第五章基因組測序技術(shù)詳解演示文稿

第五章基因組測序技術(shù)詳解演示文稿當前1頁，總共117頁。優(yōu)選第五章基因組測序技術(shù)當前2頁，總共117頁。一些主要模式生物基因組測序概況2000年：3月，Celera公司完成果蠅（Drosophilamelanogaster）基因組（180Mb）的全部測序工作，在當時所有已測序的基因組中是最大的

，同時這也證明了“全基因組鳥槍法”的可行性；

2000年

12月，第一個植物基因組——擬南芥（Arabidopsisthaliana）基因組被全部測序

，大小為125Mb.當前3頁，總共117頁。一、測序流程1.構(gòu)建生物基因組文庫或cDNA文庫

DNA的提取和制備→酶切制備克隆用DNA片段

→與載體連接→轉(zhuǎn)化受體細胞

→篩選鑒定→擴增培養(yǎng)。2.從基因組文庫中提取DNA大片段，進行測序：將DNA用超聲波（或限制性內(nèi)切酶）切成能夠測序的小片斷(200-500bp)→小片斷和載體結(jié)合，植入細菌中進行擴增（或用PCR擴增）→從細菌中提取出繁殖好的質(zhì)粒→酶切，制取測序的DNA片段3.測序：上測序儀測序。4.利用重疊技術(shù)，排出DNA大片段的序列。當前4頁，總共117頁。二、DNA測序的方法雙脫氧鏈終止法測序化學降解法測序自動化測序非常規(guī)DNA測序當前5頁，總共117頁。（一）Sanger的雙脫氧鏈末端終止法

1.基本原理:

通過合成與單鏈DNA互補的多核苷酸鏈，由于合成的互補鏈可在不同位置隨機終止反應，產(chǎn)生只差一個核苷酸的DNA分子，從而來讀取待測DNA分子的順序。當前6頁，總共117頁。Cambridge的F.Sanger在1977年發(fā)明用雙脫氧鏈終止法測定單鏈DNA的序列，其基本原理如下：

①DNA聚合酶能夠用單鏈DNA作為模板，合成準確的DNA互補鏈；②該酶能夠用2‘，3’--雙脫氧核苷三磷酸作底物并將其聚合到新生寡核苷酸鏈的3‘-末端，從而終止其延伸反應。在DNA測序反應中，加入模板DNA，引物（特異性引物），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一種ddNTP。常用Klenow大片段，無5'→3'外切酶活性?；驹?當前7頁，總共117頁。2.技術(shù)路線與要求制備單鏈模板↓將單鏈模板與一小段引物退火↓加入DNA多聚酶

4種脫氧核苷酸分別加入少量4種雙脫氧核苷酸

↓將4種反應產(chǎn)物分別在4條泳道電泳↓根據(jù)4個堿基在4條泳道的終止位置讀出基因序列

A克隆于質(zhì)粒中DNA→用堿或熱變性BM13克隆單鏈DNAC噬粒克隆DNADPCR產(chǎn)生單鏈DNAA高酶活性B無5’→3′外切酶活性C無3′→5′外切酶活性ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP的3’碳原子連接的是氫原子,不是羥基當前8頁，總共117頁。5ˊPP5ˊ3ˊHOOH3ˊ5ˊPOH3ˊP325ˊ5ˊPOH3ˊHODNA聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTPddGTPddATPddTTPddCTP制備單鏈DNA加放射性引物當前9頁，總共117頁。ddGTPddATPddTTPddCTP5ˊ

