分子生物技術(shù)之PCR技術(shù)

PCR技術(shù)目錄一、PCR概念二、PCR技術(shù)基本原理三、PCR技術(shù)在臨床的應(yīng)用一、PCR概念聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）：又稱無(wú)細(xì)胞分子克隆系統(tǒng)或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增法。能使人們?cè)趲仔r(shí)內(nèi)從試管中獲得大量的特異的核酸片段。臨床實(shí)驗(yàn)室主要用于對(duì)病毒、細(xì)菌、支原體及其它病原體的檢測(cè)二、PCR技術(shù)基本原理PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，基本原理與細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制基本相似。每一次循環(huán)復(fù)制包括3個(gè)步驟：變性退火延伸二、PCR技術(shù)基本原理變性（denature）通過(guò)加熱至95℃左右，使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成DNA單鏈模板而游離于反應(yīng)體系中，此過(guò)程稱為變性二、PCR技術(shù)基本原理退火（annealing）即在較低的溫度(40～70℃)下使加入的引物與待擴(kuò)增的DNA區(qū)域特異性結(jié)合，以提供DNA復(fù)制起始的3’-OH端二、PCR技術(shù)基本原理延伸（extension）即在適當(dāng)?shù)臏囟认拢?0℃～75℃），DNA聚合酶特異性結(jié)合到DNA模板上的引物的3’-OH端，以dNTP為反應(yīng)原料，以靶序列為模板，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，進(jìn)行DNA鏈的延伸，即合成DNA新鏈二、PCR技術(shù)基本原理上述3個(gè)步驟反復(fù)循環(huán)，使得特定長(zhǎng)度的靶DNA數(shù)量呈指數(shù)上升。在理論上，終產(chǎn)物DNA的量可用Yn=X·2n計(jì)算二、PCR技術(shù)基本原理PCR的反應(yīng)體系模板就是被復(fù)制的核酸片段引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，為化學(xué)合成的寡核苷酸可穩(wěn)定核苷酸和提高TaqDNA聚合酶的活性,MgCl2濃度一般為1.5mmol/L為宜在擴(kuò)增過(guò)程中，當(dāng)溫度上升至72℃時(shí)，反應(yīng)體系的pH在7.2左右。其它反應(yīng)因素引物模板鎂離子濃度即dNTP為dATP、dCTP、dGTP和dTTP四種脫氧核苷三磷酸的混合物脫氧核苷三磷酸（dNTP）催化DNA合成，即在模板指導(dǎo)下，以dNTP為原料，使DNA鏈沿5′→3′方向延伸TaqDNA聚合酶BEAFCD三、PCR反應(yīng)技術(shù)在臨床的應(yīng)用人類遺傳疾病的診斷與研究，如地中海貧血、血友病、苯丙酮尿癥等致病基因的檢測(cè)病原體的檢測(cè)，包括細(xì)菌、病毒、支原體、衣原體以及原蟲等的檢測(cè)，用于傳染病的診斷、變異株分析、