gP96多肽復(fù)合物／樹突狀細(xì)胞疫苗研究

gP96多肽復(fù)合物／樹突狀細(xì)胞疫苗研究第1頁/共45頁研究背景第2頁/共45頁全世界肺癌病例1910年<200例1912年374例1920年956例（美國）新增肺癌病例肺癌死亡病例1997年178，100160，4002002年169，400154，9002003年171，900157，200發(fā)病占全部腫瘤發(fā)生的15%，死亡占全部因腫瘤死亡病例的29%第3頁/共45頁整體療效與30年前比較沒有明顯提高，總的五年生存率仍不足15%第4頁/共45頁腫瘤抗原免疫系統(tǒng)特異性抗原識別破壞和消滅腫瘤細(xì)胞抗原呈遞系統(tǒng)第5頁/共45頁HSPs具有結(jié)合細(xì)胞內(nèi)抗原性多肽的能力，可以帶有腫瘤細(xì)胞內(nèi)全部抗原肽具有該細(xì)胞特有的抗原庫的作用,稱為“分子伴侶”抗原gP96第6頁/共45頁經(jīng)典的外源性抗原呈遞途徑gP96介導(dǎo)的外源性抗原呈遞途徑通過MHC-II類分子激活CD4+T淋巴細(xì)胞通過MHC-I類分子激活CD8+T淋巴細(xì)胞第7頁/共45頁途徑激發(fā)人體有效的特異性抗腫瘤免疫功能樹突狀細(xì)胞體內(nèi)最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞第8頁/共45頁+>>gP96orDC科研工作新問題單方面要素兩方面要素gP96多價(jià)性特異性（抗原庫）DC識別抗原激活細(xì)胞免疫（專職抗原呈遞細(xì)胞）第9頁/共45頁研究內(nèi)容第10頁/共45頁肺癌組織提取gP96SDS—PAGE凝膠電泳、銀染鑒定、Western印跡分析蛋白定量分析RT-PCR檢測RNA水平表達(dá)免疫組化檢測蛋白水平表達(dá)第一部分gp96多肽復(fù)合物提取鑒定在肺癌組織中表達(dá)的研究肺癌組織gP96提取和鑒定；肺癌組織和正常組織gP96的表達(dá)水平；[目的][流程]第11頁/共45頁定量分析測得所提取的gp96蛋白濃度在0.1μg/ul左右，相當(dāng)于50-80ug/g組織。第12頁/共45頁肺癌組織細(xì)胞漿中有棕黃色顆粒聚集

正常肺組織中細(xì)胞蘇木素染色陰性

同一患者標(biāo)本

GeneN(x±s)T(x±s)tvaluepvaluegp960.6725±0.47131.110±0.4467-4.318<0.001第13頁/共45頁外周血單個(gè)核細(xì)胞提取及體外擴(kuò)增流式細(xì)胞儀鑒定gP96與樹突狀細(xì)胞共孵育制備疫苗體外CTL反應(yīng)，INF-γ濃度淋巴細(xì)胞表型分析第二部分gP96多肽復(fù)合物/DC疫苗體外誘導(dǎo)CTL反應(yīng)實(shí)驗(yàn)研究外周血來源DC培養(yǎng)和鑒定gP96多肽復(fù)合物/DC疫苗的制備gP96/DC體外實(shí)驗(yàn)

[目的][流程]第14頁/共45頁培養(yǎng)2-3天后的DC

培養(yǎng)7天后的DC

第15頁/共45頁A-1．培養(yǎng)前CD1a-A-2.培養(yǎng)后CD1a+

B-1.培養(yǎng)前CD86-B-2.培養(yǎng)后CD86+C-1.培養(yǎng)前CD83-C-2.培養(yǎng)后CD83+D-1.培養(yǎng)前CD80-D-2.培養(yǎng)后CD80+E-1.培養(yǎng)前CD14+E-2.培養(yǎng)后CD14-

CD14-；CD80+；CD83+；CD86+

第16頁/共45頁培養(yǎng)前淋巴細(xì)胞的CD3培養(yǎng)10d后淋巴細(xì)胞的CD3培養(yǎng)前淋巴細(xì)胞的CD4、CD8培養(yǎng)10d淋巴細(xì)胞的CD4、CD8CD3/CD8＋T細(xì)胞明顯增加；CD8＋/CD4＋細(xì)胞比例增加第17頁/共45頁樣本ELISA反應(yīng)的OD值(X±S)釋放IFN-γ的量（pg/ml）gp96/DC2.244±0.1334150.835gp961.674±0.1623066.847DC0.126±0.011122.966第18頁/共45頁建立動物模型以制備的疫苗免疫動物并種植腫瘤觀察成瘤率，腫瘤體積，動物生存時(shí)間第三部分gP96多肽復(fù)合物/DC疫苗