32P-GTCATGTGCTAG5ˊ

32PGTCATGTGCTA5ˊ

32PGTCATGTGCT5ˊ

32PGTCATGTGC5ˊ

32PGTCATGTG5ˊ

32PGTCATGT5ˊ

32PGTCATG5ˊ

32PGTCAT5ˊ

32PGTCA5ˊ

32PGTC5ˊ

32PGT5ˊ

32PG聚合產(chǎn)物分別在4個泳道電泳從下到上依次讀出DNA片段的核苷酸序列當前10頁，總共117頁。當前11頁，總共117頁。（二）Maxam-Gilbert的化學降解法1.基本原理是用化學試劑處理具有末端放射性標記的DNA片段，造成堿基的特異性切割并產(chǎn)生一組具有不同長度的DNA鏈降解產(chǎn)物，經(jīng)凝膠電泳分離和放射自顯影之后，可直接讀出待測DNA片段的核苷酸序列。當前12頁，總共117頁。2技術(shù)路線將雙鏈DNA樣品變?yōu)閱捂湣總€單鏈的同一方向末端都用放射性同位素標記,以便顯示DNA條帶↓分別用不同方法處理,獲得只差一個核苷酸的降解DNA群體↓電泳,讀取DNA的核苷酸順序當前13頁，總共117頁。Maxam-Gilbert測序法的特異斷裂32P32PATCGATCG32PATCGATATCGATSpecificReactiontoG

化學法無放射線片段不能顯像斷裂處斷裂處ATCGATCGAT當前14頁，總共117頁。Maxam-Gilbert法所用的化學技術(shù)

堿基特異修飾方法GPh8.0,用硫酸二甲酯對N7進行甲基化,使C8-C9鍵對堿基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0哌啶甲酸可使嘌呤環(huán)的N原子化,從而導致脫嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鳥嘌呤的糖苷鍵C+T肼可打開嘧啶環(huán),后者重新環(huán)化成五元環(huán)后易除去C1.5mol/LNaCl存在時,可用肼除去胞嘧啶當前15頁，總共117頁。5ˊPP5ˊ3ˊHOOH3ˊ5ˊHOOH5ˊ3ˊHOOH3ˊ5ˊ32PP325ˊ3ˊHOOH3ˊ5ˊ32POH3ˊ硫酸二甲酯甲酸肼肼＋NaClGG+AT+CC堿性磷酸單酯酶除去5ˊ磷酸基多核苷酸磷酸激酶γ-32P-ATP分離單鏈DNA分別在4個試管中進行特異斷裂當前16頁，總共117頁。GG+AT+CC5ˊ

32P-GTCATGTGCTAG5ˊ

32PGTCATGTGCTA5ˊ

32PGTCATGTGCT5ˊ

32PGTCATGTGC5ˊ

32PGTCATGTG5ˊ

32PGTCATGT5ˊ

32PGTCATG5ˊ

32PGTCAT5ˊ

32PGTCA5ˊ

32PGTC5ˊ

32PGT5ˊ

32PG斷裂產(chǎn)物分別在4個泳道電泳從下到上依次讀出DNA片段的核苷酸序列當前17頁，總共117頁?；瘜W法測序?qū)嵗哙ぎ斍?8頁，總共117頁。改進的特異化學切割反應當前19頁，總共117頁。（三）自動化測序1.基本原理與鏈終止法測序原理相同,只是用不同的熒光色彩標記ddNTP,如ddATP標記紅色熒光,ddCTP標記藍色熒光,ddGTP標記黃色熒光,ddTTP標記綠色熒光.由于每種ddNTP帶有各自特定的熒光顏色,而簡化為由1個泳道同時判讀4種堿基.當前20頁，總共117頁。當前21頁，總共117頁。（四）非常規(guī)測序1.毛細管電泳

用毛細管電泳取代聚丙烯凝膠平板電泳,節(jié)省時間,加快測序進程,其他程序同鏈終止法或化學測序法.2.光點測序

脫氧三磷酸核苷酸連接到DNA3’-末端時會釋放1個焦磷酸(PPi),焦磷酸在磷酸化酶的作用下轉(zhuǎn)化為化學能,并發(fā)出光亮.由此,往反應液中每次只加入1種核苷酸,當加入的核苷酸結(jié)合時,反應液發(fā)出亮點,并記錄核苷酸種類;當核苷酸未結(jié)合時,反應液中的核苷酸酶迅速分解此核苷酸,由此來測定DNA序列.

