培養(yǎng)基配制及消毒與滅菌及LB培養(yǎng)基制備

培養(yǎng)基配制及消毒與滅菌及LB培養(yǎng)基制備第1頁(yè)/共16頁(yè)培養(yǎng)基的配制及消毒與滅菌及LB培養(yǎng)基的制備第2頁(yè)/共16頁(yè)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解培養(yǎng)基的種類、掌握培養(yǎng)基的配制、分裝方法和滅菌前的準(zhǔn)備工作；高壓滅菌的原理、使用范圍和注意事項(xiàng)。2明確培養(yǎng)基的配制原理。3通過(guò)對(duì)LB培養(yǎng)基的配制，掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。第3頁(yè)/共16頁(yè)培養(yǎng)基是人工地將多種物質(zhì)按各種微生物生長(zhǎng)的需要配制而成的一種混合營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，用以培養(yǎng)或分離各種微生物。因此，營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)應(yīng)當(dāng)有微生物所能利用的營(yíng)養(yǎng)成分（包括碳源、氮源、能源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因素）和水。根據(jù)微生物的種類和實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌囵B(yǎng)基也有不同的種類和配制方法。第4頁(yè)/共16頁(yè)按成分的不同分類

1．天然培養(yǎng)基:主要成分是復(fù)雜的天然有機(jī)物質(zhì)，如馬鈴薯、豆芽汁、牛肉膏、蛋白胨、血清等。這些復(fù)雜天然有機(jī)物質(zhì)的成分不完全了解，每次所用的原料，其中各成分的數(shù)量也不恒定。這類培養(yǎng)基是實(shí)驗(yàn)室常用的培養(yǎng)基，例如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基等。2．合成培養(yǎng)基:用化學(xué)成分完全了解的純?cè)噭┡渲贫傻呐囵B(yǎng)基，如高氏1號(hào)培養(yǎng)基，查氏培養(yǎng)基等。一般用于營(yíng)養(yǎng)代謝、分類鑒定、菌種選育、遺傳分析等。第5頁(yè)/共16頁(yè)按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分類

1．固體培養(yǎng)基:在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑即為固體培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)用的凝固劑有瓊脂、明膠和硅膠，后者用于配制自養(yǎng)微生物的固體培養(yǎng)基。對(duì)其他多數(shù)微生物來(lái)講，以瓊脂最為合適，一般加入1．5—2．5%即可凝固成固體。此培養(yǎng)基可供分離、鑒定、活菌計(jì)數(shù)、菌種保藏等用。2．半固體培養(yǎng)基:在液體培養(yǎng)基中加入少量凝固劑即為半固體培養(yǎng)基，例如瓊脂只需加入0．2—0．7%。常用作細(xì)菌動(dòng)力檢查和菌種保存、噬菌體制劑的制備等。3．液體培養(yǎng)基:沒(méi)有加瓊脂，配好后成液體狀態(tài)的培養(yǎng)基。常用于生理代謝的研究和工業(yè)發(fā)酵等。第6頁(yè)/共16頁(yè)按培養(yǎng)基的用途分類

