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文檔簡介
1核酸分子雜交NucleicAcidHybridization核酸分子雜交專家講座第1頁21.
Basicprincipleofnucleicacidhybridization2.
Basicmethodofnucleicacidhybridization3.BiochipTechnology4.Preparation&labelofnucleicacidprobes5.
FactorsofnucleicacidhybridizationContents核酸分子雜交專家講座第2頁3核酸分子雜交技術發(fā)展史Hall等1961年工作開始,探針與靶序列在溶液中雜交,經(jīng)過平衡密度梯度離心分離雜交體。Bolton等1962年設計了第一個簡單固相雜交方法,稱為DNA-瓊脂技術。60年代末,Britten等研究液相中DNA復性以比較不一樣起源核酸復雜度,用UV260nm吸光度來監(jiān)測互補鏈復性程度。60年代中期Nygaard等將DNA或RNA探針固定在硝酸纖維素(NC)膜上。Brown等應用這一技術評定了爪蟾rRNA基因拷貝數(shù)。是當代膜雜交試驗基礎。固相化學技術和核酸自動合成儀誕生。70年代末期到80年代早期,分子克隆成為可能。能夠從基因組DNA文庫和cDNA文庫中取得特定基因克隆,制備大量探針DNA。1975年英國愛丁堡大學Southern建立了Southern印記雜交技術,用于轉(zhuǎn)化子分析。核酸分子雜交專家講座第3頁4TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1993.
"fortheirdiscoveriesofsplitgenes"
年上海交通大學微生物研究所核酸分子雜交專家講座第4頁5DNAmRNA法國科學家Chambon遺憾hybridizationelectronmicrographofOvalbuminmRNAandDNA核酸分子雜交專家講座第5頁6OvalbumingenehnRNAmodificationSplicingofhnRNAMaturemRNA核酸分子雜交專家講座第6頁7SectionIBasicprincipleofnucleicacidhybridization核酸分子雜交專家講座第7頁8denaturationrenaturation
核酸分子雜交是基于核酸分子變性和復性原理基礎上產(chǎn)生和發(fā)展起來。核酸分子雜交專家講座第8頁9DNA變性是指在物理或化學原因作用下,DNA分子互補堿基對之間氫鍵斷裂,使雙鏈DNA分子變成兩條單鏈DNA過程。I.Denaturation&renaturationofDNA核酸分子雜交專家講座第9頁101.FactorsthatcauseDNAdenaturation酸堿熱變性劑(尿素酰胺)有機溶劑(乙醇丙酮)核酸分子雜交專家講座第10頁112.changesinphysicalandchemicalpropertiesofdenaturedDNA
Hyperchromiceffect粘度下降
浮力上升核酸分子雜交專家講座第11頁12λ(nm)A82℃OD260(A260)光密度(OD)亦稱光吸收值(A)增色效應:DNA變性時,其溶液OD260增高。HyperchromiceffectistheincreaseofOD260ofamaterialthatoccurswhentheDNAduplexisdenatured.核酸分子雜交專家講座第12頁13OD260應用核酸濃度測定核酸純度測定dsDNA:1OD260=50ug/mlssDNA/RNA:1OD260=40ug/ml寡核苷酸:1OD260=20ug/mlDNAOD260OD280=1.8~2.0>2.0RNA污染<1.8蛋白質(zhì)、酚污染RNAOD260OD280=1.8~2.0>2.2降解為核苷酸<1.7蛋白質(zhì)、酚污染核酸分子雜交專家講座第13頁14