當前22頁，總共117頁。3.DNA芯片測序基本原理將各種排列順序的寡核苷酸點播在芯片上,每個點播的寡核苷酸在排列的方陣中都有指定的位置.待檢測的DNA分子與芯片溫浴,凡是能雜交的寡核苷酸都會在確定位置發(fā)出信號,然后根據(jù)獲取的信息將寡核苷酸的順序進行對比組裝,拼接成完全的DNA順序.當前23頁，總共117頁。利用基因芯片進行雜交測序的原理當前24頁，總共117頁。三、測序及序列的組裝的策略（一）隨機測序與序列組裝

隨機測序也稱”鳥槍法”.

當前25頁，總共117頁。ABC小片段測序計算機拼裝鳥槍法(Shotgun)測序的問題

CAATGCATTA……GCAGCCAATGCGAP錯裝當前26頁，總共117頁。實例:流感嗜血桿菌基因組的測序及順序組裝超聲波打斷純化的基因組DNA↓瓊脂糖電泳收集1.6～2.0Kb的區(qū)段、純化

↓構(gòu)建到質(zhì)粒載體中↓隨機挑選19687個克隆,進行28643次測序,得到可讀順序為11631485bp↓組裝成140個覆蓋全基因組范圍的獨立的順序重疊群,↓當前27頁，總共117頁。各重疊群間仍有間隙

順序間隙物理間隙

↓↓

載體或宿主菌選用不當而被丟失的順序測序時遺漏的測序解決辦法:通過相鄰已知順序作為探針篩選已有的基因組文庫解決辦法:利用其它宿主菌與載體重新構(gòu)建文庫當前28頁，總共117頁。序列組裝原理:直接從已測序的小片段中尋找彼此重疊的測序克隆,然后依次向兩側(cè)鄰接的序列延伸.優(yōu)點:不需預先了解任何基因組的情況.ABCABCABCABC小片段測序計算機拼裝當前29頁，總共117頁。（二）限制測序限制測序：是指將一段染色體區(qū)段的DNA順序進行組裝.

一些已繪制了遺傳圖與物理圖的微生物基因組測序中也采用這一方法.

如高等植物擬南芥基因組的測序完全依據(jù)克隆重疊群,先進行各個BAC克隆的隨機測序,再進行序列組裝；

水稻基因組測序計劃采取得策略與此相同.當前30頁，總共117頁。（三）指導測序與序列組裝建立在基因組圖譜基礎(chǔ)上的”鳥槍法”,即所謂”指導鳥槍法”或”指導測序”。在人類基因組進入測序組裝階段就采用此方法，其基本步驟如下:A構(gòu)建平均為2Kb的人類基因組質(zhì)粒文庫,進行雙向測序;B構(gòu)建平均10Kb的人類基因組質(zhì)粒文庫,進行雙向測序,讀取2個端部順序;C參考人類基因組圖,特別是大量的STS位標作為基點,進行序列組裝，排成重疊克隆群.當前31頁，總共117頁。先將染色體打成比較大的片段(幾十-幾百Kb),利用分子標記將這些大片段排成重疊的克隆群(Contig),分別測序后拼裝.這種策略叫基于克隆群(contig-based)的策略.ABCABC大片段contig小片段測序拼裝當前32頁，總共117頁。兩種策略的比較鳥槍法策略指導測序策略不需背景信息構(gòu)建克隆群

(遺傳、物理圖譜)時間短需要幾年的時間需要大型計算機得到的是草圖(Draft)得到精細圖譜當前33頁，總共117頁。（四）其他測序路線1.重要區(qū)域優(yōu)先測序人們對感興趣的基因或與疾病相關(guān)的基因優(yōu)先測序.如:人類主要組織相容性復合區(qū)位于第6號染色體,與人類免疫系統(tǒng)有關(guān)，因而優(yōu)先測序.當前34頁，總共117頁。2.EST(Expressedsequencetag)測序

EST是一種重要的基因組圖分子標記,以EST為探針很容易從cDNA文庫中篩選全基因,又可從BAC克隆中找到其基因組的基因序列.

