血液篩查技術(shù)的歷史沿革及未來展望

血液篩查技術(shù)的歷史沿革及未來展望

現(xiàn)代血站最為擔(dān)心的是經(jīng)輸血傳播疾病的發(fā)生，人們最開始發(fā)現(xiàn)梅毒可經(jīng)輸血傳播，隨后開始關(guān)注輸血相關(guān)性肝炎，對血液安全的關(guān)注在20世紀80年代發(fā)現(xiàn)艾滋病可經(jīng)輸血傳播后，達到了一個高峰。提高血液安全，一方面是篩選合適的獻血者，通過宣傳、無償獻血的推廣和獻血前問卷調(diào)查，將不適宜的獻血者先行淘汰；另一方面是獻血者樣本的實驗室檢測，這依賴于傳染病檢測技術(shù)的不斷發(fā)展和血站檢測技術(shù)的持續(xù)更新。本文對三項主要的經(jīng)血傳播病毒性疾病，即人類免疫缺陷病毒、乙肝病毒和丙肝病毒、檢測技術(shù)和血站應(yīng)用中的變革進行總結(jié)，并展望中國血液篩查技術(shù)的未來發(fā)展。一血液篩查血清學(xué)檢測技術(shù)（一）乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus，HBV）現(xiàn)代對肝炎病毒的研究，始于1963年諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎獲得者BaruchS.Blumberg（1925-2011）發(fā)現(xiàn)的命名為澳大利亞抗原（AuAg）的新抗原，AuAg也是第一個肝炎病毒的特異性檢測標志物，1971年巴黎國際肝炎討論會上，將之命名為乙型肝炎抗原（HBsAg）[1]。作為最早發(fā)現(xiàn)的經(jīng)輸血傳播的病毒，乙型肝炎病毒驅(qū)動了現(xiàn)代診斷技術(shù)的發(fā)展，一系列血液篩查檢測技術(shù)的發(fā)展均與乙肝病毒檢測相關(guān)。美國血站在1971年開始對獻血者進行HBsAg篩查，最先使用的方法為凝膠擴散法，但該方法靈敏度不足，且對于血站的日常工作來說用時較長。隨后血站使用對流電泳的方法進行HBsAg檢測，加速免疫沉淀的形成。1972年美國法律正式規(guī)定每一個獻血者的血樣必須進行HBsAg篩查，降低了輸血后乙型肝炎的感染風(fēng)險[2]。1964年，諾貝爾獎獲得者Yalow等在研究糖尿病患者血液中胰島素含量時，發(fā)明了一項新檢測技術(shù)——放射免疫分析法[3]。這種方法用于HBsAg檢測，不僅更便捷且靈敏度是之前檢測方法的1000倍[4]。1972年由生化專家LacyOverby，Ghung-MeiLing和RichardDecker組成的研究團隊，于美國雅培公司的芝加哥實驗室，研發(fā)了第一個檢測傳染病標記物的商品化放射免疫檢測方法[5]，該技術(shù)是一種固相夾心法放射免疫檢測方法，命名為Ausria-125。該檢測方式實現(xiàn)了兩點創(chuàng)新，一是使用新技術(shù)將放射性物質(zhì)，如碘-125標記在抗原或抗體上；二是這是第一個成熟的固相免疫檢測系統(tǒng)，將沒有標記的HBsAg抗體鏈接至固相載體上，捕獲待檢樣本中HBsAg，隨后HBsAg與鏈接了碘-125的HBsAg抗體結(jié)合完成檢測。后續(xù)的HBsAg和其他病原體的檢測方法，是在該檢測原理的基礎(chǔ)上，將鏈接的碘-125置換為酶或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，逐漸發(fā)展為我們現(xiàn)在所用的酶免疫和化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑。（二）丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus，HCV）采取自愿無償獻血和HBsAg篩查后，輸血相關(guān)性肝炎減少了70%，輸血相關(guān)性乙肝減少了85%[6]。