人教基因工程操作程序

人教基因工程操作程序第1頁/共28頁

基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞操作過程目的基因的檢測與鑒定第2頁/共28頁第3頁/共28頁

目的基因主要是指______________________編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因目的基因的獲取供體生物細(xì)胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因即：將需要的基因從供體生物細(xì)胞內(nèi)提取出來目前被廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、植物抗病基因（抗病毒、抗細(xì)菌)、人胰島素基因等。第4頁/共28頁

1）從基因文庫中獲取目的基因1.什么是基因文庫？2.怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因？種類：基因組文庫：部分基因文庫(cDNA文庫)：獲得目的基因的方法2）2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因3）人工合成

含有一種生物的全部基因含有一種生物的部分基因根據(jù)基因的有關(guān)信息：如基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA第5頁/共28頁1.用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出____________。2.用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________?！?/p>

核心3.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個重組

DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同(二)基因表達(dá)載體的構(gòu)建第6頁/共28頁基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心質(zhì)粒DNA分子一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種限制酶

目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過程，實(shí)際上是不同來源的基因重組的過程。第7頁/共28頁

科學(xué)家在培育抗蟲棉時，經(jīng)過了許多復(fù)雜的過程和不懈的努力，才獲得成功。起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲基因在棉花體內(nèi)沒有表達(dá)。然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入啟動子(抗蟲基因首端)，導(dǎo)入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力?？茖W(xué)家又在有啟動子、抗蟲基因的質(zhì)粒中插入終止子(抗蟲基因末端)，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長的植株，有了抗蟲能力。資料:第8頁/共28頁基因表達(dá)載體的組成：目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標(biāo)記基因第9頁/共28頁(三)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞常用的受體細(xì)胞：動植物細(xì)胞、大腸桿菌、土壤農(nóng)桿菌、枯草桿菌等。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理：借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。轉(zhuǎn)化——目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)第10頁/共28頁方法導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入動物細(xì)胞導(dǎo)入微生物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——

感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子(三)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞第11頁/共28頁(四)目的基因的檢測與鑒定——檢查是否成功檢測—鑒定—①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA

上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法——方法——方法——DNA分子雜交DNA分子雜交抗原-抗體雜交第12頁/共28頁第13頁/共28頁P(yáng)CR技術(shù)—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

原理：前提：條件：PCR擴(kuò)增儀DNA雙鏈復(fù)制的基本原理一段已知目的基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶）DNA的兩條鏈為模板溫度控制第14頁/共28頁類別項(xiàng)目

復(fù)制

轉(zhuǎn)錄場所特點(diǎn)模板原料酶能量堿基配對產(chǎn)物細(xì)胞核只有DNA的一條鏈四種核糖核苷酸RNA聚合酶ATPA-UC-GT-AG-C細(xì)胞核DNA的兩條鏈四種脫氧核苷酸解旋酶、DNA聚合酶ATPA-TC-GT-AG-C兩個雙鏈DNA分子一條單鏈mRNA邊解旋邊復(fù)制，半保留復(fù)制邊解旋邊轉(zhuǎn)錄第15頁/共28頁5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/引物ⅡG—G變性復(fù)性延伸1.目的基因DNA受熱變性，解鏈；2.引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合；3.合成鏈在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸。5/3/A—G引物Ⅰ第16頁/共28頁利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因第17頁/共28頁P(yáng)CR技術(shù)擴(kuò)增過程a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，

斷裂，形成_______

b、復(fù)性（55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈第18頁/共28頁目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA）雙鏈DNA(即目的基因)反轉(zhuǎn)錄合成1）反轉(zhuǎn)錄法：

以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列目的基因推測推測化學(xué)合成2）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：第19頁/共28頁2.微生物作受體細(xì)胞原因：將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞3.轉(zhuǎn)化方法：大腸桿菌繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對少

處理細(xì)胞→

細(xì)胞→表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合→_________細(xì)胞吸收DNA分子。Ca2+感受態(tài)感受態(tài)1.常用菌：第20頁/共28頁

目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞整合到受體細(xì)胞的染色體上目的基因的遺傳特性得以維持穩(wěn)定和表達(dá)1.農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植物。Ti質(zhì)粒的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞的染色體上2.轉(zhuǎn)化第21頁/共28頁第22頁/共28頁如果顯示出雜交帶，就表明待測樣品含有目的基因或目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)錄。第23頁/共28頁1.下表關(guān)于基因工程中有關(guān)基因操作的名詞及對應(yīng)的內(nèi)容，正確的組合是 2、下列屬于獲取目的基因的方法的是()①利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成②從基因組文庫中提?、蹚氖荏w細(xì)胞中提?、芾肞CR技術(shù)⑤利用DNA轉(zhuǎn)錄 ⑥人工合成A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥第24頁/共28頁3.細(xì)菌的質(zhì)粒分子帶有一個抗菌素抗性基因，該抗性基因在基因工程中的主要作用是

A．提高受體細(xì)胞在自然環(huán)境中的耐藥性B．有利于對目的基因是否導(dǎo)入進(jìn)行檢測C．增加質(zhì)粒分子的分子量D．便于與外源基因連接4.

有關(guān)基因工程的敘述正確的是A．限制酶只在獲得目的基因時才用B．重組質(zhì)粒的形成是在細(xì)胞內(nèi)完成的C．質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體D．蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料第25頁/共28頁5.哪項(xiàng)不是基因表達(dá)載體的組成部分()A.啟動子B.終止密碼

C.標(biāo)記基因D.目的基因6.下列哪項(xiàng)不是將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法()A．基因槍法B．顯微注射法

C.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法