優(yōu)點:AmRNA可直接反轉(zhuǎn)錄成cDNA,而且cDNA文庫也比較容易構(gòu)建;B對cDNA文庫大量測序,即可獲得大量EST的序列;CEST為基因的編碼區(qū),不包括內(nèi)含子和基因間區(qū)域,一次測序的結(jié)果足以鑒定所代表的基因;當前35頁，總共117頁。四、人類基因組計劃

人類基因組計劃（Humangenomeproject）于1990年啟動，我國于1999年加入該計劃，承擔其中1%的任務，即人類3號染色體短臂上約30Mb的測序任務。

當前36頁，總共117頁。1.人類基因組計劃的目的

闡明人類基因組30億個堿基對的序列，發(fā)現(xiàn)所有人類基因，并搞清其在染色體上的位置;破譯人類全部遺傳信息，使人類第一次在分子水平上全面地認識自我;解碼生命、了解生命的起源、了解生命體生長發(fā)育的規(guī)律;認識種屬之間和個體之間存在差異的起因、認識疾病產(chǎn)生的機制以及長壽與衰老等生命現(xiàn)象、為疾病的診治提供科學依據(jù)。當前37頁，總共117頁。2.人類基因組草圖的完成

2000年6月26日是人類歷史上值得紀念的一天。人類基因組的工作草圖已經(jīng)繪制完畢并于這天向全世界公布。最終完成圖要求測序所用的克隆能忠實地代表常染色體的基因組結(jié)構(gòu)，序列錯誤率低于萬分之一。當前38頁，總共117頁。二000年六月二十六日克林頓宣布人類基因組草圖繪制完成當前39頁，總共117頁。美國國家人類基因組研究所所長弗朗西斯·柯林斯在介紹情況。

當前40頁，總共117頁。人類基因組草圖基本信息由31.65億bp組成含3~3.5萬基因與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的基因占2%人類基因組人類蛋白質(zhì)61%與果蠅同源43%與線蟲同源46%與酵母同源當前41頁，總共117頁。2000年6月公共領(lǐng)域測序計劃工作框架圖當前42頁，總共117頁。2001年2月16日

人類基因組“精細圖”完成，(99%),2003年4月14日人類基因組序列圖亦稱“完成圖”（99.99%），提前繪制成功當前43頁，總共117頁。A.CeleraGenomics人類基因組的測序策略3.人類基因組測序策略當前44頁，總共117頁。采集5個自愿者的DNA樣品構(gòu)建3種不同插入子大小的基因組文庫2Kb,10Kb和50Kb完成約2700萬次插入子末端測序,總長14800MbGeneBank下載104018個BAC末端順序PFP發(fā)表的公開數(shù)據(jù)主要為BAC克隆的順序,共4443.3Mb隨機測序與序列組裝方法和指導測序與序列組裝方法相結(jié)合進行序列組裝當前45頁，總共117頁。B國際人類基因組測序策略構(gòu)建BAC克隆↓限制性酶處理獲得指紋↓根據(jù)指紋重疊方法組建BAC克隆重疊群↓根據(jù)STS標記,將BAC克隆重疊群標定在物理圖上↓每個BAC克隆內(nèi)部采用鳥槍法測序,組裝↓將BAC插入順序與BAC克隆指紋極重疊群對比,將已閱讀的順序錨定到物理圖上當前46頁，總共117頁。當前47頁，總共117頁。4.人類基因組測序結(jié)果

