細(xì)胞工程原生質(zhì)體培養(yǎng)和植物體細(xì)胞雜交詳解演示文稿

細(xì)胞工程原生質(zhì)體培養(yǎng)和植物體細(xì)胞雜交詳解演示文稿當(dāng)前1頁，總共84頁。（優(yōu)選）細(xì)胞工程原生質(zhì)體培養(yǎng)和植物體細(xì)胞雜交當(dāng)前2頁，總共84頁。第六章原生質(zhì)體培養(yǎng)和植物體細(xì)胞雜交當(dāng)前3頁，總共84頁。原生質(zhì)體的概念植物原生質(zhì)體（protoplast）是指除去了細(xì)胞壁后的裸露的球形細(xì)胞。當(dāng)前4頁，總共84頁。

原生質(zhì)體能進(jìn)行植物細(xì)胞的各種基本生命活動(dòng)，如蛋白質(zhì)和核酸合成、光合作用、呼吸作用以及通過質(zhì)膜的物質(zhì)交換等，這極有利于探討許多細(xì)胞生理問題。同時(shí)，由于原生質(zhì)體在誘導(dǎo)條件下能發(fā)生融合，離體培養(yǎng)條件下可能再生植株。因此原生質(zhì)體培養(yǎng)研究在理論上和實(shí)踐上都具有重要意義。原生質(zhì)體培養(yǎng)的基本原理當(dāng)前5頁，總共84頁。原生質(zhì)體培養(yǎng)的發(fā)展歷程：-1880年，Hanstein首次使用原生質(zhì)體protoplast一詞-1960年，Cocking首次采用纖維素酶從番茄幼苗的根尖中分離原生質(zhì)體獲得成功-1971年，Takebe等首次得到煙草葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)的再生植株-1985年，F(xiàn)ujimura等獲得第一例禾谷類作物－-水稻原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株-1986年，Spangenberg等利用單個(gè)原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株，在甘藍(lán)型油菜上獲得成功當(dāng)前6頁，總共84頁。據(jù)統(tǒng)計(jì)，自1971年Takebe首次報(bào)道從煙草葉肉原生質(zhì)體再生植株后，已有49個(gè)科160多個(gè)屬的360多種植物經(jīng)原生質(zhì)體培養(yǎng)得到了再生植株。其趨勢(shì)仍以農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物為主，但已開始從一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物擴(kuò)展。當(dāng)前7頁，總共84頁。原生質(zhì)體的制備優(yōu)點(diǎn)：條件溫和，原生質(zhì)體完整性好，得率高等。（一）原生質(zhì)體的分離--酶解法影響因素：供試材料，酶的種類、濃度以及其組合，酶液滲透壓，酶解時(shí)間和溫度，純化方法當(dāng)前8頁，總共84頁。

1、材料的來源當(dāng)前9頁，總共84頁。實(shí)踐證明，幼嫩葉片，萌發(fā)種子的下胚軸、子葉以及愈傷組織和懸浮培養(yǎng)物等均是原生質(zhì)體的良好來源：--葉肉細(xì)胞是分離原生質(zhì)體的較好材料，從葉片中可分離出大量的較均勻一致的原生質(zhì)體。由葉片制備原生質(zhì)體時(shí)，植株的年齡和生長(zhǎng)條件十分重要一般選用植株上充分展開的葉片；--愈傷組織和懸浮細(xì)胞系，由于其生長(zhǎng)快速穩(wěn)定，受環(huán)境條件的影響不大容易獲得大量高質(zhì)量的原生質(zhì)體。細(xì)胞系建立時(shí)間的長(zhǎng)短，繼代培養(yǎng)的時(shí)間和培養(yǎng)基的成分等都影響原生質(zhì)體分離的數(shù)量和質(zhì)量。一般選用結(jié)構(gòu)疏松并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分離原生質(zhì)體的效果較好。