Tm:雙鏈DNA變性二分之一所需要溫度稱為解鏈溫度或融解溫度(meltingtemperature,Tm)。不一樣DNA含有不一樣Tm值,普通為85~90℃,其大小與G+C含量成正比。Tm=(G+C)%×0.41+69.3Thermaldenaturation核酸分子雜交專家講座第14頁15PCR熱變性溫度,普通為93~97℃。核酸分子雜交專家講座第15頁16
變性DNA在適當條件下,兩條互補鏈可恢復天然雙螺旋構象,這一現(xiàn)象稱為復性。減色效應:
DNA復性時,其溶液OD260降低。3.RenaturationofDNAHypochromiceffectisthedecreaseofOD260ofamaterialthatoccurswhentheDNAisrenatured.核酸分子雜交專家講座第16頁17BasepairingofDNArenaturation核酸分子雜交專家講座第17頁18DNA濃度
DNA片段大小
DNA片段復雜性
適當復性溫度
適當離子強度影響復性速度原因:核酸分子雜交專家講座第18頁19II.核酸分子雜交
不一樣起源含有互補序列兩條核酸單鏈在一定條件下按堿基配對標準形成雙鏈過程。
DNA-DNA
DNA-RNA
RNA-RNA探針待測核酸分類核酸分子雜交專家講座第19頁20
DNA-DNA雜交雙鏈分子變性復性
DNA-RNA雜交雙鏈分子
RNA-RNA
雜交雙鏈分子
寡核苷酸-DNA或RNA
雜交雙鏈分子核酸分子雜交專家講座第20頁21核酸分子雜交技術基本原理
有互補特定核苷酸序列單鏈DNA或RNA混在一起時,其對應同源區(qū)段將會退火形成雙鏈結構。如把一段已知基因(DNA或RNA)核酸序列用適當標識物(如放射性同位素、生物素等)給予標識,看成探針(probe),與變性后單鏈DNA或RNA進行雜交。再用適當方法(如放射自顯影或免疫組織化學等技術)把標識物檢測出來,就可確定靶核苷酸序列是否存在、拷貝數(shù)及表示豐度等。核酸分子雜交專家講座第21頁22
應用:(1)檢測特定生物有機體之間是否存在親緣關系;(2)用來揭示核酸片段中某一特定基因存在是否、拷貝數(shù)及表示豐度。核酸分子雜交專家講座第22頁23第二節(jié)核酸分子雜交
基本方法核酸分子雜交專家講座第23頁24
液相雜交固相雜交原位雜交Southernblot(檢測DNA)Northernblot(檢測RNA)斑點雜交/狹縫雜交核酸分子雜交專家講座第24頁25三種印跡技術比較SouthernblotNorthernblotWesternblot核酸分子雜交專家講座第25頁26
是指將電泳分離、原位變性單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移到固相支持物上,然后,與核酸探針雜交,檢測DNA方法。一、Southern
Blot核酸分子雜交專家講座第26頁27帶有DNA片段凝膠DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳轉(zhuǎn)膜雜交、顯影凝膠濾膜(尼龍膜/硝酸纖維素膜)吸附有DNA片段膜Southern印跡雜交技術流程膠內(nèi)變性核酸分子雜交專家講座第27頁28基本步驟DNA制備、酶切電泳分離原位DNA變性DNA轉(zhuǎn)膜預雜交、雜交、洗脫雜交結果檢測(二)待測DNA樣品電泳分離(三)凝膠中核酸變性(四)Southern轉(zhuǎn)膜(一)待測核酸樣品制備(五)Southern雜交(六)雜交結果檢測核酸分子雜交專家講座第28頁29細胞組織化學試劑裂解細胞勻漿器研磨破碎組織中細胞蛋白酶、RNA酶消化大部分蛋白質(zhì)和RNA酚/氯仿除去殘余蛋白質(zhì)DNA(100kb±)乙醇(一)待測核酸樣品制備核酸分子雜交專家講座第29頁30
部分消化
充分消化限制酶消化EEEEEEHHDNA片段:(最長DNA片段控制在大約2kb)核酸分子雜交專家講座第30頁311000500250100750121:DNAmarker2:試驗組(EcoRI)0.8~1%非變性瓊脂糖凝膠(二)待測DNA樣品電泳分離核酸分子雜交專家講座第31頁32堿變性:DNA原位變性,形成單鏈分子,方便進行分子雜交。酸中和:凝膠pH值恢復中性,方便DNA片段轉(zhuǎn)移。(三)凝膠中核酸變性核酸分子雜交專家講座第32頁33