基因數(shù)是3萬、4萬還是10萬

人類遺傳基因數(shù)量比原先估計的少很多。目前研究表明，人類基因組中約有3萬至4萬個蛋白編碼基因，僅僅是果蠅基因數(shù)目的兩倍，人有而鼠沒有的基因只有300個。此結(jié)論是由兩大科研小組的數(shù)據(jù)是從DNA水平上得出的；而“人類有10萬多個基因”則是從RNA水平上得出的結(jié)論。所以，這些數(shù)據(jù)不能推翻“人類有10萬個基因”的說法。當前48頁，總共117頁。人類基因組研究的驚人發(fā)現(xiàn)?19號染色體是含基因最豐富的染色體，而13號染色體含基因量最少?目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和定位了26000多個功能基因，其中尚有42%的基因尚不知道功能?人類基因組中存在“熱點”和大片“荒漠”。在染色體上有基因成簇密集分布的區(qū)域，也有大片的區(qū)域只有“無用DNA”——不包含或含有極少基因的成分?；蚪M上大約有1／4的區(qū)域沒有基因的片段。

?35．3％的基因包含重復的序列。這說明那些原來被認為是“垃圾”的DNA也起重要作用，應該被進一步研究。當前49頁，總共117頁。什么是單核苷酸多態(tài)性人類99．9％的基因密碼是相同的，而差異不到0．1％，不同人群僅有140萬個核苷酸差異。這些差異是由“單一核苷酸多樣性”（SNP）產(chǎn)生的，它構(gòu)成了不同個體的遺傳基礎(chǔ)，個體的多樣性被認為是產(chǎn)生遺傳疾病的原因。在整個基因組序列中，人與人之間的變異僅為萬分之一，從而說明人類不同“種屬”之間并沒有本質(zhì)上的區(qū)別。當前50頁，總共117頁。5.人類基因組計劃的意義隨著人類基因組逐漸被破譯，一張生命之圖將被繪就，人們的生活也將發(fā)生巨大變化。人類基因研究的意義在于它可以支持和推動生命科學中一系列重要的基礎(chǔ)性研究。如基因組遺傳語言的破譯，基因的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，生命的起源和進化，細胞發(fā)育、生產(chǎn)、分化的分子機理，疾病發(fā)生的機理等。當前51頁，總共117頁。（1）確定人類基因組中約5萬個編碼基因的序列及其在基因組中的物理位置，研究基因的產(chǎn)物及其功能。（2）了解轉(zhuǎn)錄和剪接調(diào)控元件的結(jié)構(gòu)與位置，從整個基因組結(jié)構(gòu)的宏觀水平上理解基因轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。當前52頁，總共117頁。（3）從整體上了解染色體結(jié)構(gòu)，包括各種重復序列以及非轉(zhuǎn)錄“框架序列”的大小和組織，了解各種不同序列在形成染色體結(jié)構(gòu)、DNA復制、基因轉(zhuǎn)錄及表達調(diào)控中的影響與作用。

（4）研究空間結(jié)構(gòu)對基因調(diào)節(jié)的作用。有些基因的表達調(diào)控序列與被調(diào)節(jié)基因從直線距離上看，似乎相距甚遠，但若從整個染色體的空間結(jié)構(gòu)上看則恰恰處于最佳的調(diào)節(jié)位置，因此，有必要從三維空間的角度來研究真核基因的表達調(diào)控規(guī)律。當前53頁，總共117頁。（5）發(fā)現(xiàn)與DNA復制、重組等有關(guān)的序列。DNA的忠實復制保障了遺傳的穩(wěn)定性，正常的重組提供了變異與進化的分子基礎(chǔ)。局部DNA的推遲復制、異常重組等現(xiàn)象則導致疾病或者胚胎不能正常發(fā)育，因此，了解與人類DNA正常復制和重組有關(guān)的序列及其變化，將對研究人類基因組的遺傳與進化提供重要的結(jié)構(gòu)上的依據(jù)。當前54頁，總共117頁。（6）研究DNA突變、重排和染色體斷裂等，了解疾病的分子機制，包括遺傳性疾病、易感性疾病、放射性疾病甚至感染性疾病引發(fā)的分子病理學改變及其進程，為這些疾病的診斷、預防和治療提供理論依據(jù)。（7）確定人類基因組中轉(zhuǎn)座子、逆轉(zhuǎn)座子和病毒殘余序列，研究其周圍序列的性質(zhì)。了解有關(guān)病毒基因組侵染人類基因組后的影響，可能指導人類有效地利用病毒載體進行基因治療。

