血液篩查技術(shù)的歷史沿革及未來展望

血液篩查技術(shù)的歷史沿革及未來展望

現(xiàn)代血站最為擔(dān)心的是經(jīng)輸血傳播疾病的發(fā)生，人們最開始發(fā)現(xiàn)梅毒可經(jīng)輸血傳播，隨后開始關(guān)注輸血相關(guān)性肝炎，對(duì)血液安全的關(guān)注在20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)艾滋病可經(jīng)輸血傳播后，達(dá)到了一個(gè)高峰。提高血液安全，一方面是篩選合適的獻(xiàn)血者，通過宣傳、無償獻(xiàn)血的推廣和獻(xiàn)血前問卷調(diào)查，將不適宜的獻(xiàn)血者先行淘汰；另一方面是獻(xiàn)血者樣本的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，這依賴于傳染病檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展和血站檢測(cè)技術(shù)的持續(xù)更新。本文對(duì)三項(xiàng)主要的經(jīng)血傳播病毒性疾病，即人類免疫缺陷病毒、乙肝病毒和丙肝病毒、檢測(cè)技術(shù)和血站應(yīng)用中的變革進(jìn)行總結(jié)，并展望中國(guó)血液篩查技術(shù)的未來發(fā)展。一血液篩查血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)（一）乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus，HBV）現(xiàn)代對(duì)肝炎病毒的研究，始于1963年諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者BaruchS.Blumberg（1925-2011）發(fā)現(xiàn)的命名為澳大利亞抗原（AuAg）的新抗原，AuAg也是第一個(gè)肝炎病毒的特異性檢測(cè)標(biāo)志物，1971年巴黎國(guó)際肝炎討論會(huì)上，將之命名為乙型肝炎抗原（HBsAg）[1]。作為最早發(fā)現(xiàn)的經(jīng)輸血傳播的病毒，乙型肝炎病毒驅(qū)動(dòng)了現(xiàn)代診斷技術(shù)的發(fā)展，一系列血液篩查檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展均與乙肝病毒檢測(cè)相關(guān)。美國(guó)血站在1971年開始對(duì)獻(xiàn)血者進(jìn)行HBsAg篩查，最先使用的方法為凝膠擴(kuò)散法，但該方法靈敏度不足，且對(duì)于血站的日常工作來說用時(shí)較長(zhǎng)。隨后血站使用對(duì)流電泳的方法進(jìn)行HBsAg檢測(cè)，加速免疫沉淀的形成。1972年美國(guó)法律正式規(guī)定每一個(gè)獻(xiàn)血者的血樣必須進(jìn)行HBsAg篩查，降低了輸血后乙型肝炎的感染風(fēng)險(xiǎn)[2]。1964年，諾貝爾獎(jiǎng)獲得者Yalow等在研究糖尿病患者血液中胰島素含量時(shí)，發(fā)明了一項(xiàng)新檢測(cè)技術(shù)——放射免疫分析法[3]。這種方法用于HBsAg檢測(cè)，不僅更便捷且靈敏度是之前檢測(cè)方法的1000倍[4]。1972年由生化專家LacyOverby，Ghung-MeiLing和RichardDecker組成的研究團(tuán)隊(duì)，于美國(guó)雅培公司的芝加哥實(shí)驗(yàn)室，研發(fā)了第一個(gè)檢測(cè)傳染病標(biāo)記物的商品化放射免疫檢測(cè)方法[5]，該技術(shù)是一種固相夾心法放射免疫檢測(cè)方法，命名為Ausria-125。該檢測(cè)方式實(shí)現(xiàn)了兩點(diǎn)創(chuàng)新，一是使用新技術(shù)將放射性物質(zhì)，如碘-125標(biāo)記在抗原或抗體上；二是這是第一個(gè)成熟的固相免疫檢測(cè)系統(tǒng)，將沒有標(biāo)記的HBsAg抗體鏈接至固相載體上，捕獲待檢樣本中HBsAg，隨后HBsAg與鏈接了碘-125的HBsAg抗體結(jié)合完成檢測(cè)。