DNA的生物合成精

DNA的生物合成精第1頁/共55頁一.DNA的復(fù)制復(fù)制部位：真核生物：細胞核原核生物：細胞質(zhì)的核質(zhì)區(qū)第2頁/共55頁(一)復(fù)制的反應(yīng)n1dATPn2dCTPn3dGTPn4dTTPDNA聚合酶DNA模板DNA+（n1+n2+n3+n4)PPiPPi隨即被焦磷酸酶水解，從而推動聚合反應(yīng)的進行。一.DNA的復(fù)制第3頁/共55頁(二)復(fù)制的方式DNA復(fù)制時，親代DNA的雙螺旋先解旋并分開，然后以每條鏈為模板，按照堿基配對原則，各形成一條互補鏈。這樣，從親代的一個DNA雙螺旋分子復(fù)制成兩個與親代的堿基序列完全相同的子代DNA分子。每個子代DNA分子中，有一條鏈來自親代DNA，另一條則是新形成的，這樣的復(fù)制方式叫做半保留復(fù)制（semiconservativereplication）。半保留復(fù)制一.DNA的復(fù)制第4頁/共55頁半保留復(fù)制(二)復(fù)制的方式一.DNA的復(fù)制第5頁/共55頁如何證明半保留復(fù)制(二)復(fù)制的方式一.DNA的復(fù)制1958年，Meselson證明：用，15NH4Cl唯一氮源培養(yǎng)大腸桿菌，之后，用14NH4Cl培養(yǎng)，然后進行CsCl2進行密度梯度離心。由于15NH4Cl密度大于14NH4Cl，因此，形成不同區(qū)帶，經(jīng)過若干代培養(yǎng)后，兩個14NH4Cl區(qū)帶增多。第6頁/共55頁(二)復(fù)制的方式一.DNA的復(fù)制第7頁/共55頁(二)復(fù)制的方式一.DNA的復(fù)制半保留復(fù)制全保留復(fù)制第8頁/共55頁(三)復(fù)制反應(yīng)注意點DNA復(fù)制除入DNA聚合酶,DNA模板,dNTP外,還需要多種蛋白質(zhì)因子、引物、Mg2+等.一.DNA的復(fù)制特點：A對利福平不敏感B核糖核酸代替脫氧核糖核酸第9頁/共55頁(四)參與復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)

DNA的合成不只是dNTP之間形成磷酸二酯鍵的問題，更重要的還有信息傳遞的問題，需要保持復(fù)制的高保真度，所以復(fù)制過程涉及到許多酶及輔助因子。

合成RNA引物，又叫引物合成酶、引發(fā)酶。

1.引物酶(primer)

它以單鏈DNA為模板，以ATP、GTP、CTP、UTP為原料，從5'→3'方向合成出RNA片段，即引物。

一.DNA的復(fù)制為什么要用引物？第10頁/共55頁DNA聚合酶催化活性功能5'→3'

聚合3'→5'核酸外切5'→3'核酸外切原

核

生

物DNA聚合酶Ⅰ＋＋＋切去引物RNA，補上正確的DNA片段DNA聚合酶Ⅱ＋＋與修復(fù)有關(guān)(活性低)DNA聚合酶Ⅲ＋＋負責鏈的延長(活性高)(四)參與復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)一.DNA的復(fù)制2.DNA聚合酶(DNApolymease)第11頁/共55頁DNA聚合酶催化活性功能5'→3'

聚合3'→5'

核酸外切5'→3'

核酸外切真

核

生

物DNA聚合酶a＋切去引物RNA，補上正確的DNA片段DNA聚合酶b

＋DNA聚合酶g

＋負責鏈的延長DNA聚合酶d＋＋負責先導(dǎo)鏈的延長

(四)參與復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)一.DNA的復(fù)制2.DNA聚合酶(DNApolymease)第12頁/共55頁(四)參與復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)一.DNA的復(fù)制2.DNA聚合酶(DNApolymease)第13頁/共55頁3'→5'核酸外切(四)參與復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)一.DNA的復(fù)制2.DNA聚合酶(DNApolymease)第14頁/共55頁5'→3'核酸外切(四)參與復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)一.DNA的復(fù)制2.DNA聚合酶(DNApolymease)第15頁/共55頁