當前55頁，總共117頁。（8）研究染色體和個體之間的多態(tài)性。這些知識可被廣泛用于基因診斷、個體識別、親子鑒定、組織配型、發(fā)育進化等許多醫(yī)療、司法和人類學的研究。此外，這些遺傳信息還有助于研究人類歷史進程、人類在地球上的分布與遷移以及人類與其他物種之間的比較。當前56頁，總共117頁。以人類基因組和擬南芥基因組為例說明你對生物基因組全序測定工作的科學意義與社會意義的認識（8分）中國科學院2002年

碩士學位研究生入學分子遺傳學試題當前57頁，總共117頁。6.人類基因組計劃的倫理學A個人DNA順序的隱私權(quán).

如:”次等”基因攜帶者可能受到岐視,職業(yè)限制,醫(yī)療保險等問題;B基因?qū)＠麊栴}當前58頁，總共117頁。7.后人類基因組計劃

伴隨著人類基因組計劃的迅速進展，基因的全序列逐步被完整的測出，會出現(xiàn)大量的不知道任何功能信息的序列。因此，在HGP完成之后，即全部人類基因被定序之后，還需要：破解貯存于基因組之中的遺傳語言;識別、分離、鑒定和克隆所有基因；搞清每個基因的功能及基因之間的相互作用和相互關(guān)系。當前59頁，總共117頁。水稻的基因組

2002年我國科學家完成了水稻基因組定序和初步分析。出人意表的是，水稻的基因竟比人類基因還要多得多。人類基因大約有3-4萬個，水稻有46022-55615個基因。因此水稻基因組可說是繼人類基因組之后，完成定序的最大基因組，也是至今已知最大的植物基因組。由于水稻是全球半數(shù)以上人口的主食，對解決全球糧食問題具有重要意義。當前60頁，總共117頁?；蚪M學概述基因組（genome），又稱染色體組一個物種單倍體的染色體數(shù)目，物種全部遺傳信息的總和物種遺傳信息的“總詞典”控制發(fā)育的“總程序”生物進化歷史的“總檔案”當前61頁，總共117頁?；蚪M學（genomics）1986年提出，至今20年，已經(jīng)發(fā)展成為遺傳學中最重要的分支學科。對物種的所有基因進行定位、作圖、測序和功能分析當前62頁，總共117頁?；蚪M學研究的最終目標獲得生物體全部基因組序列鑒定所有基因的功能明確基因之間的相互作用關(guān)系闡明基因組的進化規(guī)律

當前63頁，總共117頁。經(jīng)典遺傳學在20世紀初，遺傳學剛剛誕生的時候，遺傳學家的工作主要是鑒別感興趣的基因，確定這些基因在染色體上的位置。第一個環(huán)節(jié)：尋找自發(fā)突變體，或者利用物理、化學因素誘發(fā)突變。第二個環(huán)節(jié)：通過連鎖分析確定新基因與已知基因的相互關(guān)系，繪制遺傳連鎖圖。當前64頁，總共117頁。幾個代表物種的基因組大小當前65頁，總共117頁。CREDIT:JOESUTLIFFScience,Vol291:1221.FishinginaMoreEffectiveWay!當前66頁，總共117頁?；蚪M學的研究內(nèi)容結(jié)構(gòu)基因組學功能基因組學蛋白質(zhì)組學當前67頁，總共117頁。結(jié)構(gòu)基因組學（structuralgenomics）基因定位基因組作圖測定核苷酸序列當前68頁，總共117頁。功能基因組學（functionalgenomics）又稱后基因組學（postgenomics)