但輸血相關(guān)性肝炎的病例仍在繼續(xù)發(fā)生，其中大多數(shù)（75%）并不是由HBV造成的。1973年發(fā)現(xiàn)甲型肝炎病毒（HAV）[7]，并隨即研發(fā)了HAV抗體的血清學(xué)檢測試劑。對輸血相關(guān)性肝炎的受血者和獻血者進行抗-HAV檢測時，均為非反應(yīng)性結(jié)果，當(dāng)時推測HAV可能不是導(dǎo)致輸血性肝炎的病原體[8]。于是開始尋找非A非B（NANB）肝炎病原體。在未發(fā)現(xiàn)NANB肝炎病原體的期間，血站進行了替代性試驗，例如轉(zhuǎn)氨酶和抗-HBc用于獻血者的篩查[9]。最后在1989年發(fā)現(xiàn)丙型肝炎病毒（HCV）[10]。HCV血清學(xué)檢測試劑隨著檢測原理和性能的變更，命名為不同的“世代”。第一代檢測試劑的靈敏度有限，僅使用了抗原c100-3（NS4），僅占病毒基因組的12%[11]。可以在感染后12～26周，檢測到HCV抗體，這造成了較長的檢測窗口期。第二代HCV抗體檢測試劑中加入了額外兩個表位，一個是核心區(qū)多肽C22-3，另一個是非結(jié)構(gòu)性抗原（NS3）。HCV感染后，抗HCVC22-3和NS3區(qū)抗體出現(xiàn)較早，而且是HCV特異性抗體，因此二代試劑檢測的靈敏度和特異性均得到提高，且將窗口期范圍減少到10～24周。第三代HCV抗體檢測試劑中的核心抗原的比例相應(yīng)降低，提高了NS3抗原的比例，并加入了額外的非結(jié)構(gòu)性HCV抗原（NS5），提高了試劑的靈敏度和特異性，并將窗口周期進一步減少了一周。隨后發(fā)展的HCV血清學(xué)檢測試劑為HCV抗原抗體聯(lián)合檢測試劑，同時檢測HCV核心抗原和抗體。該試劑被叫作“第四代”或“抗原抗體聯(lián)合”HCV檢測試劑。這種試劑通常使用的是夾心法酶免疫或化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法，在固態(tài)表面鏈接HCV抗原和核心抗體。目前已研發(fā)出基于全自動化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)的HCV抗原抗體聯(lián)合檢測試劑。Shah等研究者使用PRISM系統(tǒng)分析了HCV抗原抗體聯(lián)系檢測試劑的性能，該試劑以互不反應(yīng)的抗HCV核心抗原單克隆抗體和重組NS3核心抗原包被微球粒子來捕捉血清中的核心抗原和抗體，隨后使用吖啶酯標記的抗人IgG和抗HCV單克隆抗體來檢測捕獲的抗體和抗原，最后通過化學(xué)發(fā)光顯色進行檢測。該研究檢測了23組血清抗體陽轉(zhuǎn)的獻血者，結(jié)果表明對于HCVRNA陽性但HCV抗體檢測陰性的樣本，HCV感染的檢出率為89.9%。與PRISM的抗-HCV試劑相比，抗原抗體聯(lián)合檢測可將血清轉(zhuǎn)換的窗口期縮短至平均的34.3天，僅比HCVRNA核酸檢測方法平均晚3.6天。且靈敏度達到100%，特異性為99.8%[12]。（三）人類免疫缺陷病毒（HumanImmunadeficiencyVirus，HIV）20多年前，首個用于獻血者篩查和艾滋病毒感染實驗室診斷的酶免疫檢測獲得許可后，HIV的血清學(xué)檢測試劑已從第一代發(fā)展至第四代。一代和二代HIV抗體檢測試劑均為間接反應(yīng)，區(qū)別在于一代試劑中使用的抗原來自病毒裂解液，二代試劑使用的為重組HIV蛋白或合成的多肽，提高了試劑的特異性，因此檢測的陽性預(yù)期值也有所提升。并且在二代試劑中，廠家開始在包被的抗原中添加HIV-2型和HIV-1O型的抗原蛋白，這兩種HIV基因型最早在西非發(fā)現(xiàn)，并逐漸在世界各地開始流行[13]。第二代HIV檢測試劑可將檢測的窗口期縮短至4～6周。三代HIV檢測試劑同樣使用重組的HIV蛋白或合成的多肽，但將檢測技術(shù)發(fā)展至夾心法，并增加了對抗-HIVIgM的檢測[14][15]［14-15］，使HIV抗體的檢測水平有了進一步的提高。