當(dāng)前10頁，總共84頁。外植體材料用黑暗處理、低溫處理和不同光質(zhì)照射以及預(yù)培養(yǎng)等方法，可以提高某些材料原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。不同植物及材料類型預(yù)處理方法不同：--龍膽試管苗只有用4℃處理后分離的原生質(zhì)體才能分裂；--甘蔗植株只有在黑暗條件下培養(yǎng)12小時(shí)后分離的原生質(zhì)體才能分裂；--馬鈴薯試管苗葉片需在黑暗下處理48小時(shí)后分離原生質(zhì)體，才會(huì)獲得較高的原生質(zhì)體產(chǎn)量。

2、預(yù)處理及酶解當(dāng)前11頁，總共84頁。

酶酶解滲透壓調(diào)節(jié)劑當(dāng)前12頁，總共84頁。酶來源生產(chǎn)廠家纖維素酶類onozukaR–10綠色木霉YakultHonshaCo.Ltd.,Tokyo,JapanCellulysin綠色木霉Calbiochem.,SanDiego,CA92037,USADriselaseIrpexlutensKayowaHakkoKogyoCo.,Tokyo,Japan果膠酶類MacerozymeR-10根霉YakyltHonshaCo.Ltd.,Tokyo,JapanPectinase根霉SigmaChemicalCo.,St.Louit,MO63178,USAPectolyaseY-23黑曲霉SeishinPharm.Co.Ltd.,Tokyo,Japan半纖維素酶RhozymeHP-150黑曲霉RohmandHassCo.,Philadelphia,PA19105,USAHemicellulase根霉SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO63178,USA原生質(zhì)體分離常用的商品酶當(dāng)前13頁，總共84頁。當(dāng)前14頁，總共84頁。甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖等--調(diào)節(jié)酶液滲透壓，使其與所處理細(xì)胞的滲透壓相似，保證原生質(zhì)體活力，使用濃度根據(jù)植物材料而異，一般在0.2~0.8mol/LCaCl2·2H2O，KH2PO4，MES（2-氮嗎啉乙烷磺酸），葡聚糖硫酸鉀--提高原生質(zhì)體膜的穩(wěn)定性AgNO3、過氧化物歧化酶(SOD)--減輕酶解時(shí)產(chǎn)生的乙烯、氧自由基對(duì)細(xì)胞膜的損傷

牛血清蛋白

--可防止細(xì)胞壁降解過程中對(duì)細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞當(dāng)前15頁，總共84頁。酶解時(shí)間酶濃度酶解溫度利用盡可能低的酶濃度和盡可能短的酶解時(shí)間獲得大量而有活力的原生質(zhì)體！當(dāng)前16頁，總共84頁。酶解過程一般為將酶解材料放入裝有酶液的培養(yǎng)皿中進(jìn)行酶解，或在靜止條件下每隔一段時(shí)間輕輕搖動(dòng)，或?qū)⑴囵B(yǎng)皿放在30～50r/min的搖床上輕輕振蕩以游離原生質(zhì)體。應(yīng)注意以下條件：a、植物材料應(yīng)按比例和酶液混合，才能有效地游離原生質(zhì)體b、不同材料其生理特性不同，對(duì)酶液中滲透壓的要求也不同c、酶的種類、濃度和酶解時(shí)間因材料而異d、酶液pH值一般在5.4～6.0e、酶解溫度控制在24～28℃左右f、黑暗或弱光下進(jìn)行

