課題申報書-黃芪對腹膜透析效能及腹膜間皮細胞與腹腔免疫功能的影響

H登記序號：計劃類別：分類代碼：項目編號：科技項目計劃設計任務書項目名稱：黃芪對腹膜透析效能及腹膜間皮細胞與腹腔免疫功能的影響承擔單位：單位地址：郵編：項目負責人：職務職稱：電話：主管部門：南京市衛(wèi)生局填報日期：2002年04月26日江蘇省科學技術廳二OO一年制H

H一、立項依據：1、國內外研究現(xiàn)狀、發(fā)展趨勢及理論實踐依據：隨著腹膜透析（PeritonealDialysis，PD）技術的不斷提高和透析理論的日趨完善，尤其是1976年Popovich提出的連續(xù)非臥床腹膜透析（ContinuousAmbulatoryPeritonealDialysis，CAPD）治療方法帶來了腹膜透析的空前繁榮。近年來的流行病學資料表明接受腹膜透析治療的終末期腎功能不全（End-StageRenalDisease，ESRD）患者正以每年7.5%的比例迅速增長，目前全球已有超過120000的患者在接受腹膜透析治療。腹膜透析因其相對于血液透析更高的生活質量、顯著的殘余腎功能保護、優(yōu)于或等于血液透析的生存率以及較少的資金花費，故有作者提出，腹膜透析應該是腎臟替代療法的首選[1,2]。然而，隨著腹膜透析患者壽命的延長，腹膜透析的遠期并發(fā)癥腹膜功能衰竭已成為ESRD患者透析技術性失敗的最重要的原因[3]，并成為制約腹膜透析發(fā)展的“瓶頸”。資料顯示約1/3的腹膜透析患者6年后因腹膜功能衰竭而退出透析治療。腹膜功能衰竭與長期腹膜透析后腹膜結構和功能破壞進而導致腹膜超濾失敗以及溶質轉運功能障礙密切相關[4]。腹膜透析液的生物不相容性是導致腹膜功能衰竭的首要原因，腹膜間皮細胞作為腹膜組成部分在這一過程中扮演著重要角H

H色。近年來隨著人腹膜間皮細胞標準培養(yǎng)方法和腹膜透析動物模型的確立，腹膜功能衰竭的機理得以初步闡明。腹膜間皮細胞在長期非生理性透析液刺激下，轉移生長因子H

Hβ（TGF-β）mRNA過度表達，TGF-β作為細胞增殖與細胞外基質合成的重要調節(jié)因子，導致細胞外基質合成增加和腹膜纖維化[5]，最終導致腹膜超濾失敗和溶質轉運功能障礙。同時TGF-β也是調節(jié)細胞凋亡的重要細胞因子，組織病理學證實腹膜功能衰竭的重要特征表現(xiàn)為腹膜間皮細胞的喪失，過多的TGF-β表達將增加間皮細胞的凋亡，導致間皮細胞的完整性受到破壞，研究表明完整的間皮細胞層可以顯著延緩腹膜纖維化的進程。其次，腹膜透析的主要并發(fā)癥腹膜感染也是導致腹膜功能衰竭的重要原因,反復的炎癥刺激使腹膜局部高水平TGF-β持續(xù)存在致使腹膜發(fā)生纖維化和硬化[6]。目前公認長期腹膜透析時腹腔細胞免疫功能抑制是導致腹膜反復感染的主要原因,尤其是被認為是腹腔細胞免疫功能最重要組成部分和腹膜抵抗細菌感染第一道屏障的巨噬細胞功能的明顯抑制。研究表明，腹膜在長期非生理性透析液的刺激下，巨噬細胞功能受到抑制，當腹膜發(fā)生感染時透析患者腹腔巨噬細胞功能指標包括吞噬指數、白細胞介素1（IL-1）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平顯著降低，如果改用更符合生理條件的透析液則可以使腹腔巨噬細胞功能得到明顯增強，從而增強腹膜對感染的抵抗能力，減少腹膜炎的發(fā)生H

H[7]。最近，腹膜血管在腹膜功能衰竭中的作用也得到重視，充足的血流除了能有效增強腹膜的抵抗力減少腹膜炎的發(fā)生外[8]，也是維持長期腹膜透析患者腹膜轉運功能的重要因素。腹膜血管血流量減少時腹膜溶質轉運和腹膜超濾率均顯著下降[9]，研究顯示長期腹膜透析患者腹膜血管內皮細胞依賴的血管舒張因子顯著減少，從而影響腹膜透析的效能，而如在腹膜透析液中添加擴血管物質硝普納則能有效提高腹膜透析患者的透析效果。基于上述研究結果，近年來臨床醫(yī)師一直致力于兩方面的研究。一是研究更符合生理條件以及不影響腹膜免疫功能的全新的腹膜透析液。雖然已有諸如含多聚糖、含氨基酸、含碳酸氫根等多種透析液的體外實驗的報道，但事實上所有這些透析液并不能完全替代葡萄糖作為滲透性物質的作用，其臨床應用前景尚不明確。另一方面，腎臟病醫(yī)師通過在現(xiàn)有的透析液中添加一些物質來達到保護和改善腹膜功能的目的。有研究表明在透析液中加入雙嘧莫達能顯著降低小鼠腹透液中TGF-β的含量，而加入透明質酸可以在保護腹膜間皮細胞方面起到一定的效果。中藥黃芪是一種含有多糖、甙、黃酮和微量元素等多種成分的物質，其具有多重藥理作用[10]。黃芪能顯著抑制炎癥因子TGF-β的表達，從而延緩肝臟、腎臟等多種臟器疾病時發(fā)生纖維化的進程；能明顯減H

