化學(xué)酶工程的學(xué)習(xí)資料

化學(xué)酶工程的學(xué)習(xí)資料第1頁/共68頁第一節(jié)酶分子的化學(xué)修飾游離酶缺點(diǎn)：抗原性；穩(wěn)定性差；活性不夠高。第五章化學(xué)酶工程第2頁/共68頁廣義：凡是通過化學(xué)的方法和手段或是通過化學(xué)反應(yīng)使酶的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的技術(shù)或過程，都可稱為酶的化學(xué)修飾。狹義：酶的化學(xué)修飾則主要是指在較溫和的條件下，以可控的方式使酶同某些化學(xué)試劑發(fā)生特異反應(yīng)，從而引起單個(gè)氨基酸殘基或其功能基團(tuán)發(fā)生共價(jià)的化學(xué)改變的過程。定義第一節(jié)酶分子的化學(xué)修飾第3頁/共68頁酶化學(xué)修飾的目的：人為地改變天然酶的一些性質(zhì)，創(chuàng)造天然酶所不具備的某些優(yōu)良特性甚至創(chuàng)造出新的特性，擴(kuò)大酶的應(yīng)用領(lǐng)域。酶化學(xué)修飾后的變化：改變活性部位的構(gòu)象。提高生物活性。增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性。降低酶類藥物的抗原性。改變酶學(xué)性質(zhì)。第一節(jié)酶分子的化學(xué)修飾第4頁/共68頁酶化學(xué)修飾的原理利用化學(xué)修飾劑所具有的各種基團(tuán)的特性，直接或間接地經(jīng)過一定的活化過程與酶分子的某種氨基酸殘基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。被修飾酶。修飾劑的選擇。修飾反應(yīng)條件的選擇。第一節(jié)酶分子的化學(xué)修飾考慮因素第5頁/共68頁酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾酶分子表面的化學(xué)修飾方法及修飾劑第一節(jié)酶分子的化學(xué)修飾第6頁/共68頁采用一些可溶性的大分子物質(zhì)通過共價(jià)鍵將其連接到酶分子的的表面，使之在酶表面形成覆蓋層，從而使酶的性質(zhì)發(fā)生改變，以滿足人們的需要。常用的大分子修飾劑：聚乙二醇、右旋糖酐、糖肽、肝素、血清白蛋白。常見的修飾方法：溴化氰法、高碘酸氧化法、戊二醛法、疊氮法、琥珀酸法、三氯均嗪法。酶分子表面的化學(xué)修飾第一節(jié)酶分子的化學(xué)修飾第7頁/共68頁酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾酶蛋白的側(cè)鏈主要包括氨基、羧基、巰基、胍基、酚基等。側(cè)鏈基團(tuán)一旦改變將引起酶蛋白空間構(gòu)象的改變，從而改變酶的特性和功能。第一節(jié)酶分子的化學(xué)修飾第8頁/共68頁氨基的化學(xué)修飾（賴氨酸）①②乙酸酐2,4,6—三硝基苯磺酸第9頁/共68頁③④2,4—二硝基氟苯碘乙酸氨基的化學(xué)修飾（賴氨酸）酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾第10頁/共68頁⑤⑥丹璜酰氯氨基的化學(xué)修飾（賴氨酸）酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾第11頁/共68頁羧基的化學(xué)修飾（谷氨酸、天冬氨酸）①②③碳二亞胺硼氟化三甲烊鹽第12頁/共68頁巰基的化學(xué)修飾（半胱氨酸）①②③5,5/-二硫代–雙（2-硝基苯甲酸）4,4/-二硫二吡啶對(duì)氯汞苯甲酸第13頁/共68頁⑤④N-乙基馬來酰亞胺2-氯汞-4-硝基苯酚巰基的化學(xué)修飾（半胱氨酸）第14頁/共68頁組氨酸咪唑基的化學(xué)修飾①②碘乙酸焦碳酸二乙酯酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾第15頁/共68頁精氨酸胍基的化學(xué)修飾①②丁二酮1,2-環(huán)己二酮丁二酮1,2-環(huán)己二酮第16頁/共68頁③苯乙二醛精氨酸胍基的化學(xué)修飾酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾第17頁/共68頁色氨酸吲哚基的化學(xué)修飾①②2