1．基礎(chǔ)培養(yǎng)基:含有一般細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖需要的基本的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。最常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是上面提及的天然培養(yǎng)基中的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基可作為一些特殊培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分。2．營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基（加富培養(yǎng)基）:在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入某些特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如血液、血清、酵母浸膏或生長(zhǎng)因子等。用以培養(yǎng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求高的微生物，如培養(yǎng)百日咳桿菌需要含有血液的培養(yǎng)基。第7頁(yè)/共16頁(yè)3．鑒別培養(yǎng)基:是一類含有某種特定化合物或試劑的培養(yǎng)基。某種微生物在這種培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，它所產(chǎn)生的某種代謝產(chǎn)物與這種特定的化合物或試劑能發(fā)生某種明顯的特征性反應(yīng)，根據(jù)這一特征性反應(yīng)可以將某種微生物與其他種微生物區(qū)別開來(lái)。主要用于不同類型微生物的快速鑒定，如用來(lái)檢查細(xì)菌能否產(chǎn)生硫化氫的醋酸鉛培養(yǎng)基。4．選擇培養(yǎng)基:利用微生物對(duì)某種或某些化學(xué)物質(zhì)的敏感性不同，在培養(yǎng)基中加入這類物質(zhì)，抑制不需要的微生物生長(zhǎng)，而利于所需分離的微生物生長(zhǎng)，從而達(dá)到分離或鑒別某種微生物的目的，如分離真菌的馬丁氏培養(yǎng)基。既有選擇作用又有鑒別作用的培養(yǎng)基，如鑒別腸道桿菌的遠(yuǎn)藤氏培養(yǎng)基等。第8頁(yè)/共16頁(yè)二、基本原理LB培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基，有時(shí)又稱為普通培養(yǎng)基。它含有酵母提取物、蛋白胨和NaCl。碳源和能源：酵母提取物，氮源：磷酸鹽、蛋白胨，無(wú)機(jī)鹽：NaCl。在配制固體培養(yǎng)基時(shí)還要加入一定量瓊脂作凝固劑。瓊脂在常用濃度下96℃時(shí)溶化，一般實(shí)際應(yīng)用時(shí)在沸水浴中或下面墊以石棉網(wǎng)煮沸溶化，以免瓊脂燒焦。瓊脂在40℃時(shí)凝固，通常不被微生物分解利用。第9頁(yè)/共16頁(yè)由于這種培養(yǎng)基多用于培養(yǎng)細(xì)菌，因此，要用稀酸或稀堿將其pH調(diào)至中性或微堿性，以利于細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。LB培養(yǎng)基的配方如下：酵母提取物5g、蛋白胨10g、NaCl5g、瓊脂15～20g、水1000mL、pH7.4～7.6第10頁(yè)/共16頁(yè)三、實(shí)驗(yàn)器材酵母提取物，蛋白胨，NaCl，瓊脂；1mol/LNaOH，1mol/LHCl；試管，三角燒瓶，燒杯，量筒，玻棒，培養(yǎng)基分裝器，天平，牛角匙，高壓蒸汽滅菌鍋，pH試紙（pH5.5～9.0），棉花，牛皮紙，記號(hào)筆，麻繩，紗布等。第11頁(yè)/共16頁(yè)四、實(shí)驗(yàn)步驟1．稱量按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地稱取酵母提取物、蛋白胨、NaCl放入燒杯中。蛋白胨很易吸潮，在稱取時(shí)動(dòng)作要迅速。另外，稱藥品時(shí)嚴(yán)防藥品混雜，一把牛角匙用于一種藥品，或稱取一種藥品后，洗凈、擦干，再稱取另一藥品，瓶蓋也不要蓋錯(cuò)。2．溶化在上述燒杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解。待藥品完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需的總體積。如果配制固體培養(yǎng)基，將稱好的瓊脂放入已溶化的藥品中，再加熱溶化，在瓊脂溶化的過(guò)程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底使燒杯破裂。最后補(bǔ)足所失的水分。第12頁(yè)/共16頁(yè)3．調(diào)pH在未調(diào)pH前，先用精密pH試紙測(cè)量培養(yǎng)基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入1mol/LNaOH，邊加邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙測(cè)其pH值，直至pH達(dá)7.6。反之，則用1mol/LHCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。注意pH值不要調(diào)過(guò)頭，以避免回調(diào)，否則，將會(huì)影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。對(duì)于有些要求pH值較精確的微生物，其pH的調(diào)節(jié)可用酸度計(jì)進(jìn)行（使用方法，可參考有關(guān)說(shuō)明書）。4．分裝

(1)液體分裝分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。(2)固體分裝分裝試管，其裝量不超過(guò)管高的1/5，滅菌后制成斜面，分裝三角燒瓶的量以不超過(guò)三角燒瓶容積的一半為宜。(3)半固體分裝試管一般以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。第13頁(yè)/共16頁(yè)5．加塞培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角燒瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)而造成污染，并保證有良好的通氣性能。6.包扎加塞后，將全部試管用麻繩捆扎好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時(shí)冷凝水潤(rùn)濕棉塞，其外再用一道麻繩扎好。用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期。三角燒瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結(jié)形式扎好，使用時(shí)容易解開，同樣用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期。7．滅菌將上述培養(yǎng)基以1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.3℃，20分鐘高壓蒸汽滅菌。如因特殊情況不能及時(shí)滅菌，則應(yīng)放入冰箱內(nèi)暫存。第14頁(yè)/共16頁(yè)