(四)Southern轉(zhuǎn)膜及固定(250-500g)毛細管虹吸印跡法毛細轉(zhuǎn)移真空轉(zhuǎn)移電轉(zhuǎn)移核酸分子雜交專家講座第33頁34核酸分子雜交專家講座第34頁35核酸分子雜交專家講座第35頁36轉(zhuǎn)移后,各個DNA片段在膜上相對位置與在凝膠中相對位置依然一樣,因而稱為印跡(blot)。瓊脂糖凝膠硝酸纖維素膜印跡(blot)注意:做好點樣方向標識核酸分子雜交專家講座第36頁37預雜交:目標是將膜上全部能與DNA結合位點全部封閉,降低本底,使背景清楚潔凈。甲酰胺20×SSCDenhardt氏溶液鮭精DNASDS雜交:預雜交液+探針DNA(六)Southern雜交預雜交液(五)探針制備核酸分子雜交專家講座第37頁38洗膜:高低1×SSC:Na+濃度0.2mol/L2×SSC:Na+濃度0.4mol/L0.2×SSC:Na+濃度0.04mol/L0.1×SSC:Na+濃度0.02mol/LNa+濃度除去:未反應探針與濾膜疏松結合探針非特異性結合探針核酸分子雜交專家講座第38頁39
X-ray片雜交膜放射自顯影(七)雜交結果檢測非放射性雜化分子檢測核酸分子雜交專家講座第39頁40DNA分子雜交應用:
可進行DNA片段定位和分子量測定
可用于基因酶切圖譜分析、基因突變分析
可用于檢出特異DNA片段
可用于基因文庫和cDNA文庫篩選核酸分子雜交專家講座第40頁41分子雜交試驗流程①②③核酸分子雜交專家講座第41頁42
是指待測RNA樣品經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到固相支持物上,然后與標識核酸探針進行固-液相雜交,檢測RNA(mRNA)方法。二、NorthernBlot樣品是RNA。電泳前,不酶切。電泳前,樣品變性。電泳過程中,樣品保持變性狀態(tài)。電泳后,樣品不再變性,直接轉(zhuǎn)膜。需要尤其注意預防RNA被降解。全部器皿都要進行處理,盡可能除盡RNA酶。核酸分子雜交專家講座第42頁43三、Westernblotting核酸分子雜交專家講座第43頁44
將RNA或DNA變性后直接點樣于硝酸纖維素膜或尼龍膜上,再采取特定探針進行雜交,這種雜交方法稱為斑點雜交(dotblotting)或狹縫雜交(slotblotting)。四、斑點及狹縫雜交核酸分子雜交專家講座第44頁45多孔過濾加樣器加樣板支撐板抽真空板接真空泵印跡為圓形,稱為斑點印跡印跡為線狀,稱為狹縫印跡核酸分子雜交專家講座第45頁46正常對照組試驗組1試驗組2試驗組3用于特定基因表示定性及定量研究用于基因突變分析核酸分子雜交專家講座第46頁47
標識探針與細胞或組織切片中核酸進行雜交并對其進行檢測一個方法稱原位雜交。五、原位雜交
(insituhybridization)
檢測基因在細胞內(nèi)表示與定位
檢測染色體中特定基因位置等
可用于基因克隆篩選菌落原位雜交(裂菌)核酸分子雜交專家講座第47頁48基本步驟:原位雜交分為:組織、細胞固定預處理預雜交、雜交雜交結果檢測細胞內(nèi)原位雜交和組織切片原位雜交(10%甲醛等)(蛋白酶、SDS、TritonX-100)(核素和非核素標識探針)核酸分子雜交專家講座第48頁49菌落原位雜交核酸分子雜交專家講座第49頁50核酸分子雜交專家講座第50頁51HPVFISH熒光原位雜交(FluorescenceinsituHybridization)人類染色體端粒DNA熒光原位雜交照片核酸分子雜交專家講座第51頁52三種印跡技術比較SouthernblotNorthernblotWesternblot膠內(nèi)變性上樣前變性上樣前變性變性膠預雜交-核酸分子雜交專家講座第52頁53第三節(jié)生物芯片技術核酸分子雜交專家講座第53頁54生物芯片
生物芯片(biochip)是近年來在生命科學領域中快速發(fā)展起來一項高新技術,主要是指經(jīng)過微加工技術和微電子技術在固體芯片表面構建微型生物化學分析系統(tǒng),以實現(xiàn)對細胞、蛋白質(zhì)、DNA及其它生物組分準確、快速與大信息量檢測。核酸分子雜交專家講座第54頁55DNA芯片
蛋白質(zhì)芯片
其它芯片生物芯片包含:按用途分:-樣品制備芯片