當(dāng)前17頁，總共84頁。當(dāng)前18頁，總共84頁。

（二）原生質(zhì)體的純化因植物材料和所使用的滲透壓穩(wěn)定劑不同，進(jìn)一步純化方法有：1、沉降法2、漂浮法3、梯度離心法當(dāng)前19頁，總共84頁。沉降法方法：將收集的濾液低速離心，使原生質(zhì)體沉降于管底。轉(zhuǎn)速的控制以將原生質(zhì)體沉淀而細(xì)胞碎片等雜質(zhì)仍懸浮在上清液中為準(zhǔn)，一般為500～800r/m下離心3～5min。用吸管小心地吸取上清液，再用洗滌液洗原生質(zhì)體3次，最后用培養(yǎng)基洗滌1次，調(diào)整到一定密度后進(jìn)行培養(yǎng)。--純化收集方便，操作簡(jiǎn)單，原生質(zhì)體丟失少。--在漂洗過程中容易造成原生質(zhì)體的損傷，并且純度不夠好，存在少量脫壁不完全的細(xì)胞和破碎的原生質(zhì)體。當(dāng)前20頁，總共84頁。漂浮法方法：將收集的濾液于1000r/m的轉(zhuǎn)速下離心10min，原生質(zhì)體將漂浮于溶液的表面，細(xì)胞碎片等雜質(zhì)將下沉到管底。用吸管吸出原生質(zhì)體并轉(zhuǎn)入到另一離心管中，反復(fù)3次，用培養(yǎng)基洗滌1次后調(diào)整到所需密度進(jìn)行培養(yǎng)。--可以收集到較為純凈的原生質(zhì)體，并且可以避免在離心純化過程中因振蕩撞擊或擠壓引起的原生質(zhì)體破裂或損傷。--原生質(zhì)體在數(shù)量上損失較多。當(dāng)前21頁，總共84頁。界面法－梯度離心法方法：采用兩種比重不同的溶液，離心后使完整無損的原生質(zhì)體處在兩液相的界面之間,而細(xì)胞碎片等雜質(zhì)沉于管底。用此法可獲得更為純凈的原生質(zhì)體。當(dāng)前22頁，總共84頁。以柑桔為例：25%蔗糖溶液13%甘露醇溶液當(dāng)前23頁，總共84頁。當(dāng)前24頁，總共84頁。（三）原生質(zhì)體活力的測(cè)定

1.熒光素雙醋酸酯(FAD)染色法2.酚藏花紅染色法3.熒光增白劑染色法4.伊凡藍(lán)染色法當(dāng)前25頁，總共84頁。二乙酸熒光素(fluoresceindiacetate,FDA)染色法

FDA本身無熒光，無極性，能透過細(xì)胞質(zhì)膜，一旦進(jìn)入原生質(zhì)體后能在內(nèi)酯酶作用下分解形成有熒光的極性物質(zhì)－熒光素?zé)晒馑夭荒茏杂纱┰郊?xì)胞質(zhì)膜而積累在原生質(zhì)體當(dāng)中，在熒光顯微鏡下觀察時(shí)，凡發(fā)淡綠色熒光的是有活力的原生質(zhì)體，無熒光或熒光很微弱的已經(jīng)死亡或活力低的原生質(zhì)體。當(dāng)前26頁，總共84頁。

原生質(zhì)體的培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)基

原生質(zhì)體培養(yǎng)方法

愈傷組織形成和植株再生

影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素

當(dāng)前27頁，總共84頁。1.無機(jī)鹽大量元素濃度；NO3-與NH4+的比例；Ca2+濃度2.有機(jī)成分維生素、氨基酸、糖及糖醇、酵母提取物、水解酪蛋白3.激素：生長(zhǎng)素先高到低4.滲透壓：培養(yǎng)基滲透壓和細(xì)胞滲透壓等滲原生質(zhì)體培養(yǎng)基