–羥基–5-硝基芐溴4-硝基苯硫氯第18頁/共68頁酪氨酸殘基和脂肪族氨基酸殘基羥基的化學(xué)修飾①②N-乙酰咪唑酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾第19頁/共68頁④絲氨酸殘基-----二異丙基氟磷酸酯③四硝基甲烷酪氨酸殘基和脂肪族氨基酸殘基羥基的化學(xué)修飾第20頁/共68頁甲硫氨酸殘基的化學(xué)修飾①②③甲硫氨酸亞砜過甲酸碘乙酰胺第21頁/共68頁第22頁/共68頁采用一些可溶性的大分子物質(zhì)通過共價(jià)鍵將其連接到酶分子的的表面，使之在酶表面形成覆蓋層，從而使酶的性質(zhì)發(fā)生改變，以滿足人們的需要。常用的大分子修飾劑：聚乙二醇、右旋糖酐、糖肽、肝素、血清白蛋白。常見的修飾方法：溴化氰法、高碘酸氧化法、戊二醛法、疊氮法、琥珀酸法、三氯均嗪法。酶分子表面的化學(xué)修飾第一節(jié)酶分子的化學(xué)修飾第23頁/共68頁聚乙二醇對(duì)酶的修飾（單甲氧基聚乙二醇—MPEG）MPEG均三嗪類衍生物MPEG1MPEG2第24頁/共68頁聚乙二醇對(duì)酶的修飾（單甲氧基聚乙二醇—MPEG）第25頁/共68頁MPEG氨基類衍生物蜂巢型MPEG聚乙二醇對(duì)酶的修飾（單甲氧基聚乙二醇—MPEG）第一節(jié)酶分子的化學(xué)修飾第26頁/共68頁右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯對(duì)酶的修飾右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯分子中多糖鏈上的羥基經(jīng)活化后可與酶分子上的氨基結(jié)合。（右旋糖酐）第27頁/共68頁羥基活化----溴化氰法第28頁/共68頁羥基活化----高碘酸氧化法第29頁/共68頁糖肽對(duì)酶的修飾異氰酸法戊二醛法第30頁/共68頁具有生物活性的大分子對(duì)酶的修飾肝素是一種含硫酸酯的黏多糖，由氨基葡萄糖和兩種糖醛酸組成，平均分子量20000左右。肝素增加酶的穩(wěn)定性，由于肝素在體內(nèi)還具有抗凝血、抗血栓、降血脂等活性，極適合用來修飾血栓溶解酶而增加其療效。第31頁/共68頁碳二亞胺法第32頁/共68頁三氯均嗪法第33頁/共68頁蛋白質(zhì)或其他大分子對(duì)酶的修飾修飾劑：人血清白蛋白修飾方法：戊二醛法、羰二亞胺法、活化酯法活化酯法琥珀酸酐第34頁/共68頁影響酶化學(xué)修飾的因素反應(yīng)時(shí)間的影響分子量的影響pH對(duì)化學(xué)修飾的影響修飾劑與酶的用量之比對(duì)修飾效果的影響溫度的影響第一節(jié)酶分子的化學(xué)修飾第35頁/共68頁修飾酶的性質(zhì)修飾酶的穩(wěn)定性得到提高---熱穩(wěn)定性、耐蛋白水解酶穩(wěn)定性。修飾酶的抗原性得到降低---PEG和人血清白蛋白效果明顯。修飾酶的半衰期得到延長(zhǎng)---保持藥用酶的體內(nèi)療效修飾酶的最適pH變化---在生理和臨床應(yīng)用上具有重要意義。修飾酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)---Vmax沒有變化，有些Km會(huì)增大。第一節(jié)酶分子的化學(xué)修飾第36頁/共68頁概述模擬天然酶（生物酶）的結(jié)構(gòu)、特性、作用原理及其在生物體內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)過程，人工合成的具有分子識(shí)別和催化能力的化合物質(zhì)，稱為模擬酶天然酶的缺點(diǎn)：很容易受到多種物理、化學(xué)及生物影響而失活。第二節(jié)模擬酶第37頁/共68頁目前模擬酶的研究方向：模擬酶的金屬輔基。模擬酶的活性功能基。模擬酶的高分子作用方式。模擬酶與底物的作用。模擬酶的性狀。第二節(jié)模擬酶第38頁/共68頁酶學(xué)基礎(chǔ)：Pauling的穩(wěn)定過渡態(tài)理論酶先結(jié)合底物，進(jìn)而選擇性地讓底物穩(wěn)定處于某一特定反應(yīng)的過渡態(tài)，降低反應(yīng)的活化能，從而加速反應(yīng)速度。模擬酶的理論基礎(chǔ)：第二節(jié)模擬酶第39頁/共68頁超分子化學(xué)基礎(chǔ)---Pederson、Cram、Lehn提出：超分子的形成源于底物和受體的結(jié)合，這種結(jié)合基于非共價(jià)鍵相互作用，如靜電作用、氫鍵和范德華力等。