后續(xù)的HBsAg和其他病原體的檢測(cè)方法，是在該檢測(cè)原理的基礎(chǔ)上，將鏈接的碘-125置換為酶或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，逐漸發(fā)展為我們現(xiàn)在所用的酶免疫和化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑。（二）丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus，HCV）采取自愿無償獻(xiàn)血和HBsAg篩查后，輸血相關(guān)性肝炎減少了70%，輸血相關(guān)性乙肝減少了85%[6]。但輸血相關(guān)性肝炎的病例仍在繼續(xù)發(fā)生，其中大多數(shù)（75%）并不是由HBV造成的。1973年發(fā)現(xiàn)甲型肝炎病毒（HAV）[7]，并隨即研發(fā)了HAV抗體的血清學(xué)檢測(cè)試劑。對(duì)輸血相關(guān)性肝炎的受血者和獻(xiàn)血者進(jìn)行抗-HAV檢測(cè)時(shí)，均為非反應(yīng)性結(jié)果，當(dāng)時(shí)推測(cè)HAV可能不是導(dǎo)致輸血性肝炎的病原體[8]。于是開始尋找非A非B（NANB）肝炎病原體。在未發(fā)現(xiàn)NANB肝炎病原體的期間，血站進(jìn)行了替代性試驗(yàn)，例如轉(zhuǎn)氨酶和抗-HBc用于獻(xiàn)血者的篩查[9]。最后在1989年發(fā)現(xiàn)丙型肝炎病毒（HCV）[10]。HCV血清學(xué)檢測(cè)試劑隨著檢測(cè)原理和性能的變更，命名為不同的“世代”。第一代檢測(cè)試劑的靈敏度有限，僅使用了抗原c100-3（NS4），僅占病毒基因組的12%[11]。可以在感染后12～26周，檢測(cè)到HCV抗體，這造成了較長(zhǎng)的檢測(cè)窗口期。第二代HCV抗體檢測(cè)試劑中加入了額外兩個(gè)表位，一個(gè)是核心區(qū)多肽C22-3，另一個(gè)是非結(jié)構(gòu)性抗原（NS3）。HCV感染后，抗HCVC22-3和NS3區(qū)抗體出現(xiàn)較早，而且是HCV特異性抗體，因此二代試劑檢測(cè)的靈敏度和特異性均得到提高，且將窗口期范圍減少到10～24周。第三代HCV抗體檢測(cè)試劑中的核心抗原的比例相應(yīng)降低，提高了NS3抗原的比例，并加入了額外的非結(jié)構(gòu)性HCV抗原（NS5），提高了試劑的靈敏度和特異性，并將窗口周期進(jìn)一步減少了一周。隨后發(fā)展的HCV血清學(xué)檢測(cè)試劑為HCV抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑，同時(shí)檢測(cè)HCV核心抗原和抗體。該試劑被叫作“第四代”或“抗原抗體聯(lián)合”HCV檢測(cè)試劑。這種試劑通常使用的是夾心法酶免疫或化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)方法，在固態(tài)表面鏈接HCV抗原和核心抗體。目前已研發(fā)出基于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)的HCV抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑。Shah等研究者使用PRISM系統(tǒng)分析了HCV抗原抗體聯(lián)系檢測(cè)試劑的性能，該試劑以互不反應(yīng)的抗HCV核心抗原單克隆抗體和重組NS3核心抗原包被微球粒子來捕捉血清中的核心抗原和抗體，隨后使用吖啶酯標(biāo)記的抗人IgG和抗HCV單克隆抗體來檢測(cè)捕獲的抗體和抗原，最后通過化學(xué)發(fā)光顯色進(jìn)行檢測(cè)。