酶學(xué)分析技術(shù)

關(guān)于酶學(xué)分析技術(shù)第1頁，共29頁，2023年，2月20日，星期六酶是生物體內(nèi)活細胞合成的具有高效、特異催化作功能的蛋白質(zhì)。什么是酶enzyme?目前將生物催化劑分為兩類:蛋白質(zhì)酶、核酶（脫氧核酶）第2頁，共29頁，2023年，2月20日，星期六底物(substrate,S)：被催化的物質(zhì)。產(chǎn)物(product,P)：反應(yīng)生成的物質(zhì)。酶促反應(yīng)：酶催化的反應(yīng)。酶活力：酶所具有的催化能力。幾個有關(guān)名詞丙氨酸谷氨酸第3頁，共29頁，2023年，2月20日，星期六常見酶類丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ALT或GPT乳酸脫氫酶（LDH）

天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST或GOT）

肌酸激酶（CK）

5′-核苷酸酶（5′-NT)α-羥丁酸脫氫酶（α-HBD)第4頁，共29頁，2023年，2月20日，星期六一、酶活性定義：酶活性（enzymeactivity）也稱為酶活力，指酶促反應(yīng)速率，即規(guī)定條件下在單位時間內(nèi)產(chǎn)物的生成量或底物的減少量。表示方法：

或

式中v：反應(yīng)速率，[P]：產(chǎn)物濃度，t：時間，[S]：底物濃度。注：在實際測定酶促反應(yīng)速度時，以測定單位時間內(nèi)產(chǎn)物的生成量為好。第5頁，共29頁，2023年，2月20日，星期六二、酶活性單位（一）酶活性單位定義：表示酶的相對含量，指在一定條件下，單位時間內(nèi)生成一定量的產(chǎn)物或消耗一定量的底物所催化的酶量。表示方法：慣用單位（一定的反應(yīng)量/一定的反應(yīng)時間）國際單位IU（μmol/min）Katal單位（mol/s）第6頁，共29頁，2023年，2月20日，星期六1．慣用單位：20世紀60年代以前根據(jù)酶活性測定方法建立者的姓氏命名的單位ALP的金氏單位（King）氨基移轉(zhuǎn)酶的卡門氏單位（Karmen）特點：各單位對溫度、時間、物質(zhì)量的定義不同，導(dǎo)致各測定值、參考范圍相差很大，彼此間無法比較,現(xiàn)在臨床應(yīng)用較少?？ㄩT氏單位：1.0ml血清在25℃，340nm，反應(yīng)體積3.0ml,光徑1.0cm時每分鐘測定吸光度下降0.001，即消耗4.8210-4μmolNADH為一個卡門氏單位舉例：金氏單位：100ml血清ALP在37℃與底物作用15min，產(chǎn)生1mg酚。第7頁，共29頁，2023年，2月20日，星期六2.國際單位IU（μmol/min）定義：在規(guī)定條件下（25℃及其他最適條件），每min催化1μmol底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的酶量，為1U，1U=1μmol/min。IFCC,2001年37℃3．Katal單位定義：1Katal是在規(guī)定條件下，每秒鐘催化1mol底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的酶量。1Katal＝1mol/s。IU與Katal單位的關(guān)系：1katal=60×106U，1U=16.67nkatal第8頁，共29頁，2023年，2月20日，星期六三、酶促反應(yīng)動力學(xué)

以產(chǎn)物生成量（或反應(yīng)物減少量）為縱坐標(biāo)、反應(yīng)時間為橫坐標(biāo)作圖所得到的一條曲線，稱為反應(yīng)進程曲線（或反應(yīng)時間曲線、速率曲線、時間曲線）t1t2時間t

圖5-1酶促反應(yīng)進程曲線吸光度A延滯期線性期非線性期第9頁，共29頁，2023年，2月20日，星期六（一）延滯期（lagphase、延遲期

）特點：為反應(yīng)的初始階段，反應(yīng)速率一開始時較慢，通常為幾秒到幾分鐘t1t2時間t

圖5-1酶促反應(yīng)進程曲線吸光度A線性期非線性期R1R2延滯期孵育期延滯期第10頁，共29頁，2023年，2月20日，星期六（二）線性期此階段酶促反應(yīng)速率基本保持恒定；對底物而言，為反應(yīng)速率與底物濃度[S]的零次方成正比的零級反應(yīng)，即不受底物濃度的影響，而只與酶活性濃度成正比；