基因的識別、鑒定、克隆基因結(jié)構(gòu)、功能及其相互關(guān)系基因表達調(diào)控的研究當前69頁，總共117頁。人類基因組計劃1990，美國國立衛(wèi)生研究所和能源部投資＄30億，啟動了人類基因組計劃，預計15年時間完成人類基因組全部序列的測定1996，完成標記密度為0.6cM的人類基因組遺傳圖譜，100kb的物理圖譜2000，完成草圖2001年2月，公布人類基因組圖譜的修訂版2002，完成測序工作當前70頁，總共117頁?；蚪M圖譜的構(gòu)建基因組計劃的主要任務是獲得全基因組序列但是，現(xiàn)在的測序方法每次只能測800～1000bp大量的測序片段要拼接要知道序列在Chr上的位置才能正確拼接基因組計劃的第一個環(huán)節(jié)：構(gòu)建基因組圖譜當前71頁，總共117頁?；蚪M圖譜遺傳圖譜（geneticmap）物理圖譜（physicalmap）當前72頁，總共117頁。遺傳圖譜（geneticmap）采用遺傳分析的方法將基因或其它DNA序列標定在染色體上構(gòu)建連鎖圖。當前73頁，總共117頁。遺傳標記有可以識別的標記，才能確定目標的方位及彼此之間的相對位置。構(gòu)建遺傳圖譜就是尋找基因組不同位置上的特征標記。包括：形態(tài)標記細胞學標記生化標記

DNA分子標記當前74頁，總共117頁。多態(tài)性（polymophism）所有的標記都必須具有多態(tài)性！花色：白色、紅色株高：高、矮血型：A、B、O型淀粉：糯、非糯所有多態(tài)性都是基因突變的結(jié)果！當前75頁，總共117頁。形態(tài)標記形態(tài)性狀：株高、顏色、白化癥等又稱表型標記數(shù)量少很多突變是致死的受環(huán)境、生育期等因素的影響當前76頁，總共117頁。最早建立的果蠅連鎖圖，就是利用控制果蠅眼睛的形狀、顏色，軀體的顏色、翅膀的形狀等形態(tài)性狀作為標記，分析它們連鎖關(guān)系及遺傳距離，繪制而成的。控制性狀的其實是基因，所以形態(tài)標記實質(zhì)上就是基因標記。當前77頁，總共117頁。果蠅連鎖圖當前78頁，總共117頁。細胞學標記明確顯示遺傳多態(tài)性的染色體結(jié)構(gòu)特征和數(shù)量特征染色體的核型染色體的帶型染色體的結(jié)構(gòu)變異染色體的數(shù)目變異優(yōu)點：不受環(huán)境影響缺點：數(shù)量少、費力、費時、對生物體的生長發(fā)育不利當前79頁，總共117頁。生化標記又稱蛋白質(zhì)標記就是利用蛋白質(zhì)的多態(tài)性作為遺傳標記。

如：同工酶、貯藏蛋白優(yōu)點：數(shù)量較多，受環(huán)境影響小缺點：受發(fā)育時間的影響、有組織特異性、只反映基因編碼區(qū)的信息當前80頁，總共117頁。DNA分子標記簡稱分子標記以DNA序列的多態(tài)性作為遺傳標記優(yōu)點：不受時間和環(huán)境的限制遍布整個基因組，數(shù)量無限不影響性狀表達自然存在的變異豐富，多態(tài)性好共顯性，能鑒別純合體和雜合體當前81頁，總共117頁。限制性片段長度多態(tài)性

（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）

DNA序列能或不能被某一酶酶切，相當于一對等位基因的差異。

如有兩個DNA分子（一對染色體），一個具有某一種酶的酶切位點，而另一個沒有這個位點，酶切后形成的DNA片段長度就有差異，即多態(tài)性。可將RFLP作為標記，定位在基因組中某一位置上。人類基因組中有105個RFLP位點，每一位點只有兩個等位基因。當前82頁，總共117頁。RFLP分析當前83頁，總共117頁。RFLP標記位共顯性標記當前84頁，總共117頁。微衛(wèi)星（microsatellite）標記微衛(wèi)星又稱為簡單重復序列（simplesequencerepeat，SSR）。這種重復序列的重復單位很短，常常只有2個、3個或4個核苷酸如一條染色體TCTGAGAGAGACGC