當(dāng)前28頁，總共84頁。當(dāng)前29頁，總共84頁。液體淺層培養(yǎng)過程：將原生質(zhì)體以一定密度懸浮在培養(yǎng)液中，用吸管將原生質(zhì)體懸浮液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿或三角瓶中使成一薄層。膜密封后置于人工培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，對(duì)原生質(zhì)體傷害小，通氣性好，代謝物易擴(kuò)散易于補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基，形成細(xì)胞團(tuán)或小愈傷組織后易于轉(zhuǎn)移，較廣泛采用。缺點(diǎn)：原生質(zhì)體在培養(yǎng)基中分布不均勻，常發(fā)生原生質(zhì)體間的黏連現(xiàn)象或造成局部密度過高，從而影響原生質(zhì)體再生細(xì)胞的進(jìn)一步發(fā)育，并且難以定點(diǎn)觀察和跟蹤單個(gè)原生質(zhì)體的生長(zhǎng)發(fā)育過程。當(dāng)前30頁，總共84頁。固體培養(yǎng)－－瓊脂（糖）平板培養(yǎng)或包埋培養(yǎng)過程：將原生質(zhì)體懸浮液與35℃的瓊脂（糖）培養(yǎng)基等量混合，使瓊脂（糖）最終濃度為0.6%左右，迅速并輕輕搖動(dòng)使原生質(zhì)體均勻分布，然后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿，冷卻后原生質(zhì)體包埋在瓊（糖）培養(yǎng)基中，封口后培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：原生質(zhì)體被彼此分開并固定位置，便于定點(diǎn)觀察，跟蹤單個(gè)原生質(zhì)體發(fā)育過程，易于統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體的分裂頻率和植板率；同時(shí)避免了細(xì)胞間有害代謝產(chǎn)物的影響。缺點(diǎn)：對(duì)操作要求較嚴(yán)，在原生質(zhì)體懸浮液與瓊脂（糖）培養(yǎng)基混合時(shí)溫度必須合適，太高會(huì)影響原生質(zhì)體活力，太低培養(yǎng)基的凝固較快使得原生質(zhì)體分布不均勻；并且原生質(zhì)體的生長(zhǎng)發(fā)育比液體淺層法慢。已較少采用。當(dāng)前31頁，總共84頁。液體淺層-固體平板雙層培養(yǎng)法過程：在培養(yǎng)皿的底部鋪一薄層含瓊脂（糖）的固體培養(yǎng)基，再將原生質(zhì)體懸浮液加于固體培養(yǎng)基表面進(jìn)行液體淺層培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：固體培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分可以緩慢地釋放到液體培養(yǎng)基中，補(bǔ)充培養(yǎng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的消耗。同時(shí)，如在下層培養(yǎng)基中添加一定量的活性炭，可有效地吸附培養(yǎng)物產(chǎn)生的有害物質(zhì)，促進(jìn)原生質(zhì)體的分裂及細(xì)胞團(tuán)的形成。缺點(diǎn)：不易觀察細(xì)胞的發(fā)育過程。當(dāng)前32頁，總共84頁。瓊脂糖珠培養(yǎng)過程：將含有原生質(zhì)體的液態(tài)瓊脂糖培養(yǎng)基用吸管以大約50ul一滴的量滴于直徑6cm的培養(yǎng)皿，待其固化后，向其中添加3ml液體培養(yǎng)基并于搖床上低速旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：可通過調(diào)整液體培養(yǎng)基的滲透壓來調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的滲透壓以利于原生質(zhì)體進(jìn)一步生長(zhǎng)和發(fā)育。由于改變了培養(yǎng)物的通氣和營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，從而可促進(jìn)原生質(zhì)體的分裂及細(xì)胞團(tuán)的形成。當(dāng)前33頁，總共84頁。飼養(yǎng)層培養(yǎng)-看護(hù)培養(yǎng)、滋養(yǎng)培養(yǎng)

