蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座

蛋白質雙向電泳及質譜技術蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第1頁蛋白質雙向電泳技術蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第2頁雙向電泳介紹2-DE是當前唯一個能夠僅經(jīng)過一次操作解析上千種蛋白質技術。第一向—等點聚焦(IEF)pH梯度載體pI第二向—十二烷基硫酸鈉(SDS) SDS作為變性劑和助溶劑分子量蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第3頁樣品等點聚焦(第一向)雙向電泳基本原理與流程示意分子量pH梯度(pI)SDS兩性電解質pH9-pH3+聚丙烯酰胺第二向蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第4頁雙向電泳詳細步驟樣品制備緩沖液配制IPG條重泡漲及上樣第一向：IEFIPG條平衡平衡緩沖液Ⅰ(還原)平衡緩沖液Ⅱ(巰烷基化)第二向：SDS膠條染色成像及圖像分析蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第5頁為何要進行樣品制備當前雙向電泳普通只能分辨到1000-3000個蛋白質點(spot)，而樣品中蛋白種類可到達10萬種以上。待研究樣本(如臨床樣本)常是各種細胞和組織混雜，而蛋白質組研究通常是單一細胞類型。？蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第6頁1確保樣品蛋白質完全溶解，分級效果好，干擾原因少盡可能使全部待分析蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包含多數(shù)疏水性蛋白）。防止樣品制備過程中發(fā)生樣品抽提后化學修飾（如酶性或化學性降解等）。完全去除樣品中核酸和一些干擾蛋白。盡可能去除起干擾作用高豐度或無關蛋白，從而確保待研究蛋白可檢測性。經(jīng)過超離心去除全部顆粒狀物質，預防其堵塞凝膠孔路。2最大程度降低樣品損失低溫保留樣品(普通需低于-86℃)盡可能縮短處理時間除鹽，省略無須要過程確保樣品在聚焦時不發(fā)生蛋白聚集和沉淀。樣品制備標準蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第7頁樣品制備流程及注意事項溶解預處理(清洗等)破碎沉淀按溶解度分級富集除雜蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第8頁樣品破碎標準－最小程度降低蛋白水解和其它形式蛋白降解樣品起源易碎細胞堅硬組織植物細胞真菌方法溫和猛烈蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第9頁溫和破碎法滲透壓沖擊(培養(yǎng)細胞)低滲液中懸浮細胞重復凍融法(細菌)液氮冷凍去污劑降解(酵母、霉菌)降解緩沖液(含尿素和去污劑)SDS(應在IEF前往除)酶降解(植物、細菌、真菌)溶菌酶(細菌)纖維素酶，果膠酶(植物)溶壁酶(酵母)蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第10頁猛烈破碎法超聲破碎(細胞懸浮液)需以冰涼卻防止過熱弗式細胞壓碎器(Frenchpressurecell，帶壁微生物細胞在剪切力作用下破碎研磨(固體組織，微生物)液氮中將固體組織磨成細粉末樣品研磨器(用于少許樣品處理)用于準確樣品珠磨法(胞懸液，微生物)經(jīng)過磨珠研磨破壞細胞壁蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第11頁作用去除雜質濃縮樣品抑制蛋白酶活性關鍵-可溶性取得能夠重新溶解蛋白慣用方法硫酸銨沉淀TCA沉淀丙酮沉淀TCA/丙酮沉淀醋酸銨/甲醇/苯酚抽提樣品沉淀

對于疏水性尤其強蛋白如膜蛋白硫脲SDS新型兩性表面活性劑(如磺基甜菜堿)蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第12頁樣品中雜質去除去除標準盡可能不丟失蛋白降低蛋白修飾雜質主要種類DNA/RNA脂質多糖鹽離子去污劑其它固體雜質

蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第13頁DNA/RNA去除樣品中含核酸不利影響能被銀染色法染色在凝膠酸性部分產(chǎn)生水平條紋當樣品抵達IEF凝膠酸性端時，與蛋白質一同沉淀去除方法蛋白沉淀法DNase/RNase處理超聲(機械破壞)、超高速離心DNA/RNA抽提(苯酚/氯仿)蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第14頁其它雜質去除脂質使蛋白質不易溶解且會影響其分子量及pI丙酮沉淀多糖阻塞膠體，影響蛋白質沉淀、聚焦TCA、硫酸銨或醋酸銨/甲苯/苯酚沉淀；超速離心和高pH鹽使膠條導電能力增強，共聚焦不易發(fā)生透析；膠體過濾；沉淀或重新懸浮離子去污劑如SDS，使蛋白質帶負電不能聚焦丙酮沉淀；將含SDS蛋白溶于含兩性或非離子去污劑如CHAPS，TritonX-100，NP-40等緩沖液中并使SDS終濃度＜0.25%固體雜質阻塞膠體，影響蛋白質沉淀、聚焦過濾蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第15頁樣品溶解2-DE成功分離蛋白質最關鍵原因之一溶解目標樣品中非共價結合蛋白質復合物和聚積體完全破壞，從而形成各個多肽溶解液（不然樣品中結合牢靠蛋白復合物可能使2-DE中出現(xiàn)新蛋白點，對應表示單個多肽點強度會下降）溶解方法必須允許可能干擾2-DE分離鹽、脂類、多糖和核酸等物質去除溶解方法要確保樣品在電泳過程中保持溶解狀態(tài)蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第16頁增加樣品溶解性伎倆變性劑改變氫鍵結構，使蛋白疏水中心暴露伸展尿素、硫尿表面活性劑溶解疏水基團離子去污劑SDS、非離子去污劑TritonX-100和NP-40、兩性離子去污劑CHAPS等還原劑使變性蛋白深入伸展溶解含自由巰基DTT或-巰基乙醇，不帶電荷磷酸三丁酯(TPB)起載體作用兩性電解質抵達平衡位置形成pH梯度，“運載”電流、pH捕捉樣品中少許鹽分濃度應小于0.2％（w/v，濃度過高會使IEF速度降低)蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第17頁樣品液準備標準液：2g4%CHAPS定容至50mLddH2O100uL0.1%原液0.0002%溴酚藍見下表0.2%兩性電解質載體385mgDTT或500uL200mMTBP原液50mMDTT或2mMTBP24g尿素加入25mLH2O8M尿素用量試劑蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第18頁IPG

用兩親性電解液組成250l25l20%8-10125l12.5l40%7-97-10250l25l40%5-85-8125l12.5l40%4-6250l25l40%3-53-6125l12.5l40%5-7125l12.5l40%4-64-7250l25l40%3-103-10樣品溶液體積(/5ml)樣品溶液體積(/5ml)兩親性電解液濃度(w/v)兩親性電解液范圍IPG膠pH范圍蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第19頁樣品制備注意事項

蛋白質水解低溫Tris堿，碳酸鈉或堿性載體兩性電解質蛋白抑制劑特殊樣品制備低豐度蛋白分離預分級窄pH膠(<2個pH單位)強堿性蛋白(如核糖體)處理預處理富集特殊pH梯度IPG膠條（如pH3－12、4-12或10-12）進行等電聚焦極端分子量蛋白處理小于8kD對流混合，產(chǎn)生絨毛狀或含糊帶大于200kD蛋白，變性為多肽蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第20頁梯度器塑料支持膜固定pH梯度(ImmobilizedpHGradient,IPG)膠條制備ACBFED酸堿

pH3pH10蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第21頁固定pH梯度(IPG)示意圖聚丙烯酰胺凝膠CH2=CH-C-NH-ROCOO-丙烯酰胺單體酸緩沖基團：堿緩沖基團：NH3+R

蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第22頁寬pH梯度及窄pH梯度寬pH梯度用于：

全部蛋白(確定感興趣蛋白大致位置)窄pH梯度用于：

提升分辨率增加載樣能力以檢測、分析更多蛋白

蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第23頁IPG膠重泡漲及上樣2-DE樣品重泡漲溶液重泡漲溶液：8M尿素2%NP-40或

CHAPS2%IPG緩沖液

(兩親性電解液)0.28%DTT微量

溴酚藍IPG膠條支架IPG

膠條定位泡漲目標：使樣品能完全以可溶形式進入IPG膠條內蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第24頁蛋白載樣量IPG膠條對蛋白載樣量影響原因：待分析蛋白點量應滿足隨即質譜分析待研究蛋白豐度樣品復雜度復雜度較高樣品，為了盡可能了解所包含每種蛋白，需要重復試驗才能完成。假如將待檢樣品被富集以后則更易分析。IPG膠條pH范圍預試驗確定先寬后窄先線性后非線性先短后長蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第25頁第一向：等點聚焦1.放置電極墊

(?)2.200V

維持

1.5h3.500V維持

1.5h

4.1000V梯度上升

1500vh5.8000V梯度上升

(?)36000vh時間電壓支架蓋IPG

膠條電極電極墊蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第26頁IPG

膠條平衡

平衡液6M尿素和30%甘油降低電內滲第一步平衡加DTT使變性非烷基化蛋白處于還原狀態(tài)第二步平衡加碘乙酰胺使蛋白質巰烷基化，預防其在電泳過程中重新氧化蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第27頁