另一染色體TCTGAGAGAGAGAGAGAGACGC，就構(gòu)成了多態(tài)性。當前85頁，總共117頁。遺傳圖譜的構(gòu)建方法

理論基礎(chǔ):連鎖與交換基本方法:兩點測驗法和三點測驗法當前86頁，總共117頁。植物遺傳圖譜的構(gòu)建選擇研究材料（親本）構(gòu)建分離群體遺傳標記檢測標記間的連鎖分析當前87頁，總共117頁。選擇親本

要求親緣關(guān)系遠，遺傳差異大但又不能相差太大以導致引起子代不育。對備選材料進行多態(tài)(差異)性檢測，綜合測定結(jié)果，選擇有一定量多態(tài)性的一對或幾對材料作為遺傳作圖親本。當前88頁，總共117頁。構(gòu)建作圖群體

當前89頁，總共117頁。遺傳標記的染色體定位利用遺傳學方法或其它方法將少數(shù)標記錨定在染色體上，作為確定連鎖群的參照系。常用的方法：單體分析三體分析代換系分析附加系分析當前90頁，總共117頁。標記間的連鎖分析利用在兩個親本間有多態(tài)性的標記分析分離群體中所有個體的基因型根據(jù)連鎖交換的情況，確定標記之間的連鎖關(guān)系和遺傳距離有計算機軟件可以應用當前91頁，總共117頁。水稻遺傳圖

1994年，水稻第一張高密度遺傳圖譜

927個位點，1383個標記

1998年，1157個位點，2275個標記

2000年，3267個標記高密度的遺傳圖譜為基因組測序和遺傳研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。當前92頁，總共117頁。人類遺傳圖譜的構(gòu)建

不可能根據(jù)需要選擇親本，設(shè)計雜交組合，構(gòu)建分離群體！只能檢測現(xiàn)存家庭連續(xù)幾代成員的基因型家系分析法資料有限、必須借助于統(tǒng)計學方法當前93頁，總共117頁。現(xiàn)有的人類遺傳圖譜

1～22號染色體

8個家系134個成員

X染色體，12個家系170個成員

5364個SSR標記

2335個位點標記間的平均距離599kb當前94頁，總共117頁。物理圖譜的構(gòu)建用分子生物學方法直接檢測DNA標記在染色體上的實際位置繪制成的圖譜稱為物理圖譜。有遺傳圖譜為什么還要構(gòu)建物理圖譜？

當前95頁，總共117頁。遺傳圖譜的缺陷分別率有限人類只能研究少數(shù)減數(shù)分裂事件，不能獲得大量子代個體測序要求每個標記的間隔小于100kb

實際是599kb當前96頁，總共117頁。遺傳圖譜的缺陷精確性不夠經(jīng)典遺傳學認為，交換是隨機發(fā)生的基因組中有些區(qū)域是重組熱點倒位、重復等染色體結(jié)構(gòu)變異會限制交換重組當前97頁，總共117頁。酵母遺傳圖與物理圖比較A遺傳圖B物理圖當前98頁，總共117頁。物理作圖的方法1、限制酶作圖2、依靠克隆的基因組作圖3、熒光原位雜交4、序列標簽位點作圖當前99頁，總共117頁。限制酶作圖（restrictionmapping）當前100頁，總共117頁。限制酶作圖（restrictionmapping）當前101頁，總共117頁。熒光原位雜交

（fluorescentinsituhybridization，F(xiàn)ISH）當前102頁，總共117頁。熒光原位雜交

（fluorescentinsituhybridization，F(xiàn)ISH）當前103頁，總共117頁。熒光原位雜交

（fluorescentinsituhybridization，F(xiàn)ISH）當前104頁，總共117頁。熒光原位雜交

（fluorescentinsituhybri