該研究檢測(cè)了23組血清抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)的獻(xiàn)血者，結(jié)果表明對(duì)于HCVRNA陽(yáng)性但HCV抗體檢測(cè)陰性的樣本，HCV感染的檢出率為89.9%。與PRISM的抗-HCV試劑相比，抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)可將血清轉(zhuǎn)換的窗口期縮短至平均的34.3天，僅比HCVRNA核酸檢測(cè)方法平均晚3.6天。且靈敏度達(dá)到100%，特異性為99.8%[12]。（三）人類免疫缺陷病毒（HumanImmunadeficiencyVirus，HIV）20多年前，首個(gè)用于獻(xiàn)血者篩查和艾滋病毒感染實(shí)驗(yàn)室診斷的酶免疫檢測(cè)獲得許可后，HIV的血清學(xué)檢測(cè)試劑已從第一代發(fā)展至第四代。一代和二代HIV抗體檢測(cè)試劑均為間接反應(yīng)，區(qū)別在于一代試劑中使用的抗原來自病毒裂解液，二代試劑使用的為重組HIV蛋白或合成的多肽，提高了試劑的特異性，因此檢測(cè)的陽(yáng)性預(yù)期值也有所提升。并且在二代試劑中，廠家開始在包被的抗原中添加HIV-2型和HIV-1O型的抗原蛋白，這兩種HIV基因型最早在西非發(fā)現(xiàn)，并逐漸在世界各地開始流行[13]。第二代HIV檢測(cè)試劑可將檢測(cè)的窗口期縮短至4～6周。三代HIV檢測(cè)試劑同樣使用重組的HIV蛋白或合成的多肽，但將檢測(cè)技術(shù)發(fā)展至夾心法，并增加了對(duì)抗-HIVIgM的檢測(cè)[14][15]［14-15］，使HIV抗體的檢測(cè)水平有了進(jìn)一步的提高。由于第三代抗-HIV試劑同時(shí)檢測(cè)IgM和IgG，因此比之前的抗-IgG系統(tǒng)能更早地檢測(cè)到HIV抗體，將HIV檢測(cè)的窗口期縮短至約三周。在20世紀(jì)90年代晚期，試劑廠家將HIV檢測(cè)試劑發(fā)展至第四代，使用酶免疫或化學(xué)發(fā)光的方法同時(shí)檢測(cè)HIV抗體和p24抗原。因?yàn)镠IVp24抗原的產(chǎn)生要早于抗體[16]，第四代HIV檢測(cè)試劑可以將檢測(cè)的窗口期縮短至約兩周，且檢測(cè)性能較HIV第三代試劑更優(yōu)異[17]。2010年8月美國(guó)FDA才許可了第一個(gè)HIV第四代檢測(cè)試劑，其來自美國(guó)雅培公司的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)。該試劑對(duì)3386名HIV感染者、7551名未感染者和58名HIV急性感染患者的研究發(fā)現(xiàn)，試劑的靈敏度可以達(dá)到99.94%，重復(fù)特異性達(dá)到99.5%[18]。隨后其他廠家逐漸取得FDA的許可，2011年伯樂公司第四代GSELISA試劑取得許可，2015年西門子公司的ADVIA第四代試劑取得許可。但不同廠家的HIV第四代試劑間的性能間有一些差異，一項(xiàng)多試劑平行比較的研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)1225例臨床樣本、81例血清轉(zhuǎn)換盤中的樣本，使用4個(gè)四代HIV試劑檢測(cè)，AxSYM、ARCHITECT、Elecsys2010HIVCombi和ElecsysHIVCombiPT的靈敏度均為100%，特異性分別為99.6%、99.6%、99.0%and99.5%[19]。另一項(xiàng)早期的多試劑比較研究，也有類似的結(jié)果，6家HIV第四代檢測(cè)試劑中，雅培AxSYM的靈敏度和特異性最高，可以將血清學(xué)檢測(cè)的窗口期縮短2.0～2.35天，而其他四代試劑可以將窗口期縮短1～2.17天。