuǎn)盤”設(shè)到<B>位置，轉(zhuǎn)動(dòng)勃氏鏡聚焦螺釘，使環(huán)形光闌像清晰。2)用六角起子轉(zhuǎn)動(dòng)聚光器模塊中的兩個(gè)“環(huán)形光闌對(duì)中螺釘”，使環(huán)形光闌像與物鏡中的相差板環(huán)形像同心。3)把目鏡筒轉(zhuǎn)盤位置再轉(zhuǎn)到<O>上。調(diào)中心手輪第38頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五第39頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五4.進(jìn)行觀察1)把聚光器“孔徑光闌”完全打開。2)移動(dòng)透射照明器上的“視場(chǎng)光闌調(diào)節(jié)桿”，使視場(chǎng)光闌像大小與視場(chǎng)大小接近。3)把透射照明器上的“NCB11濾色片”從光路中移開，把“GIF濾色片”移進(jìn)光路。(提高反差)4)可通過把“ND濾色片”移進(jìn)或移出光路來調(diào)節(jié)視場(chǎng)亮度。第40頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五第41頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五5.使用不同放大倍數(shù)的物鏡進(jìn)行觀察1)把所需放大倍數(shù)的相差物鏡移入光路。2)轉(zhuǎn)動(dòng)“聚光器轉(zhuǎn)盤”，使其與在光路上物鏡（步驟1中所安置的）具有相同的ph標(biāo)記。3)調(diào)節(jié)放入光路中的環(huán)形光闌中心。(見程序3)第42頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五6.更換樣品利用使用顯微鏡主機(jī)上的“物鏡再聚焦定位環(huán)”，透射照明器上的“傾斜”裝置及“聚光器再聚焦指緊螺釘”，可容易更換樣品。7.顯微鏡操作結(jié)束后與明視場(chǎng)顯微術(shù)步驟相同。第43頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五微分干涉（DIC）顯微術(shù)可觀察到樣品的立體感，適用于顯微操縱等，彩色圖像。因塑料培養(yǎng)皿的不均衡張力在DIC下呈現(xiàn)干涉條紋、DIC不宜用于普遍使用的塑料培養(yǎng)皿。DIC的光通亮大，可用到100倍物鏡。需配DIC聚光器等附件，使用明場(chǎng)物鏡。1．用明場(chǎng)找到視野2．壓入起偏器，選擇相應(yīng)模塊3．調(diào)節(jié)孔徑光柵至最佳效果。第44頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五熒光（E）顯微術(shù)適用于本身屬于或被染色后形成熒光體的樣品。熒光體在一定波長(zhǎng)光（紫外或可見）的激發(fā)下發(fā)光（即熒光，波長(zhǎng)長(zhǎng)于激發(fā)光）。需配熒光附件和濾光器等。前者主件為激發(fā)光源，一般分汞燈系統(tǒng)和鹵燈系統(tǒng)，汞燈既適用于紫外光激發(fā)也適用于可見光激發(fā)，且能量較高；后者只適用于可見光激發(fā)。（此處插入拍攝圖片）第45頁，