過程：該法又可分為分層培養(yǎng)和混合培養(yǎng)。分層培養(yǎng)是先制備固體的飼養(yǎng)細(xì)胞層，再在其上植板培養(yǎng)層。用x射線照射部分分離的原生質(zhì)體，照射后將原生質(zhì)體洗2～3次，包埋于瓊脂培養(yǎng)基中，然后鋪于培養(yǎng)皿的底層構(gòu)成飼養(yǎng)細(xì)胞層。將欲培養(yǎng)的有活力的原生質(zhì)體植板于飼養(yǎng)細(xì)胞層上面進(jìn)行培養(yǎng)?；旌吓囵B(yǎng)是將經(jīng)過x射線照射而失去分裂能力的原生質(zhì)體與有活力的原生質(zhì)體相混合，并包埋于瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行固體平板法培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：適合于原生質(zhì)體低密度培養(yǎng)和某些難以培養(yǎng)的植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)。當(dāng)前34頁，總共84頁。當(dāng)前35頁，總共84頁。培養(yǎng)條件主要指培養(yǎng)的光照和溫度。原生質(zhì)體培養(yǎng)對(duì)培養(yǎng)條件的要求十分嚴(yán)格，且不同來源的原生質(zhì)體在不同的培養(yǎng)階段有不同要求。一般來說：--新分離原生質(zhì)體應(yīng)在散射光或黑暗中培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化階段再置于光下培養(yǎng)，光強(qiáng)1000～3000lx，光周期每天10～16h--不同的植物原生質(zhì)體培養(yǎng)對(duì)溫度的要求不盡相同，一般為25～30℃當(dāng)前36頁，總共84頁。細(xì)胞壁再生細(xì)胞分裂愈傷組織形成植株再生

愈傷組織形成和植株再生

當(dāng)前37頁，總共84頁。--原生質(zhì)體培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后開始再生新的細(xì)胞壁，一至數(shù)天內(nèi)便可形成完整的細(xì)胞壁。--電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，原生質(zhì)體培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后新壁開始形成，先是由質(zhì)膜合成形成細(xì)胞壁的主要成分微纖維，然后轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜表面進(jìn)行聚合作用產(chǎn)生多片層的結(jié)構(gòu)，以后在質(zhì)膜與片層結(jié)構(gòu)之間或在膜上產(chǎn)生小纖維絲，逐漸形成不定向的纖維團(tuán)，最后形成完整的細(xì)胞壁。(1)細(xì)胞壁再生當(dāng)前38頁，總共84頁。--原生質(zhì)體一般培養(yǎng)2～7d后開始第一次分裂，此時(shí)間隨植物的種類、分離原生質(zhì)體的材料、原生質(zhì)體的質(zhì)量、培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件而異。--用幼苗的下胚軸和子葉、幼根、懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞和未成熟種子的子葉等為材料分離的原生質(zhì)體，一般比用葉肉分離的原生質(zhì)體容易誘導(dǎo)分裂，第一次分裂出現(xiàn)的時(shí)間較快。(2)細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)當(dāng)前39頁，總共84頁。--大多數(shù)情況下，原生質(zhì)體培養(yǎng)二周后形成多細(xì)胞細(xì)胞團(tuán)，三周后形成肉眼可見的小細(xì)胞克隆，大約六周后形成直徑1mm的小愈傷組織。--原生質(zhì)體培養(yǎng)7～10天后必需及時(shí)添加新鮮培養(yǎng)基，否則形成的細(xì)胞團(tuán)不繼續(xù)生長(zhǎng)，待小愈傷組織長(zhǎng)至1mm左右時(shí)應(yīng)及時(shí)轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基上使其進(jìn)一步生長(zhǎng)。(3)愈傷組織的形成當(dāng)前40頁，總共84頁。--原生質(zhì)體形成的愈傷組織直接轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上可進(jìn)一步成苗。越來越多實(shí)驗(yàn)證明，兩步成苗法更適合大多數(shù)植物原生質(zhì)體再生植株。即，首先將愈傷組織培養(yǎng)于低濃度生長(zhǎng)素培養(yǎng)基上，讓其增殖和調(diào)整狀態(tài)再轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上分化成苗。(4)植株再生當(dāng)前41頁，總共84頁?；蛐驮|(zhì)體的來源起始培養(yǎng)密度和培養(yǎng)基影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素