（四）血液篩查免疫技術(shù)的發(fā)展從上述血液篩查免疫檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展歷程中可以發(fā)現(xiàn)，血液篩查免疫技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了凝膠擴(kuò)散法—對(duì)流電泳法—放射免疫法—酶聯(lián)免疫法—化學(xué)發(fā)光法的變革。隨著檢測(cè)技術(shù)的變革，主要出現(xiàn)兩個(gè)方面的變化：（1）全自動(dòng)檢測(cè)設(shè)備對(duì)手工操作的替代，全自動(dòng)檢測(cè)設(shè)備一方面減少了人工操作帶來的高變異和差錯(cuò)，另一方面自動(dòng)化實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)的高通量，縮短了周轉(zhuǎn)時(shí)間，提高了血站的運(yùn)營(yíng)效率，滿足了實(shí)驗(yàn)室日益增長(zhǎng)的檢測(cè)量的需求；（2）標(biāo)記方式的變化，從最早的凝集擴(kuò)散法和對(duì)流電泳法的沉淀反應(yīng)，到最靈敏的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度和穩(wěn)定性越來越高，提高了試劑的靈敏度。除了檢測(cè)原理和技術(shù)上的革新，血液篩查免疫技術(shù)的另一方面的發(fā)展，是試劑中抗原/抗體的選擇和標(biāo)記物鏈接方式的變革。一是實(shí)現(xiàn)對(duì)不同基因型和對(duì)病毒突變體的檢測(cè)，減少病原體的漏檢風(fēng)險(xiǎn)。以乙肝病毒為例，中國(guó)是乙肝病毒的高流行地區(qū)，HBVpreS/S變異會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)逃逸[20][21]。由于不同公司設(shè)計(jì)的包被抗原或抗體的不同，導(dǎo)致對(duì)突變體的檢測(cè)能力上的差異，這也是試劑持續(xù)改進(jìn)的一個(gè)重要方面。美國(guó)的研究團(tuán)隊(duì)在2017年報(bào)道了一例HBV漏檢的血液透析患者，其為HBVS片段G145R點(diǎn)突變，CDC調(diào)查發(fā)現(xiàn)該患者之前的檢測(cè)由于HBV突變導(dǎo)致了漏檢，而其他廠家的試劑可以檢出[22]。另一項(xiàng)Architect和ElecsysHBV試劑對(duì)突變體的檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)試劑均能檢出35種HBsAg突變體，但對(duì)P142L、P142S和G145K這三種突變體，檢測(cè)能力存在差異，一種試劑對(duì)病毒抗原的結(jié)合力更強(qiáng)[23]。二是反應(yīng)體系中標(biāo)記物的鏈接方式，會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果，影響檢測(cè)試劑的性能。生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)是免疫檢測(cè)中常用的一種信號(hào)放大體系，被廣泛用于多種自動(dòng)化檢測(cè)系統(tǒng)中，如羅氏的Elecsys和分子檢測(cè)平臺(tái)、強(qiáng)生的OrthoVitros檢測(cè)系統(tǒng)等。但生物素也是一種保健品和添加劑，我們?nèi)粘５氖澄镏幸埠幸欢康纳锼?，人們可能在已知或未知的情況下服用大量的生物素。在檢測(cè)過程中，外服的生物素會(huì)占用反應(yīng)體系中的結(jié)合位點(diǎn)，造成假陰性（夾心/間接法）或假陽(yáng)性（競(jìng)爭(zhēng)法）結(jié)果，影響診斷結(jié)果[24][25]。因此為保障臨床用血安全，也應(yīng)考慮外源因素對(duì)檢測(cè)的干擾，改進(jìn)標(biāo)記物的鏈接方式，將這一方面的干擾降至最低。二核酸檢測(cè)技術(shù)在20世紀(jì)90年代末期到21世紀(jì)初，一些發(fā)達(dá)國(guó)家開始使用核酸檢測(cè)篩查HCV和HIV-1型病毒，隨后進(jìn)行HBV的核酸篩查。