-生化反應芯片-檢測芯片核酸分子雜交專家講座第55頁56是指將許多特定DNA片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積支持物上,然后與待測熒光標識樣品進行雜交,雜交后用熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進行掃描,經(jīng)過計算機系統(tǒng)對每一位點熒光信號做出檢測、比較和分析,從而快速得出定性和定量結果。該技術亦被稱作DNA微陣列(DNAmicroarray)。一、基因芯片基因芯片(genechip)核酸分子雜交專家講座第56頁57基因芯片(genechip)
Cy3Cy5核酸分子雜交專家講座第57頁58許多特定DNA片段或cDNA片段作為探針Cy3Cy5核酸分子雜交專家講座第58頁59核酸分子雜交專家講座第59頁60芯片制作工藝流程圖(光引導原位聚合技術)核酸分子雜交專家講座第60頁61生物芯片研究總流程圖主要基因芯片生產(chǎn)廠商:Affymetrix企業(yè)Clontech企業(yè)Panomics企業(yè)核酸分子雜交專家講座第61頁62是將高度密集排列蛋白分子作為探針點陣固定在固相支持物上,當與待測蛋白樣品反應時,可捕捉樣品中靶蛋白,再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進行定性和定量分析一個技術。二、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)分子間親和反應蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)蛋白質(zhì)芯片作用原理核酸分子雜交專家講座第62頁63蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)抗原芯片原理圖核酸分子雜交專家講座第63頁64第四節(jié)探針制備與標識核酸分子雜交專家講座第64頁65核酸探針(probe):
探針是指帶有檢測標識,能與被檢測核苷酸片段互補一段已知核苷酸片段。cDNA探針基因組DNA探針寡核苷酸探針RNA探針探針種類:核酸分子雜交專家講座第65頁66一、合成寡核苷酸探針注意標準(1)長度(10-50bp);(2)G:C對含量40%-60%;(3)探針內(nèi)防止互補;(4)防止同一堿基連續(xù)出現(xiàn);(5)與非靶序列有70%以上同源性或連續(xù)8個以上堿基序列相同,最好不用。核酸分子雜交專家講座第66頁67(1)標識前后探針基本結構、化學性質(zhì)相同;(2)特異性強、本底低、重復性好;(3)操作簡單、節(jié)時;(4)安全、無環(huán)境污染。二、標識物1、
一個理想標識物應滿足:核酸分子雜交專家講座第67頁682、標識物種類32P、35S、3H、125I等半抗原:生物素(biotin)、地高辛(Dig)熒光素:異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明等酶:辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等化學發(fā)光探針:增強魯米諾發(fā)光體系、吖啶類化合物發(fā)光體系和堿性磷酸酶催化1,2-二氧環(huán)己烷發(fā)光體系非核素標識物核素標識物核酸分子雜交專家講座第68頁69體內(nèi)標記體外標記化學法酶法三、標識方法缺口平移法隨機引物標識法PCR標識法末端標識法核酸分子雜交專家講座第69頁70利用標識物分子上活性基團與探針分子上基團(如磷酸基團)發(fā)生化學反應將標識物直接結合到探針分子上?;瘜W法:多聚體乙撐亞胺聚苯醌酶(如HRP)交聯(lián)多聚體乙撐亞胺酶DNA戊二醛交聯(lián)核酸分子雜交專家講座第70頁71酶法:OH5'5'3'
32P-dATP
生物素-dUTPorNTP
地高辛-dUTPorNTP
熒光素-dNTP核酸分子雜交專家講座第71頁72DNaseI5'5'3'3'5'5'3'3
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