由于第三代抗-HIV試劑同時檢測IgM和IgG，因此比之前的抗-IgG系統(tǒng)能更早地檢測到HIV抗體，將HIV檢測的窗口期縮短至約三周。在20世紀90年代晚期，試劑廠家將HIV檢測試劑發(fā)展至第四代，使用酶免疫或化學(xué)發(fā)光的方法同時檢測HIV抗體和p24抗原。因為HIVp24抗原的產(chǎn)生要早于抗體[16]，第四代HIV檢測試劑可以將檢測的窗口期縮短至約兩周，且檢測性能較HIV第三代試劑更優(yōu)異[17]。2010年8月美國FDA才許可了第一個HIV第四代檢測試劑，其來自美國雅培公司的化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)。該試劑對3386名HIV感染者、7551名未感染者和58名HIV急性感染患者的研究發(fā)現(xiàn)，試劑的靈敏度可以達到99.94%，重復(fù)特異性達到99.5%[18]。隨后其他廠家逐漸取得FDA的許可，2011年伯樂公司第四代GSELISA試劑取得許可，2015年西門子公司的ADVIA第四代試劑取得許可。但不同廠家的HIV第四代試劑間的性能間有一些差異，一項多試劑平行比較的研究發(fā)現(xiàn)，對1225例臨床樣本、81例血清轉(zhuǎn)換盤中的樣本，使用4個四代HIV試劑檢測，AxSYM、ARCHITECT、Elecsys2010HIVCombi和ElecsysHIVCombiPT的靈敏度均為100%，特異性分別為99.6%、99.6%、99.0%and99.5%[19]。另一項早期的多試劑比較研究，也有類似的結(jié)果，6家HIV第四代檢測試劑中，雅培AxSYM的靈敏度和特異性最高，可以將血清學(xué)檢測的窗口期縮短2.0～2.35天，而其他四代試劑可以將窗口期縮短1～2.17天。（四）血液篩查免疫技術(shù)的發(fā)展從上述血液篩查免疫檢測技術(shù)的發(fā)展歷程中可以發(fā)現(xiàn)，血液篩查免疫技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了凝膠擴散法—對流電泳法—放射免疫法—酶聯(lián)免疫法—化學(xué)發(fā)光法的變革。隨著檢測技術(shù)的變革，主要出現(xiàn)兩個方面的變化：（1）全自動檢測設(shè)備對手工操作的替代，全自動檢測設(shè)備一方面減少了人工操作帶來的高變異和差錯，另一方面自動化實現(xiàn)了檢測的高通量，縮短了周轉(zhuǎn)時間，提高了血站的運營效率，滿足了實驗室日益增長的檢測量的需求；（2）標記方式的變化，從最早的凝集擴散法和對流電泳法的沉淀反應(yīng)，到最靈敏的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，檢測信號的強度和穩(wěn)定性越來越高，提高了試劑的靈敏度。除了檢測原理和技術(shù)上的革新，血液篩查免疫技術(shù)的另一方面的發(fā)展，是試劑中抗原/抗體的選擇和標記物鏈接方式的變革。一是實現(xiàn)對不同基因型和對病毒突變體的檢測，減少病原體的漏檢風(fēng)險。以乙肝病毒為例，中國是乙肝病毒的高流行地區(qū)，HBVpreS/S變異會導(dǎo)致檢測逃逸[20][21]。由于不同公司設(shè)計的包被抗原或抗體的不同，導(dǎo)致對突變體的檢測能力上的差異，這也是試劑持續(xù)改進的一個重要方面。美國的研究團隊在2017年報道了一例HBV漏檢的血液透析患者，其為HBVS片段G145R點突變，CDC調(diào)查發(fā)現(xiàn)該患者之前的檢測由于HBV突變導(dǎo)致了漏檢，而其他廠家的試劑可以檢出[22]。另一項Architect和ElecsysHBV試劑對突變體的檢測分析發(fā)現(xiàn)，兩個試劑均能檢出35種HBsAg突變體，但對P142L、P142S和G145K這三種突變體，檢測能力存在差異，一種試劑對病毒抗原的結(jié)合力更強[23]。