核酸檢測(cè)的方式逐漸發(fā)展成為半自動(dòng)化或全自動(dòng)化的高通量獻(xiàn)血者樣本檢測(cè)體系，通過對(duì)樣本中少量的RNA/DNA物質(zhì)的擴(kuò)增檢測(cè)，可以檢測(cè)出樣本中的微量病原體。目前血站所采用的核酸檢測(cè)技術(shù)主要分為兩類：（1）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）；（2）轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增（TranscriptionMediatedAmplification，TMA）[26]。核酸檢測(cè)的靈敏度高，可以檢測(cè)出樣本中微量的核酸物質(zhì)，在病毒感染數(shù)天后即可檢出，大大縮短了檢測(cè)的窗口期。有研究報(bào)道，HIV、HCV和HBV血清學(xué)檢測(cè)的窗口期分別為約16天、70天和45天；核酸混合樣本檢測(cè)可將窗口期縮短至約11天、10天和39天；核酸單樣本檢測(cè)可將窗口期縮短至約7天、7天和20天[27]。三中國(guó)血液篩查技術(shù)的發(fā)展中國(guó)的輸血事業(yè)相對(duì)于國(guó)外起步較晚，但發(fā)展迅速。1944年在昆明成立我國(guó)第一個(gè)獨(dú)立的血庫(kù)。1958年，中國(guó)第一家血站在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院成立，隨后在北京、南京、武漢、西安等地先后成立血站。在1998年《中華人民共和國(guó)獻(xiàn)血法》頒布實(shí)施前，我國(guó)的血液篩查以獻(xiàn)血前酶免疫篩查為主，只有檢測(cè)合格的獻(xiàn)血者才能繼續(xù)獻(xiàn)血。在1998年后，血站逐漸將獻(xiàn)血前酶免疫檢測(cè)變更為快速篩查，以減少獻(xiàn)血者的等候時(shí)間。這時(shí)，血站加強(qiáng)了獻(xiàn)血后的檢測(cè)工作，對(duì)每份樣本進(jìn)行2種ELISA試劑的雙遍檢測(cè)，檢測(cè)項(xiàng)目覆蓋HBsAg/HIV抗體/HCV抗體和梅毒抗體檢測(cè)[28]。2010年血液篩查的核酸檢測(cè)技術(shù)被引入中國(guó)，15家血液中心作為核酸檢測(cè)的試點(diǎn)單位[29]。2013年，中國(guó)衛(wèi)健委推動(dòng)核酸檢測(cè)在中國(guó)血液篩查工作中的全面應(yīng)用[30]，于2015年實(shí)現(xiàn)血站核酸檢測(cè)的全覆蓋。雖然核酸檢測(cè)的全面普及，提高了血液安全，但我國(guó)的血液篩查技術(shù)同發(fā)達(dá)國(guó)家間仍有一定的差距。主要體現(xiàn)在兩點(diǎn)。一是我國(guó)血液篩查的血清學(xué)檢測(cè)仍為ELISA，該方法具有易操作和價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，但由于方法學(xué)的限制，該方法屬于手工或半自動(dòng)化檢測(cè)方法，具有重復(fù)性不好、靈敏度和特異性不高、容易受檢測(cè)過程中不同因素的干擾等缺點(diǎn)。而化學(xué)法光檢測(cè)技術(shù)為全自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)，具有高靈敏度、快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、線性范圍寬、安全無毒、無放射性污染等優(yōu)點(diǎn)。用于血液篩查可減少假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，減少獻(xiàn)血者隊(duì)伍不必要的流失，保障臨床用血安全。國(guó)外眾多的血站處于血液安全的考慮，已在十多年前轉(zhuǎn)為使用化學(xué)發(fā)