模擬酶的理論基礎(chǔ)：第二節(jié)模擬酶第40頁/共68頁模擬酶的分類主-客體酶模型，包括環(huán)糊精、冠醚、穴醚、雜環(huán)大環(huán)化合物分子印跡酶抗體酶膠束酶模型肽酶半合成酶。根據(jù)模擬酶的屬性可分為：第二節(jié)模擬酶第41頁/共68頁環(huán)糊精是直鏈淀粉在芽孢桿菌產(chǎn)生的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶作用下生成的一系列環(huán)狀低聚糖的總稱，通常含有6~12個(gè)D-吡喃葡萄糖單元。環(huán)糊精中各葡萄糖單元均以1,4糖苷鍵結(jié)合成環(huán)，空間結(jié)構(gòu)呈錐形圓環(huán)。環(huán)糊精外緣親水而內(nèi)腔疏水，因此能像酶一樣提供一個(gè)疏水的結(jié)合部位。環(huán)糊精模擬酶第二節(jié)模擬酶第42頁/共68頁環(huán)糊精葡萄糖單元的數(shù)量不同可分為α(6個(gè))，β(7個(gè))及γ(8個(gè))環(huán)糊精三種，每個(gè)葡萄糖殘基均呈現(xiàn)無扭曲變形的椅式構(gòu)象，葡萄糖單元均以1,4糖苷鍵結(jié)合成環(huán)，內(nèi)有空穴，疏水。外緣親水第43頁/共68頁環(huán)糊精模擬酶所具有的催化作用（活性）：水解酶活性核酸酶活性轉(zhuǎn)氨酶活性橋聯(lián)歡糊精仿酶—氧化和水解酶活性

環(huán)糊精模擬酶第二節(jié)模擬酶第44頁/共68頁大環(huán)聚醚按結(jié)構(gòu)可分為：冠醚、穴醚、球醚。冠醚是指含雜原子的單環(huán)化合物，穴醚是指含雜原子的雙環(huán)化合物，球醚是指含有雜原子的球狀大環(huán)醚。大環(huán)聚醚模擬酶的活性：水解酶活性肽合成酶活性大環(huán)聚醚及其模擬酶第二節(jié)模擬酶Lehn第45頁/共68頁杯芳烴是由苯酚及其衍生物與甲醛縮合而成，分子上緣由苯環(huán)的對(duì)位取代基組成，下緣緊密排列著酚羥基，中間是苯環(huán)構(gòu)成的富含π電子的疏水空腔，其上緣親油，下緣親水，可與中性分子和極性離子等多種物質(zhì)結(jié)合。模擬水解酶活性。杯芳烴及其模擬酶第二節(jié)模擬酶第46頁/共68頁金屬卟啉可以模擬以金屬離子為輔基或輔酶的天然酶。卟啉是含有四個(gè)吡咯分子的大環(huán)聚合物，主要骨架是卟吩。金屬卟啉分子具有以共軛大π電子體系，金屬原子價(jià)改變?yōu)榛A(chǔ)的氧化還原性質(zhì)，因而可作為與分子氧有關(guān)的氧化還原酶的模擬酶。金屬卟啉及其模擬酶第二節(jié)模擬酶第47頁/共68頁肽酶是模擬天然酶的活性部位，人工合成的具有催化活性的多肽。環(huán)肽在分子識(shí)別方面更具有優(yōu)勢(shì)。肽酶1977年人工合成的八肽Glu-Phe-Ala-Glu-Glu-Ala-Ser-Phe具有溶菌酶(lysozyme)活性，其活力可達(dá)到天然酶的50%。第二節(jié)模擬酶第48頁/共68頁抗體酶的催化特性具有催化化學(xué)反應(yīng)能力的單克隆抗體，稱為抗體酶，又稱為催化性抗體?？贵w酶的理論基礎(chǔ)及研究背景酶的催化機(jī)制：過渡態(tài)理論。（1946，Pauling）免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生底物過渡態(tài)的抗體，抗體具有催化性能（1969，Jencks）單克隆抗體技術(shù)發(fā)展。（1975，Kohler,Milstein）第一個(gè)催化酯水解的抗體酶。（1986，Lerner,Schultz）第三節(jié)抗體酶第49頁/共68頁抗體酶的特點(diǎn)能催化一些天然酶不能催化的反應(yīng)有更高的專一性和穩(wěn)定性催化作用機(jī)制不同?？贵w酶和非催化抗體作用的比較反應(yīng)的特異性反應(yīng)的可逆性反應(yīng)的量效關(guān)系反應(yīng)過程。第三節(jié)抗體酶第50頁/共68頁抗體酶的催化作用機(jī)制過渡態(tài)理論抗體酶的催化反應(yīng)類型轉(zhuǎn)?