使被分離蛋白質與SDS完整結合第二向:SDS

SDS平衡SDSSDS平衡液50mMTris-HCl6M尿素30%丙三醇2%SDS微量

溴酚藍SDSSDSSDS向電泳緩沖液中加

0.5%瓊脂糖SDS標識紙片IPG膠條蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第28頁膠體考馬斯亮藍染色靈敏度為30~100ng，線性范圍是20倍可實現(xiàn)PAGE無背景染色會對蛋白質進行修飾而影響質譜分析結果胺基黑染色轉印至聚偏二氟乙烯（PVDF）上蛋白質染色轉印至硝酸纖維素膜上蛋白質染色銀染可降低膠內蛋白質產(chǎn)量對一些種類蛋白質染色效果差對其后蛋白質測序和質譜分析造成影響染色方法蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第29頁銀染色50%甲醇25%乙酸4hddH2O洗3次30min/次0.004%DTT溶液30min0.1%AgNO330minddH2O30sec3%Na2CO30.0185%甲醛2.3M檸檬酸5%乙酸25%甲醇蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第30頁負染主要包含金屬鹽染料、鋅－咪唑染料等使用能專門提升PAGE膠上蛋白質回收率速度快（5~15min）且能保持蛋白質生物活性不能用于膜上染色適合用于蛋白質顯色、完整蛋白質膠上被動提取以及質譜分析膠體擴散染料主要包含印度墨水染料、膠體金屬染料等高靈敏度檢出電轉印至硝酸纖維素和PVDF膜上蛋白質靈敏度與PAGE膠內銀染類似不用于膠內染色染色方法蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第31頁有機熒光團染料包含共價結合和非共價結合熒光團染料兩類，后者最為慣用，其經(jīng)典代表是已經(jīng)商品化SYPRORed、Orange、Ruby等熒光染料可對SDS膠內蛋白質進行一步染色，約30~60min完成靈敏度為2~10ng其線性范圍為3個數(shù)量級在Tris/甘氨酸轉印緩沖液中染色后，蛋白質可被轉印至膜上并進行免疫染色或Edman測序來判定蛋白質金屬螯合染料與當代蛋白質組學研究相兼容專門與慣用微量化學表征過程兼容不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很輕易和集成化蛋白質組學平臺（包含自動化凝膠染色儀、圖像分析工作站、機器人剪切儀器、蛋白質酶解工作站和質譜儀等）相結合染色方法蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第32頁凝膠圖像處理分析經(jīng)典流程凝膠圖像掃描圖像加工斑點檢測和定量凝膠配比數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)呈遞和解釋2-DE數(shù)據(jù)庫建立2-DE分離可溶性

E.coli蛋白蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第33頁當前雙向電泳需處理問題樣品制備及溶解不溶性蛋白(膜蛋白及核內蛋白)難分離蛋白(如毛發(fā)及皮膚中蛋白)載樣量提升初步分離低豐度蛋白、堿性蛋白及大分子量蛋白定量分析靈敏度及可重復性蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第34頁對于雙向電泳提議首先采取寬pH范圍膠條，確定蛋白分布范圍，通常采取pH3-10膠條假如pH線性分布膠條分離效果不好，可采取非線性膠條加大蛋白上樣量，提升局部蛋白分辨率采取窄pH范圍膠條，提升某pH范圍蛋白分辨率第二向采取梯度膠進行分離去除高豐度蛋白，進行蛋白分級處理，富集低豐度蛋白蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第35頁蛋白質質譜技術蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第36頁質譜基礎

樣品離子源質量分析器離子檢測器固體液體蒸汽形成離子(帶電分子)電離質量分選(過濾)檢測依據(jù)m/z分選離子數(shù)據(jù)處理質譜檢測離子基本步驟:1.樣品離子化2.依據(jù)質量(m/z)不一樣分離離子3.檢測每種質量離子數(shù)目4.搜集、處理數(shù)據(jù)得到質譜圖蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第37頁質譜評價指標質量范圍速度靈敏度分辨率準確度蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第38頁+++自由漂移區(qū)檢測器基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)樣品探針激光335nmm/z相對強度MH+MH+MH+特點：靈敏度高準確度高分辨率高質量范圍廣圖譜簡明速度快蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第39頁ESI四級桿質量分析器碰撞室反射器MCP檢測器碰撞氣體串聯(lián)質譜法(MS/MS)ESI-Q-TOF質譜儀步驟：1質量分析