當(dāng)前42頁，總共84頁。當(dāng)前43頁，總共84頁。植物原生質(zhì)體培養(yǎng)程序示意圖原生質(zhì)體分離⑴機(jī)械法分離原生質(zhì)體⑵酶法分離⑶影響原生質(zhì)體活力的因素原生質(zhì)體純化⑴沉降法⑵漂浮法⑶界面法原生質(zhì)體培養(yǎng)⑴平板培養(yǎng)、淺層液體培養(yǎng)、雙層培養(yǎng)法⑵細(xì)胞密度104~105個(gè)/mL（因種類而異）⑶培養(yǎng)成功的關(guān)鍵細(xì)胞壁再生⑴植物種類和材料的生理狀態(tài)⑵培養(yǎng)細(xì)胞所處時(shí)期（旺盛分裂期則快）⑶與質(zhì)膜穩(wěn)定劑和滲透壓穩(wěn)定劑有關(guān)細(xì)胞分裂形成細(xì)胞團(tuán)⑴基本培養(yǎng)基篩選⑵激素種類和濃度調(diào)節(jié)⑶滲透壓調(diào)節(jié)器官形成植株再生⑴基本培養(yǎng)基無機(jī)鹽濃度篩選⑵激素種類和濃度調(diào)節(jié)⑶滲透壓調(diào)節(jié)當(dāng)前44頁，總共84頁。當(dāng)前45頁，總共84頁。原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義：1、原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體培養(yǎng)成功為開展體細(xì)胞雜交奠定了基礎(chǔ)，通過不同材料的原生質(zhì)體融合克服傳統(tǒng)育種方法所面臨的生殖障礙，創(chuàng)造新的種質(zhì)材料。2、篩選突變體原生質(zhì)體在培養(yǎng)過程中能夠產(chǎn)生體細(xì)胞無性系變異，且對(duì)外界理化因子更為敏感易誘發(fā)突變，可從中選出具有優(yōu)良性狀的變異體，成為農(nóng)作物改良的重要遺傳資源。當(dāng)前46頁，總共84頁。3、遺傳轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體容易攝取外源遺傳物質(zhì)，如細(xì)胞器、細(xì)胞核、細(xì)菌、病毒、質(zhì)粒和各種DNA分子，使其能夠作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)。目前，PEG法、電激法、脂質(zhì)體法、基因槍法等均已用于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化研究，獲得了大豆等一系列轉(zhuǎn)基因植株

4、基礎(chǔ)研究原生質(zhì)體為細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞生理學(xué)、病毒學(xué)等學(xué)科的基礎(chǔ)理論研究提供了理想的實(shí)驗(yàn)體系，可用于研究細(xì)胞壁再生、細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及離子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞器的光合作用、呼吸作用等。當(dāng)前47頁，總共84頁。當(dāng)前48頁，總共84頁。體細(xì)胞雜交(somatichybridization)是指兩個(gè)離體細(xì)胞通過一定的誘導(dǎo)技術(shù)使質(zhì)膜接觸而融合在一起，隨后導(dǎo)致兩個(gè)細(xì)胞核物質(zhì)融合的技術(shù)。植物體細(xì)胞雜交則是指除去細(xì)胞壁的原生質(zhì)體融合(protoplastfusion)。一、體細(xì)胞雜交的概念當(dāng)前49頁，總共84頁。融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機(jī)制的限制，為遠(yuǎn)緣物種間的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜種細(xì)胞有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng)。在雜種的分裂和增殖過程中雙親的葉綠體、線粒體DNA，亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新的核外遺傳系統(tǒng)。理論上說，任何細(xì)胞都有可能通過體細(xì)胞雜交而成為新的生物資源。這對(duì)于種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠(yuǎn)意義。當(dāng)前50頁，總共84頁。對(duì)稱融合（asymmetricfusion）－即兩個(gè)完整的細(xì)胞原生質(zhì)體融合。非對(duì)稱融合（symmetricfusion）－利用物理或化學(xué)的方法使某親本的核或細(xì)胞質(zhì)失活后再進(jìn)行融合，它可以分為幾種：