此時底物的消耗量小于5%，反應(yīng)速率為反應(yīng)初速率。酶活性濃度越高，線性期就越短

線性度：判斷線性期的一個指標(biāo)，指吸光度（A）相對于時間（min）變化的可以接受的程度。

線性度=［前半段△A/min－后半段△A/min］/［（前半段△A/min＋后半段△A/min）/2］×100％線性度值越小則線性越好。一般判斷標(biāo)準(zhǔn)：不大于15％，否則判為非線性特點：可代表酶促反應(yīng)速度第11頁，共29頁，2023年，2月20日，星期六（三）非線性期（偏離線性期、平坦期）進入非線性期的原因：

反應(yīng)的不斷進行，底物消耗越來越多，酶變性失活增加、可逆反應(yīng)增強、產(chǎn)物抑制增加等使得反應(yīng)速率明顯下降。特點：

若為單底物的反應(yīng)，則此時反應(yīng)速率與單底物濃度[S]的一次方成正比，為一級反應(yīng)。第12頁，共29頁，2023年，2月20日，星期六偶聯(lián)：工具酶與待測酶、工具酶與工具酶之間的聯(lián)合。工具酶：將作為試劑用于測定待測酶活性或底物濃度的酶。工具酶有氧化還原酶類、轉(zhuǎn)移酶類和水解酶類分類：第二節(jié)酶學(xué)分析的類型第13頁，共29頁，2023年，2月20日，星期六表7-2常用工具酶的名稱及其縮寫符號

名稱縮寫符號名稱縮寫符號乳酸脫氫酶LDH蘋果酸脫氫酶MDH6-磷酸葡萄糖脫氫酶G6PD谷氨酸脫氫酶GLDH葡萄糖氧化酶GOD膽固醇氧化酶COD磷酸甘油氧化酶GPO過氧化物酶POD己糖激酶HK肌酸激酶CK丙酮酸激酶PK甘油激酶GK脂蛋白脂肪酶LPL膽固醇酯酶CE脲酶肌酐酶第14頁，共29頁，2023年，2月20日，星期六

常用品工具酶主要是氧化還原酶類，部分轉(zhuǎn)移酶類和水解酶類。工具酶的質(zhì)量要求工具酶的用量一般較多，故要求工具酶來源廣泛，價廉易得，純度要求不太高，可降低制備成本，但對工具酶中的雜質(zhì)也要有一定的限制，以保證工具酶有一定的比活性，減少或避免一些能干擾測定的副反應(yīng)。第15頁，共29頁，2023年，2月20日，星期六NAD(P)＋或NAD(P)H偶聯(lián)的脫氫酶及指示反應(yīng)，NADH和NADPH在340nm有光吸收特性，可用紫外分光光度計直接測定，另外，NAD(P)H還有強烈熒光，其激發(fā)光波長為365nm，熒光波長為460nm，熒光法的靈敏度比分光光度法高。如ALT測定工具酶是LDH第16頁，共29頁，2023年，2月20日，星期六二、酶活性的測定方法測定方法分類：

按照儀器檢測方法分類：分光光度法、濁度法、熒光法、放射性核素法、電位滴定法、電極法、量氣法。按照反應(yīng)時間分類；分為定時法、連續(xù)監(jiān)測法和平衡法。按照檢測對象分類：分為直接法和間接法。第17頁，共29頁，2023年，2月20日，星期六1、定時法原理：定時法是固定時間法的簡稱，是指測定反應(yīng)開始后一段時間（t1～t2）產(chǎn)物的增加量或底物的減少量以測定酶活性的方法。該方法一般需要在反應(yīng)進行到一定時間后用強酸、強堿、蛋白沉淀劑等終止反應(yīng)。特點：優(yōu)點：簡單，因為最后測定時酶促反應(yīng)已被終止，故比色時不需要保溫設(shè)備，顯色劑的選擇也可不考慮對酶活性的影響。缺點：如果不做預(yù)試驗則無法了解其酶促反應(yīng)進程（t1-t2）是否為零級反應(yīng)，故難以確保測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。吸光度At1t2