3.DNA連結(jié)酶(DNAligase)

催化DNA雙鏈中一條鏈上的缺口（3′-OH與它下游相鄰的核苷酸的5′-磷酸之間）共價連結(jié)（形成磷酸二酯鍵）。

連結(jié)過程需要能量，E.coli和某些細菌中由NAD+提供；動物細胞由ATP提供。(四)參與復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)一.DNA的復(fù)制第16頁/共55頁(四)參與復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)一.DNA的復(fù)制

3.DNA連結(jié)酶(DNAligase)第17頁/共55頁

4.使DNA雙螺旋解開的酶和蛋白質(zhì)解螺旋酶(helicase)：

將DNA的兩條鏈打開。每解開一對堿基需要水解2分子ATP。方向為5’-3’，大腸桿菌中的解螺旋酶又叫rep蛋白，但方向為3’-5’

。(四)參與復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)一.DNA的復(fù)制第18頁/共55頁單鏈結(jié)合蛋白(SSBP)：

與解鏈后的DNA單鏈結(jié)合，阻止其再次形成雙螺旋。大腸桿菌SSB為177aa多肽，以四聚體形式存在，與32個bpDNA區(qū)相結(jié)合，結(jié)合后的DNA分子僵硬，不易

彎曲，有利于單鏈DNA分子的穩(wěn)定，避免核酸酶進攻；同時降低了Tm值，進一步促進DNA的解鏈。(四)參與復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)一.DNA的復(fù)制

4.使DNA雙螺旋解開的酶和蛋白質(zhì)第19頁/共55頁旋轉(zhuǎn)酶(gyrase,untwistingprotein)：催化DNA的拓撲連環(huán)數(shù)發(fā)生變化?？煞譃橥負洚悩?gòu)酶Ⅰ和拓撲異構(gòu)酶Ⅱ。Ⅰ型酶可減少負超螺旋；Ⅱ型酶可引入負超螺旋（此時需要ATP提供能量）。具有內(nèi)切酶和連接酶活力，參與DNA復(fù)制前雙螺旋的松弛及復(fù)制后超螺旋的再恢復(fù)。

(四)參與復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)一.DNA的復(fù)制

4.使DNA雙螺旋解開的酶和蛋白質(zhì)第20頁/共55頁dn蛋白(mobilepromoter)：功能：識別DNA的合成的起始位置，與引物酶及其它一些蛋白組成復(fù)合體啟動RNA引物鏈的合成。(四)參與復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)一.DNA的復(fù)制

4.使DNA雙螺旋解開的酶和蛋白質(zhì)第21頁/共55頁（五）復(fù)制的過程

復(fù)制從特定的位點開始，這一位置叫復(fù)制原點。

原核生物的DNA上一般只有一個復(fù)制原點，但在迅速生長時期，第一輪復(fù)制尚未完成，就在起點處啟動第二輪復(fù)制；

真核生物則有多個復(fù)制原點，可以同時啟動復(fù)制過程。1.復(fù)制的啟動一.DNA的復(fù)制第22頁/共55頁

復(fù)制過程的調(diào)控主要取決于復(fù)制啟動的頻率，而DNA延長的速度大體上是恒定的。由于真核生物在多位點上啟動復(fù)制，所以盡管其DNA比原核生物DNA大得多，但復(fù)制的總速度反而比原核生物快。

DNA的復(fù)制是由引發(fā)體識別并結(jié)合于復(fù)制原點而被啟動的，其機理比較復(fù)雜，目前還不十分明了。1.復(fù)制的啟動（五）復(fù)制的過程一.DNA的復(fù)制第23頁/共55頁

2.復(fù)制眼的形成

由于復(fù)制原點都是在DNA分子的內(nèi)部，而不是在末端，所以當復(fù)制啟動后需要在復(fù)制原點處將DNA雙螺旋局部解鏈，形成“眼狀”結(jié)構(gòu)——