；磻?yīng)磷酸酯水解反應(yīng)磺酸酯閉環(huán)反應(yīng)Claisen重排反應(yīng)脫羧反應(yīng)金屬螯合反應(yīng)第三節(jié)抗體酶第51頁/共68頁抗體酶的制備原則利用某一反應(yīng)過渡態(tài)的類似物作為免疫原，則可誘導(dǎo)得到催化該反應(yīng)的抗體酶。過渡態(tài)類似物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可化學(xué)合成。目前制備抗體酶的主要步驟：根據(jù)催化目的，通過化學(xué)反應(yīng)合成模型化合物（過渡態(tài)類似物），并與載體蛋白偶聯(lián)成人工抗原，制備具有催化活性的單克隆抗體?？乖脑O(shè)計(jì)是制備抗體酶的關(guān)鍵。策略：利用抗體穩(wěn)定帶電過渡態(tài)抗體作為熵阱抗體靜電互補(bǔ)效應(yīng)第三節(jié)抗體酶第52頁/共68頁目前制備抗體酶的主要方法：根據(jù)催化目的，通過化學(xué)反應(yīng)合成模型化合物（過渡態(tài)類似物），并與載體蛋白偶聯(lián)成人工抗原，制備具有催化活性的單克隆抗體。拷貝法化學(xué)誘變法。蛋白質(zhì)工程技術(shù)。相似分子誘導(dǎo)法。共價(jià)抗原免疫法?？贵w酶的制備方法第三節(jié)抗體酶第53頁/共68頁利用過渡態(tài)類似物制備抗體酶抗體酶的制備方法第三節(jié)抗體酶第54頁/共68頁使不可能發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)稱為可能。使苛刻條件下的化學(xué)反應(yīng)在溫和條件下實(shí)現(xiàn)。選擇性的催化平行反應(yīng)中的某一反應(yīng)。制備蛋白質(zhì)氨基酸序列快速分析的抗體酶。制備水解病毒蛋白的抗體酶。指導(dǎo)未知酶的尋找。為化學(xué)反應(yīng)的機(jī)理研究提供依據(jù)?？贵w酶的應(yīng)用前景第三節(jié)抗體酶第55頁/共68頁分子印跡的原理以一種分子作為模板，在其周圍用聚合物交聯(lián)，當(dāng)除去該分子時(shí)，聚合物中間留下與該分子形狀相同的空穴，這種空穴就有可能對(duì)該分子具有選擇性識(shí)別結(jié)合的能力。該化合物分子叫印跡分子，也叫模板分子。聚合物稱為分子印跡聚合物。制備對(duì)某一化合物分子具有選擇性識(shí)別結(jié)合的聚合物的過程稱為分子印跡（技術(shù)）第四節(jié)印跡酶第56頁/共68頁分子印跡的原理第四節(jié)印跡酶第57頁/共68頁選定印跡分子和功能性單體，使二者發(fā)生互補(bǔ)反應(yīng)；在印跡分子—功能性單體復(fù)合物周圍發(fā)生交聯(lián)聚合；用抽提法從聚合物中除掉印跡分子。分子印跡技術(shù)的一般過程：第四節(jié)印跡酶第58頁/共68頁分子印跡技術(shù)的分類預(yù)組織法又稱共價(jià)法。印跡分子先通過共價(jià)鍵與功能性單體結(jié)合，聚合后再將共價(jià)鍵斷裂除去印跡分子。功能單體：含有乙烯基的硼酸、醛、胺、酚、醇等。共價(jià)化合物：硼酸酯、亞胺、希夫堿、縮醛酮等。特點(diǎn)：結(jié)合基團(tuán)定位精確，對(duì)印跡分子選擇性高；共價(jià)鍵結(jié)合較牢固，對(duì)印跡分子的識(shí)別和解離較慢。第四節(jié)印跡酶第59頁/共68頁又稱非共價(jià)法。印跡分子與功能性單體自組織排列，以非共價(jià)鍵自發(fā)形成具有多個(gè)作用位點(diǎn)的復(fù)合物。功能單體：丙烯酸、丙烯酰胺、含有乙烯基的苯甲酸、苯乙酸、咪唑和吡啶類化合物。甲基丙烯酸特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單易行，印跡分子易除去，分子識(shí)別過程更接近天然的分子識(shí)別系統(tǒng)，可同時(shí)采用多種功能單體，增加印跡效果；功能單體過量，選擇性下降。分子印跡技術(shù)的分類自組裝法第四節(jié)印跡酶第60頁/共68頁聚合時(shí)，印跡分子與功能基團(tuán)共價(jià)結(jié)合。識(shí)別時(shí)，印跡分子與功能基團(tuán)非共價(jià)結(jié)合。金屬離子配位方法印跡分子-金屬離子-功能單體三維復(fù)合物進(jìn)行交聯(lián)聚合。金屬配位作用的強(qiáng)度可通過EDTA簡(jiǎn)單變換金屬離子的種類