2碰撞(離子裂解)3質量分析TOF質量分析器蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第40頁強抗背景干擾能力極高檢測靈敏度和準確度可用來分析復雜混合物中蛋白質豐富檢測信息，高通量判別蛋白質串聯(lián)質譜優(yōu)點蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第41頁1、判定和注釋蛋白質路線

經(jīng)過肽質譜指紋圖（peptidemassfingerprinting，PMF）和數(shù)據(jù)庫搜尋匹配經(jīng)過串聯(lián)質譜進行單個或多個蛋白質判定鳥槍法蛋白質組學蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第42頁

1234.5396

783.9147375.2561多肽已測得質譜數(shù)據(jù)或理論質譜數(shù)據(jù)MALDI-TOF檢測多肽指紋

胰酶消化凝膠蛋白質數(shù)據(jù)庫?123比較:??是否相同

??質譜3235.2256蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第43頁

肽質譜指紋圖在數(shù)據(jù)庫中匹配

不成功可能原因樣品量太少，PMF圖信噪比太低，輸入庫中搜尋數(shù)據(jù)質量不好。2-DE膠上所取一個蛋白質點并非單一蛋白質，所獲PMF圖實際上是兩個以上蛋白質混合圖。蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第44頁

操作中角蛋白或其它蛋白質污染蛋白質發(fā)生了較多轉譯后修飾，數(shù)據(jù)庫中未有記載所用胰蛋白酶質量不夠好，蛋白酶自酶解片段多未知新蛋白質數(shù)據(jù)庫規(guī)模太小續(xù)：蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第45頁氨基酸序列VLDPNTVFAL蛋白質數(shù)據(jù)庫？查詢串聯(lián)質譜圖從頭測序輸入輸出序列片段PNT①②③串聯(lián)質譜判定多肽計量方法蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第46頁組織切片或印片原位質譜分析技術兩級飛行時間串聯(lián)質譜（MALDI-TOF/TOF）傅里葉轉換盤旋共振質譜（FTMS）表面增強激光解吸/電離飛行時間質譜（SELDI-TOF-MS）聯(lián)合技術準確判定蛋白質蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第47頁2、基于生物質譜定量蛋白質組研究策略

原理：對于含有相同離子化能力蛋白質或多肽，能夠經(jīng)過比較質譜峰強度（或峰面積）得到待比較蛋白質相對量。

蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第48頁3、基于質譜蛋白質相互作用研究方法靶蛋白制備蛋白質復合體純化蛋白質復合體質譜判定基本步驟：蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第49頁(1)親和層析耦聯(lián)質譜技術

基本原理：將某種蛋白質以共價鍵固定在基質（如瓊脂糖）上，含有與之相互作用蛋白質細胞裂解液過柱，先用低鹽溶液洗脫下未結合蛋白質，然后用高鹽溶液或SDS溶液洗脫結合在柱子上蛋白質，最終用多維液相色譜耦聯(lián)質譜技術（MDLC-ESI-MS/MS）判定靶蛋白結合蛋白。蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第50頁先決條件得到足夠多保持生物活性重組靶蛋白作為誘餌（bait）

取得足夠量、純度高與誘餌相互作用蛋白質蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第51頁利用含靶蛋白融合蛋白取得

相互作用蛋白質谷胱甘肽S轉移酶（glutathioneS-transferase，GST）融合蛋白蛋白A融合蛋白蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第52頁主要優(yōu)點

靈敏度高：高濃度靶蛋白候選蛋白質與靶蛋白結合機會均等檢測多亞基蛋白質之間相互作用蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第53頁(2)免疫共沉淀耦聯(lián)質譜技術

原理：以細胞內源性靶蛋白為誘餌，用抗靶蛋白抗體與細胞總蛋白進行免疫共沉淀（immuno-precipitation，IP）純化靶蛋白免疫復合物，凝膠電泳分離后，質譜判定靶蛋白結合蛋白。

蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第54頁研究鼻咽癌細胞系中p53相互作用蛋白抗p53抗體與HNE1和HNE2總蛋白進行免疫共沉淀SDS分離免疫沉淀復合物切取p53結合蛋白條帶，酶解后進行電噴霧串聯(lián)質譜（LC-ESI-MS/MS）分析，得到對應肽序列標簽搜索數(shù)據(jù)庫蛋白質雙向電泳及質譜技術專家講座第55頁特點

生理條