動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究

gP96/DC在小鼠體內(nèi)的抑制腫瘤生長作用的研究[目的][流程]第19頁/共45頁第20頁/共45頁LA795肺癌腫瘤組織提取Gp96小鼠外周血615小鼠肺癌模型Gp96/DC，Gp96，DC提取DC細(xì)胞觀察腫瘤生長情況及對小鼠生存期的影響第21頁/共45頁SCID小鼠PAa肺癌腫瘤組織提取Gp96人外周血免疫重建小鼠荷人肺癌免疫重建小鼠Gp96/DC疫苗提取DC細(xì)胞觀察腫瘤生長情況及對小鼠生存期的影響第22頁/共45頁100%75%615小鼠腫瘤植入后不同時(shí)間的腫瘤體積（x±scm3）組數(shù)處理動物數(shù)腫瘤植入后天數(shù)212835Ⅰ種植102.63±0.876.46±1.478.04±1.40ⅡGP9680.33±0.27※0.70±0.62※1.49±1.17※ⅢDC80.30±0.22※0.64±0.49※1.16±0.92※ⅣGP96+DC80.21±0.22※△0.32±0.30※△0.62±0.30※△615LA795※：與Ⅰ組比較，

P<0.05?！鳎号cⅡ組和Ⅲ組比較，P<0.05

第23頁/共45頁※：與Ⅰ組比較，

P<0.05。△：與Ⅱ組和Ⅲ組比較，P<0.05

615小鼠腫瘤植入后的生存時(shí)間組數(shù)處理動物數(shù)腫瘤植入后生存天數(shù)Ⅰ種植1052ⅡGP96851.5ⅢDC858.5※ⅣGP96+DC877※△第24頁/共45頁SCIDPAa※：與Ⅰ組比較，

P<0.05?！鳎号cⅡ組和Ⅲ組比較，P<0.05

SCID小鼠腫瘤植入后不同時(shí)間的腫瘤體積(X±Scm3)組數(shù)處理動物數(shù)腫瘤植入后天數(shù)212832Ⅰ重建160.38±0.120.75±0.300.90±0.33ⅡGP9680.09±0.06※0.17±0.06※0.22±0.11※ⅢDC80.08±0.06※0.15±0.08※0.24±0.11※ⅣGP96+DC80.03±0.03※△0.08±0.08※△0.12±0.13※△87.5%100%第25頁/共45頁SCID小鼠腫瘤植入后的生存時(shí)間組數(shù)處理動物數(shù)腫瘤植入后生存天數(shù)Ⅰ重建1637ⅡGP96852※ⅢDC852.5※ⅣGP96+DC8＞62※△第26頁/共45頁第27頁/共45頁討論第28頁/共45頁gP96在肺癌中的表達(dá)基因表達(dá)的檢測

mRNA水平：原位雜交、NorthernBlot、核酸酶保護(hù)分析

Real-timeRT-PCR、、半定量RT-PCR。蛋白水平。

方法比較原位雜交僅能提供mRNA在細(xì)胞內(nèi)的定位信息，不能確定mRNA的含量，受人為因素影響大，無法檢測極微量的mRNANorthernBlot敏感性低，樣品用量大，對實(shí)驗(yàn)條件要求高，需要應(yīng)用放射性物質(zhì)，不適合檢測低豐度的mRNAReal-timeRT-PCR儀器和試劑盒價(jià)格昂貴，標(biāo)準(zhǔn)物難以獲得核酸酶保護(hù)分析操作復(fù)雜，價(jià)格昂貴半定量RT-PCR

高度敏感、準(zhǔn)確、簡便、快捷、對儀器要求低、可重復(fù)性強(qiáng)、易于掌握第29頁/共45頁

與正常組織相比，肺癌組織中編碼gp96的基因在mRNA水平的表達(dá)明顯增高的。這進(jìn)一步證實(shí)了在罹患腫瘤時(shí)，以gp96為代表的HSPs合成明顯增加，這是機(jī)體受到腫瘤刺激產(chǎn)生的熱休克反應(yīng)，以此來維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，是機(jī)體的一種保護(hù)性反應(yīng)。半定量RT-PCR法mRNA水平gP96肺癌組織正常肺組織免疫組化法蛋白水平引物設(shè)計(jì)循環(huán)次數(shù)操作中注意：模板內(nèi)對照第30頁/共45頁gP96的提取

提取gP96的經(jīng)典方法（Srivastava）：飽和硫酸銨沉淀刀豆球蛋白A親和層析DEAE離子交換層析（提取率估計(jì)在20-30%，蛋白提取量在15-150ug/g組織）存在的普遍問題：蛋白提取率低，尚無法滿足臨床需要解決：更改其中的試劑或步驟：