二是反應(yīng)體系中標記物的鏈接方式，會干擾檢測結(jié)果，影響檢測試劑的性能。生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)是免疫檢測中常用的一種信號放大體系，被廣泛用于多種自動化檢測系統(tǒng)中，如羅氏的Elecsys和分子檢測平臺、強生的OrthoVitros檢測系統(tǒng)等。但生物素也是一種保健品和添加劑，我們?nèi)粘５氖澄镏幸埠幸欢康纳锼?，人們可能在已知或未知的情況下服用大量的生物素。在檢測過程中，外服的生物素會占用反應(yīng)體系中的結(jié)合位點，造成假陰性（夾心/間接法）或假陽性（競爭法）結(jié)果，影響診斷結(jié)果[24][25]。因此為保障臨床用血安全，也應(yīng)考慮外源因素對檢測的干擾，改進標記物的鏈接方式，將這一方面的干擾降至最低。二核酸檢測技術(shù)在20世紀90年代末期到21世紀初，一些發(fā)達國家開始使用核酸檢測篩查HCV和HIV-1型病毒，隨后進行HBV的核酸篩查。核酸檢測的方式逐漸發(fā)展成為半自動化或全自動化的高通量獻血者樣本檢測體系，通過對樣本中少量的RNA/DNA物質(zhì)的擴增檢測，可以檢測出樣本中的微量病原體。目前血站所采用的核酸檢測技術(shù)主要分為兩類：（1）聚合酶鏈式反應(yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）；（2）轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增（TranscriptionMediatedAmplification，TMA）[26]。核酸檢測的靈敏度高，可以檢測出樣本中微量的核酸物質(zhì)，在病毒感染數(shù)天后即可檢出，大大縮短了檢測的窗口期。有研究報道，HIV、HCV和HBV血清學(xué)檢測的窗口期分別為約16天、70天和45天；核酸混合樣本檢測可將窗口期縮短至約11天、10天和39天；核酸單樣本檢測可將窗口期縮短至約7天、7天和20天[27]。三中國血液篩查技術(shù)的發(fā)展中國的輸血事業(yè)相對于國外起步較晚，但發(fā)展迅速。1944年在昆明成立我國第一個獨立的血庫。1958年，中國第一家血站在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院成立，隨后在北京、南京、武漢、西安等地先后成立血站。在1998年《中華人民共和國獻血法》頒布實施前，我國的血液篩查以獻血前酶免疫篩查為主，只有檢測合格的獻血者才能繼續(xù)獻血。在1998年后，血站逐漸將獻血前酶免疫檢測變更為快速篩查，以減少獻血者的等候時間。這時，血站加強了獻血后的檢測工作，對每份樣本進行2種ELISA試劑的雙遍檢測，檢測項目覆蓋HBsAg/HIV抗體/HCV抗體和梅毒抗體檢測[28]。2010年血液篩查的核酸檢測技術(shù)被引入中國，15家血液中心作為核酸檢測的試點單位[29]。2013年，中國衛(wèi)健委推動核酸檢測在中國血液篩查工作中的全面應(yīng)用[30]，于2015年實現(xiàn)血站核酸檢測的全覆蓋。雖然核酸檢測的全面普及，提高了血液安全，但我國的血液篩查技術(shù)同發(fā)達國家間仍有一定的差距。主要體現(xiàn)在兩點。一是我國血液篩查的血清學(xué)檢測仍為ELISA，該方法具有易操作和價格低廉等優(yōu)點，但由于方法學(xué)的限制，該方法屬于手工或半自動化檢測方法，具有重復(fù)性不好、靈敏度和特異性不高、容易受檢測過程中不同因素的干擾等缺點。而化學(xué)法光檢測技術(shù)為全自動檢測系統(tǒng)，具有高靈敏度、快速、準確、重復(fù)性好、線性范圍寬、安全無毒、無放射性污染等優(yōu)點。用于血液篩查可減少假陽性和假陰性結(jié)果，減少獻血者隊伍不必要的流失，保障臨床用血安全。國外眾多的血站處于血液安全的考慮，已在十多年前轉(zhuǎn)為使用化學(xué)發(fā)