根據(jù)融合時(shí)細(xì)胞的完整程度，原生質(zhì)體融合可分為兩大類：當(dāng)前51頁，總共84頁。目前開展的融合試驗(yàn)中絕大部分是對(duì)稱融合，此融合方式在獲得農(nóng)藝性狀互補(bǔ)的體細(xì)胞雜種方面具有一定的優(yōu)勢(shì)，但由于它綜合了雙親的全部性狀，在導(dǎo)入有利性狀同時(shí)也不可避免帶入了一些不利性狀。尤其在一些遠(yuǎn)緣組合中，由于存在一定程度的體細(xì)胞不親和性，使得雜種植株的表現(xiàn)并非預(yù)期理想。

對(duì)稱融合當(dāng)前52頁，總共84頁。

首例非對(duì)稱雜種是由x射線輻射處理后的歐芹原生質(zhì)體與煙草原生質(zhì)體相融合得到的。這一融合方法由于在轉(zhuǎn)移部分遺傳物質(zhì)方面具有獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)而受到重視。非對(duì)稱融合當(dāng)前53頁，總共84頁。物理方法常采用射線處理，如X射線、射線等，它們能使細(xì)胞核失活；化學(xué)處理目前常用的試劑有:核失活－碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(Iodoacetate)；質(zhì)失活－羅丹明（R－6－G，一種親脂染料，能夠抑制線粒體的氧化磷酸化過程而達(dá)到失活的目的）用于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)失活的方法分為物理和化學(xué)兩類：當(dāng)前54頁，總共84頁。二、原生質(zhì)體的融合（一）原生質(zhì)體融合方法PEG融合電融合當(dāng)前55頁，總共84頁。PEG誘導(dǎo)融合：1制備原生質(zhì)體懸浮液；2混合好的原生質(zhì)體懸浮液中逐滴加入PEG溶液，可在倒置顯微鏡下觀察；3將PEG中的原生質(zhì)體于室溫下保溫15～20min；4待大多數(shù)細(xì)胞圓球化，再在原生質(zhì)體懸浮液滴頂部加一滴高鈣溶液，靜置10～20min；5用原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗滌，500r/m離心去除融合液，培養(yǎng)原生質(zhì)體。當(dāng)前56頁，總共84頁。由于PEG分子具有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成氫鍵當(dāng)PEG分子鏈足夠長(zhǎng)時(shí)，在相鄰原生質(zhì)體之間形成分子橋，其結(jié)果是使原生質(zhì)體發(fā)生粘連與膜相連的PEG分子被洗掉后，膜上電荷發(fā)生紊亂而重新分配另外，PEG能增加類脂膜的流動(dòng)性，使原生質(zhì)體的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能

PEG融合的機(jī)理：當(dāng)前57頁，總共84頁。-+-+-橋梁++--PEG被洗掉++--電荷重排++--原生質(zhì)體膜接觸++-融合當(dāng)前58頁，總共84頁。融合成本低，勿需特殊設(shè)備融合子產(chǎn)生的異核率較高融合過程不受物種限制融合過程繁瑣PEG可能對(duì)細(xì)胞有毒害PEG融合的特點(diǎn)：當(dāng)前59頁，總共84頁。電融合誘導(dǎo)法：1、將已制備好的親本原生質(zhì)體均勻混合放入融合小室中；2、微電極型的兩個(gè)電極的端部同時(shí)與兩靠近的原生質(zhì)體膜表面接觸，所產(chǎn)生的5～12mA的脈沖電流間斷刺激1～5ms，原生質(zhì)體瞬時(shí)發(fā)生暫時(shí)性的收縮，兩層膜之間形成小孔，連接成橋，形成一個(gè)個(gè)泡囊，最后形成融合體；3、平行多電極通過1MHz的交流電場(chǎng)發(fā)生雙向電脈沖，原生質(zhì)體在電場(chǎng)力作用下極化產(chǎn)生偶極子原生質(zhì)體緊密排開成串珠狀，在直流電脈沖作用下，質(zhì)膜被擊穿，進(jìn)一步形成融合體。當(dāng)前60頁，總共84頁。1細(xì)胞膜的接觸：當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時(shí)，電場(chǎng)通電后，電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液，結(jié)果是原生質(zhì)體在電場(chǎng)作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串；2膜的擊穿：原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖后就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個(gè)緊密接觸的細(xì)胞融合在一起電融合的基本過程：當(dāng)前61頁，總共84頁。電融合法的原理交流電場(chǎng)使原生質(zhì)體表面電荷偶極化，沿著電極排列，形成串珠負(fù)極正極--+-++++--+-+-+-+-+-+-當(dāng)前62頁，總共84頁。施加直流電場(chǎng)后，形成串珠的原生質(zhì)體在質(zhì)膜接觸處發(fā)生穿孔，開始遺傳物質(zhì)的交流+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-當(dāng)前63頁，總共84頁。當(dāng)前64頁，總共84頁。--交流電壓--交變電場(chǎng)的振幅頻率--交變電場(chǎng)的處理時(shí)間--直流高頻電壓--脈沖寬度--脈沖次數(shù)電融合中的主要參數(shù)：當(dāng)前65頁，總共84頁。一是不存在對(duì)細(xì)胞的毒害問題二是融合效率高三是融合技術(shù)操作簡(jiǎn)便與PEG融合比較起來，電融合有三大優(yōu)點(diǎn)：當(dāng)前66頁，總共84頁。交流電使原生質(zhì)體排成串珠