去除飽和硫酸銨沉淀過程，離子交換層析柱換用MonoQ或POROS20QE柱

增加組織中g(shù)P96含量：

熱刺激、缺氧等物理刺激或者通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入gP96cDNA重組真核表達(dá)質(zhì)粒以增加細(xì)胞中g(shù)P96合成量

第31頁/共45頁DC的來源來源培養(yǎng)方法建立比較臍帶血1992腫瘤患者多無法獲得外周血

1994取材容易，操作簡單，，DC生成量大，純度高，可以反復(fù)進(jìn)行，患者痛苦小，便于臨床應(yīng)用，是目前獲得DC的較理想的途徑。骨髓1995穿刺操作復(fù)雜，獲得細(xì)胞量少，需多點(diǎn)反復(fù)操作，可能會增加創(chuàng)傷，給患者造成極大的痛苦第32頁/共45頁DC的分離和培養(yǎng)分離純化DC的方法物理方法根據(jù)細(xì)胞的黏附性進(jìn)行分離黏附分離法、尼龍毛分離法和羰基碳分離法等根據(jù)細(xì)胞比重進(jìn)行分離葡聚糖-泛影葡胺（Ficoll）密度梯度離心、Percoll非連續(xù)性/連續(xù)性密度梯度離心及E花環(huán)沉淀分離等方法免疫分選淘洗法、流式細(xì)胞技術(shù)、磁性細(xì)胞分離術(shù)等方法密度梯度離心獲取單個(gè)核細(xì)胞富集前體DC細(xì)胞因子體外擴(kuò)增培養(yǎng)第33頁/共45頁富集前體DC：去除粒、單核、T、B、NK和巨噬細(xì)胞方法特點(diǎn)黏附法直接黏附法對細(xì)胞干擾小，DC獲得率高間接黏附法培養(yǎng)體系小，節(jié)省細(xì)胞因子，細(xì)胞損傷大，DC獲得率低單抗法免疫磁珠和流式細(xì)胞技術(shù)需要大量的特殊抗體，細(xì)胞損失量大，價(jià)格昂貴，細(xì)胞因子作用必需GM-CSF促進(jìn)DC增殖，是最基本的因子IL-4抑制中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增殖爭議TNF-α促進(jìn)DC成熟，抑制粒細(xì)胞產(chǎn)生Flt3L促進(jìn)DC增殖，抑制DC分化其他LPS、CD40L、INF-β、INF-γ及IL-1β等第34頁/共45頁方法備注形態(tài)結(jié)構(gòu)相差顯微鏡、電鏡直觀分子表達(dá)CD1a、CD80、CD86、CD40和CD83等，特別是CD83--樹突狀細(xì)胞的標(biāo)志性分子準(zhǔn)確功能狀態(tài)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)DC的鑒定第35頁/共45頁關(guān)于動物腫瘤模型動物模型的優(yōu)越性：避免了在人身上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)所帶來的風(fēng)險(xiǎn)臨床上少見疾病可用動物隨時(shí)復(fù)制出來研究周期短，節(jié)省時(shí)間，克服人類某些疾病潛伏期長，病程長和發(fā)病率低的缺點(diǎn)可在人為控制條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)可以嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)材料的可比性取材方便，可以簡化實(shí)驗(yàn)操作和樣品收集成本低有助于更全面地認(rèn)識疾病的本質(zhì)第36頁/共45頁按產(chǎn)生原因自發(fā)性腫瘤模型實(shí)驗(yàn)動物未經(jīng)任何有意識的人工處置，在自然情況下所發(fā)生的疾病誘發(fā)性腫瘤模型使用物理的、化學(xué)的和生物的致病因素作用于動物誘發(fā)腫瘤移植性腫瘤模型人類腫瘤移植動物按系統(tǒng)范圍疾病的基本病理過程模型各種疾病共同的一些病理變化過程的模型各系統(tǒng)疾病模型與人類各系統(tǒng)疾病相應(yīng)的模型按模型種類整體模型離體器官和組織細(xì)胞株分類第37頁/共45頁已建立動物模型的人類腫瘤：肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、膠質(zhì)瘤等常用的動物：小鼠、大鼠、兔、雞胚等近交系小鼠：BALB/c、C57、C3H、615、T739、裸鼠、SCID小鼠等五十余種第38頁/共45頁SCID小鼠16號染色體近著絲點(diǎn)處單個(gè)隱性基因發(fā)生SCID突變基因重排異常免疫球蛋白重鏈T細(xì)胞抗原受體T、B淋巴細(xì)胞前體分化T、B淋巴細(xì)胞細(xì)胞免疫體液免疫免疫球蛋白缺如淋巴細(xì)胞嚴(yán)重減少對體外移植物免疫排斥低聯(lián)合缺陷+1983年Bosma免疫重建1988年Moiser骨髓胸腺脾胎肝外周血淋巴細(xì)胞腹腔皮下免