復(fù)制眼。

（五）復(fù)制的過程一.DNA的復(fù)制第24頁/共55頁復(fù)制眼的結(jié)構(gòu)：

復(fù)制眼形成后，其兩端的叉子狀結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制叉。

2.復(fù)制眼的形成（五）復(fù)制的過程一.DNA的復(fù)制第25頁/共55頁

2.復(fù)制眼的形成-雙螺旋解開的過程

解螺旋酶使DNA雙螺旋局部解鏈；

SSB結(jié)合到解開的單鏈上；

拓撲異構(gòu)酶Ⅱ向DNA中引入負超螺旋，以消除由解鏈產(chǎn)生的扭曲張力(動畫)。

（五）復(fù)制的過程一.DNA的復(fù)制第26頁/共55頁（五）復(fù)制的過程一.DNA的復(fù)制第27頁/共55頁3.復(fù)制叉的推進(1)復(fù)制叉推進的方式隨著復(fù)制叉的推進，兩條新鏈的合成方向是不同的：一條鏈延伸的方向與復(fù)制叉前進的方向一致，它的合成能連續(xù)進行，稱為前導(dǎo)鏈；（五）復(fù)制的過程一.DNA的復(fù)制第28頁/共55頁

另一條鏈延伸的方向與復(fù)制叉前進的方向相反，它顯然不能被連續(xù)合成，需要復(fù)制叉推進了一定的長度，有了一段DNA單鏈后，才能以此為模板合成一個片段。因此這條新鏈的合成是不連續(xù)的，而且總晚于先導(dǎo)鏈，所以稱為隨后鏈。（五）復(fù)制的過程一.DNA的復(fù)制3.復(fù)制叉的推進-復(fù)制叉推進的方式第29頁/共55頁這種前導(dǎo)鏈連續(xù)合成，隨后鏈斷續(xù)合成的方式，稱為半不連續(xù)復(fù)制。隨后鏈中合成的多個DNA片段，稱為岡崎片段。岡崎片段的長度原核細胞中約1000~2000個核苷酸，真核細胞中約100~200個核苷酸。

（五）復(fù)制的過程一.DNA的復(fù)制3.復(fù)制叉的推進-復(fù)制叉推進的方式第30頁/共55頁

引物酶在復(fù)制原點附近合成一段RNA引物；

DNA聚合酶Ⅲ

(原核細胞)在引物的3'末端逐個添加脫氧核苷酸。隨著復(fù)制叉的推進，親代DNA雙螺旋不斷被解開，先導(dǎo)鏈也不斷延伸。

①先導(dǎo)鏈的合成（五）復(fù)制的過程一.DNA的復(fù)制3.復(fù)制叉的推進-復(fù)制叉推進的過程第31頁/共55頁②隨后鏈的合成引物的合成：隨后鏈的每個岡崎片段都需要合成RNA引物。也是由引物酶催化。

岡崎片段的合成：DNA聚合酶Ⅲ(原核細胞)在引物的3'末端使DNA鏈延伸，直至抵達其下游的另一個岡崎片段的RNA引物的5'端。（五）復(fù)制的過程一.DNA的復(fù)制3.復(fù)制叉的推進-復(fù)制叉推進的過程第32頁/共55頁②隨后鏈的合成岡崎片段的連結(jié)：DNA聚合酶Ⅰ一面以其DNA聚合活性在上游岡崎片段的3'-OH末端添加脫氧核苷酸，一面以其5'→3'核酸外切活性切除引物，直至將引物全部切除。

DNA連接酶將最后的缺口補好。（五）復(fù)制的過程一.DNA的復(fù)制3.復(fù)制叉的推進-復(fù)制叉推進的過程第33頁/共55頁③先導(dǎo)鏈和隨后鏈中DNA的延伸由同一個DNA聚合酶Ⅲ全酶二聚體催化

隨后鏈的模板回折成環(huán)，從而使岡崎片段的延伸方向與先導(dǎo)鏈的延伸方向一致，它們的3'末端分別落在DNA聚合酶Ⅲ全酶的雙活性部位。因此，隨著聚合酶的移動，兩條鏈同時延伸。（五）復(fù)制的過程一.DNA的復(fù)制3.復(fù)制叉的推進-復(fù)制叉推進的過程第34頁/共55頁4.復(fù)制的結(jié)束復(fù)制的終止沒有特殊的信號原核生物中：

其環(huán)狀的DNA從單點開始雙向復(fù)制，當兩個復(fù)制叉在復(fù)制原點的對面處相遇并合并時，結(jié)束復(fù)制，形成兩個環(huán)狀DNA分子。（五）復(fù)制的過程一.DNA的復(fù)制第35頁/共55頁4.復(fù)制的結(jié)束復(fù)制的終止沒有特殊的信號真核生物中：