直流電使原生質(zhì)體質(zhì)膜發(fā)生不可逆擊穿電融合儀的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：一是交變電場(chǎng)部分一是高頻直流電擊部分當(dāng)前67頁，總共84頁。（二）原生質(zhì)體融合過程1、凝聚作用階段，其間兩個(gè)或兩個(gè)以上的原生質(zhì)體的質(zhì)膜彼此靠近；2、在很小的局部區(qū)域質(zhì)膜緊密粘連，彼此融合，在兩個(gè)原生質(zhì)體之間細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)連續(xù)狀態(tài)，或是出現(xiàn)橋；3、由于細(xì)胞質(zhì)橋的擴(kuò)展，融合完成，形成球形的異核體或同核體。當(dāng)前68頁，總共84頁。原生質(zhì)體質(zhì)量融合方法融合參數(shù)(三)影響原生質(zhì)體融合的因素當(dāng)前69頁，總共84頁。雜種細(xì)胞的發(fā)育動(dòng)態(tài)雜種細(xì)胞的選擇系統(tǒng)與體細(xì)胞雜種植株的鑒定體細(xì)胞雜種的特點(diǎn)體細(xì)胞雜種后代的遺傳三、雜種細(xì)胞的發(fā)育動(dòng)態(tài)及體細(xì)胞雜種鑒定當(dāng)前70頁，總共84頁。（一）雜種細(xì)胞的發(fā)育動(dòng)態(tài)核融合核質(zhì)重組細(xì)胞器重組部分核物質(zhì)或細(xì)胞器丟失融合核分裂當(dāng)前71頁，總共84頁。（二）雜種細(xì)胞的選擇系統(tǒng)與體細(xì)胞雜種植株的鑒定1、雜種細(xì)胞的選擇系統(tǒng)外觀選擇互補(bǔ)選擇熒光標(biāo)記選擇當(dāng)前72頁，總共84頁。大豆根間懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的+粉藍(lán)煙草葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體原生質(zhì)體

異核體具有濃厚細(xì)胞質(zhì)的非綠色綠色、液泡化（1）利用天然顏色標(biāo)記分離雜種細(xì)胞：既具有粉藍(lán)煙草原生質(zhì)體特有的綠色質(zhì)體又具有與大豆原生質(zhì)體相似的形態(tài)和豐富的細(xì)胞質(zhì)帶當(dāng)前73頁，總共84頁。Galbraith等用發(fā)綠色熒光的異硫氰酸熒光素（FITC）和發(fā)紅色熒光的堿性蕊香紅熒光素分別標(biāo)記了兩種煙草的葉肉原生質(zhì)體，有效選擇出了雜種細(xì)胞。（2）利用熒光素標(biāo)記分離