時間t圖5-6定時法的三種反應(yīng)進程231定時法與兩點法、終點法的區(qū)別第18頁，共29頁，2023年，2月20日，星期六2.連續(xù)監(jiān)測法（continuouemonitosing）每隔一定時間（10～60s）連續(xù)測定酶反應(yīng)中產(chǎn)物或底物的變化量稱為連續(xù)監(jiān)測法。又稱動力法或速率法，終點法的測定兩個時間點，該法進行多點連續(xù)測定。第19頁，共29頁，2023年，2月20日，星期六

優(yōu)點：多點測定結(jié)果，連接成線，很容易找到成直線的區(qū)段，因而可選擇線性反應(yīng)期來計算酶活性，不需終止反應(yīng)，測定結(jié)果較準(zhǔn)確。省時、省試劑。

缺點：分光光度計必須有保溫裝置，而且P或S應(yīng)是可直接測定的化合物，如需加入其他試劑則必須考慮它們對待測酶活性是否有影響。第20頁，共29頁，2023年，2月20日，星期六3.平衡法（end-paintamalyin）測定酶反應(yīng)開始后某一段時間內(nèi)(從t1→t2)產(chǎn)物或底物的總變化量稱為終點法。而t1和t2是反應(yīng)歷程中的兩個點，故又稱兩點法。第21頁，共29頁，2023年，2月20日，星期六

優(yōu)點：簡便，測定產(chǎn)物時，酶反應(yīng)被終止，顯色劑的選擇只考慮對酶活性的影響，分光光度計不需保溫裝置。缺點：無法了解這段時間的反應(yīng)是否都是零級反應(yīng)，故難以保證結(jié)果的真實性。第22頁，共29頁，2023年，2月20日，星期六計算公式:

產(chǎn)物的增加量每單位規(guī)定的保溫時間1000（ml）酶單位/升=—————————×——————————×————————

每單位規(guī)定的產(chǎn)物增加量實際保溫時間實際標(biāo)本用量（ml）分光光度法測定的公式：

（A測定–A對照）·V總·106

每單位規(guī)定的保溫時間酶單位/升=—————————×————————

·L·V標(biāo)實際保溫時間第23頁，共29頁，2023年，2月20日，星期六第三節(jié)影響酶活性測定的因素一、標(biāo)本

1.溶血

RBC中某些酶活性比血高，如LDH高150倍，AST高15倍，ALT高7.5倍。

2.抗凝劑某些酶可被抗凝劑抑制，如EDTA、草酸鹽，可抑制需Ca2+的AMS和需Mg2+的CK、5NT、ALP等，酸酶活性測定都用血清。

3.樣品存放時間，各種血清酶穩(wěn)定性不同，如ACP、CK在室溫下迅速失活，AMS、GGT則很穩(wěn)定。第24頁，共29頁，2023年，2月20日，星期六二、測定條件的影響

1.溫度溫度對酶活性的影響包括兩個方面，一方面是溫度升高，反應(yīng)速度加快。另外一方面溫度升高，會發(fā)生熱變性，使酶活性降低。

第25頁，共29頁，2023年，2月20日，星期六

（1）溫度的選擇

37℃反應(yīng)速度快，單位時間反應(yīng)物質(zhì)變化量大，測定靈敏度增加，保溫時間短，25℃、30℃可使單位時間的散熱較少，溫度便于恒定，很多實驗數(shù)據(jù)的物理化學(xué)較難定在30℃進行，IFCC建議30℃作為參考方法的標(biāo)準(zhǔn)溫度。（2）溫度系數(shù)

將溫度每升高10℃后反應(yīng)速度相當(dāng)于原來的倍數(shù)，稱為溫度系數(shù)(Q10)。Q10表示溫度對反應(yīng)速度影響的大小。第26頁，共29頁，2023年，2月20日，星期六

2.pH

（1）改變底物的解離狀態(tài)，影響酶與底物結(jié)合。（2）改變酶活性中心必需基因的解離狀態(tài)，影響酶活性。（3）改變酶的三維空間構(gòu)象，使酶變性。（4）使亞基解