其線狀的DNA上有多個復(fù)制原點，因此形成多個復(fù)制眼，復(fù)制叉的推進使復(fù)制眼增大，直至各個復(fù)制眼融合，復(fù)制終止，形成兩個線狀DNA分子。（五）復(fù)制的過程一.DNA的復(fù)制第36頁/共55頁（五）復(fù)制的過程一.DNA的復(fù)制第37頁/共55頁（六）DNA復(fù)制的忠實性一.DNA的復(fù)制差錯率為10-9-10-10新合成的子鏈與母鏈之間堿基配對嚴格性使用引物RNADNA聚合酶對底物專一性DNA聚合酶的校對作用5.DNA修復(fù)機制第38頁/共55頁一.DNA的復(fù)制TheprobablecourseofeventsduringinitiationofE.colireplication第39頁/共55頁一.DNA的復(fù)制TheprobablecourseofeventsduringinitiationofE.colireplication第40頁/共55頁二.DNA的損傷與修復(fù)DNA分子的完整性對細胞至關(guān)重要，這一點是其它生物分子無法比擬的。在生物的進化中，DNA復(fù)制中可因DNA聚合酶催化作用引發(fā)出偶然的錯誤。環(huán)境因素（如輻射、紫外光照射、化學(xué)誘變物等）也可引起DNA序列上的錯誤，這些錯誤若不能予以改正而保留下來，會直接影響機體的生理功能，以致影響到后代的正常生長和發(fā)育。但是，生物體內(nèi)存在有效的修復(fù)（repair）體系，保證了DNA復(fù)制的高度精確性。

第41頁/共55頁二.DNA的損傷與修復(fù)1.DNA損傷的原因外環(huán)境中的射線：X-射線、紫外線等——高劑量的紫外輻射使DNA鏈上鄰近的嘧啶核苷酸之間形成化學(xué)鍵，生成二聚體；此外還有脫嘌呤作用和脫氨基作用.

第42頁/共55頁第43頁/共55頁二.DNA的損傷與修復(fù)2.修復(fù)

所有細胞對DNA的損傷都有一定的修復(fù)能力，以恢復(fù)正常的DNA結(jié)構(gòu)。修復(fù)的方式：光修復(fù)、切除修復(fù)、重組修復(fù)、SOS修復(fù)(1)光修復(fù)由DNA光裂合酶（photolyase）催化。該酶需要光（400700nm）才能激活，它能切除嘧啶二聚體之間的連鍵(C-C鍵)，從而修復(fù)由紫外照射而造成的損傷。第44頁/共55頁二.DNA的損傷與修復(fù)2.修復(fù)(2)切除修復(fù)

該類修復(fù)是指在一系列酶的作用下，將DNA分子中受損傷的部分切除，并以完整的那一條鏈為模板，合成出新的被切去的部分，然后使損傷的DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)的過程。切除修復(fù)系統(tǒng)可對多種損傷起修復(fù)作用。切除修復(fù)有核苷酸切除修復(fù)（nucleotideexcisionrepair,NER）和堿基切除修復(fù)（baseexcisionrepair,BER）兩種。

第45頁/共55頁二.DNA的損傷與修復(fù)2.修復(fù)(2)切除修復(fù)這是一種比較普遍的修復(fù)機制。其過程是：切→補→切→縫由專一性核酸內(nèi)切酶催化，在離損傷處附近切斷由DNA聚合酶在斷口處進行DNA合成由5′核酸外切酶將損傷部位切掉由連接酶將新合成的DNA鏈與原來的鏈連接第46頁/共55頁第47頁/共55頁知識窗NER缺陷與癌癥和遺傳疾病

NER缺陷與癌癥的發(fā)生有關(guān)，如著色性皮膚病，就是由于體內(nèi)NER系統(tǒng)缺陷引起皮膚細胞對日光或紫外線特別敏感，其所形成的T-T二聚體就是因缺乏能切除T-T二聚體的特異性核酸內(nèi)切酶所致，以致在后續(xù)的復(fù)制中造成遺傳信息改變，最終出現(xiàn)皮膚癌。一些常染色體退行性疾病患者對太陽光極其敏感。還有的患