H緩人胚二倍體細胞自然衰老過程延長細胞壽命約H

H1/3左右[11]；能有效地調節(jié)細胞免疫功能，通過向小鼠腹腔注射黃芪可以發(fā)現(xiàn)腹腔巨噬細胞吞噬功能得到增強，從而增強腹膜抗菌能力；黃芪還具有擴血管的作用，研究顯示其能顯著抑制血管收縮物質內皮素的釋放，從而可能起到擴張血管增加血流量的作用[12]。根據黃芪的上述作用，可以推測，在腹膜透析液中加入黃芪可以起到延長腹膜間皮細胞的壽命、抑制間皮細胞TGF-β的分泌、提高腹腔巨噬細胞功能、改善局部微循環(huán)，從而阻止/延緩腹膜纖維化和防止腹膜感染的發(fā)生，達到阻止/延緩腹膜功能衰竭的目的。然而關于黃芪在腹膜透析中的應用尚無相關報道。主要參考文獻：1.ThodisE,PassadakisP,VargemezisV,OreopoulosDG.Peritonealdialysis:betterthan,equalto,orworsethanhemodialysis?Dataworthknowingbeforechoosingadialysismodality.PeritDialInt,2001;21:25-35.2.VanBiesenW,VanholderR,LameireN.TheRoleofPeritonealDialysisastheFirst-LineRenalReplacementModality.PeritDialInt,2000;20:375-383H

H3.AnS.DeVriese,SiskaMortier,NorbertH,etal.Whathappenstotheperitonealmembraneinlong-termperitonealdialysis?PeritDialInt,2001;Vol.21;:S9-284．DevuystO,TopleyN,WilliamsJD.Morphologicalandfunctionalchangesinthedialysedperitonealcavity:impactofmorebiocompatiblesolutions.NephrolDialTransplant,2002;17(3):12-55.BlobeGC,SchiemannWP,LodishHF.Theroleoftransforeinggrowthfactorbetainhumandisease.NENGLJMed,2000;342:1350-86．LinCY,ChenWP,YangLY,etal.Persistenttransforminggrowthfactor-betal1expressionmayptedictperitonealfibrosisinCAPDpatientswithfrequentperitonitisocurrence.AmJNephrol,1998;18:513-97.JonesS,HolmesCJ,MackenzieRK,etal.Continuousdialysiswithbicarbonate/lactate-bufferedperitonealdialysisfluidsinalong-termimprovementinexvivoperitonealmacrophagefunction.JASocNephrol,2002;13:S97-1038．ParkMS.FactorsincreasingsevernityofperitonitisinH

Hlong-termperitonealdialysispatients.AdvRenReplaceTher，1998；5：185-93H

H9.RoncoC,BrendolanA,CrepaldiC,etal.Ultrafiltrationandclearencestudiesinhumanisolatedpertonealvascularloops.BloodPurif,1994;12:233-4210.耿長山。黃芪的免疫藥理研究進展。中西醫(yī)結合雜志，1986；6：62-6411．孟慶云。中國中醫(yī)藥發(fā)展50年。P28012．伍敦裕，林海玲。黃芪注射液治療慢性腎功能不全患者血漿內皮素變化及其意義。實用醫(yī)學雜志，1998；14：6112、研究目的與意義：研究目的：通過體外人腹膜間皮細胞培養(yǎng)觀察中藥黃芪在抑制由高糖引起的TGF-β過度表達中的作用，通過動物實驗從組織病理學角度觀察黃芪對腹膜間皮細胞完整性的維護和腹膜纖維化的抑制以及巨噬細胞功能調節(jié)等方面的作用，通過臨床觀察了解黃芪對腹膜轉運功能和免疫功能的影響，從不同層面了解黃芪在阻止/延緩腹膜功能衰竭中的作用及其機制，為臨床上改善長期腹膜透析患者透析療效提供一種新的治療方法。H

H研究意義：隨著臨床腹膜透析的廣泛應用以及腹膜透析患者壽命的延長，臨床上因長期腹膜透析導致腹膜功能衰竭進而透析失敗的患者越來越多。中藥黃芪在我國分布廣泛且有2000多年的應用歷史。目前臨床上已有黃芪注射液制劑，并且由于黃芪可以直接注入腹腔，因此通過從不同層面了解黃芪在阻止/延緩腹膜功能衰竭中的作用及其機制的研究，在臨床上推廣使用黃芪來阻止/延緩腹膜功能衰竭從而延長ESRD患者腹膜透析時間、提高透析質量、減少透析失敗率，提高腹膜透析遠期療效具有廣泛的應用前景。3、技術查新：參見附頁。二、研究內容：研究內容：本課題采用體外細胞培養(yǎng)、動物實驗、組織病理學與臨床相結合H

H的系統(tǒng)研究方法，從多個方面研究中藥黃芪在防止/延緩腹膜功能衰竭中的作用，并從不同層面和角度解釋其作用機理。通過體外人腹膜間皮細胞培養(yǎng)了解黃芪在抑制間皮細胞H

HTGF-β表達方面的作用；通過動物實驗從組織病理學的角度直觀了解黃芪在間皮細胞保護以及在阻止/延緩腹膜纖維化中的作用；通過臨床應用，了解黃芪對腹膜轉運功能以及免疫功能方面的影響。關鍵技術和技術難點：（1）體外人腹膜間皮細胞培養(yǎng)及干預方法的建立；（2）動物腹膜透析模型及干預方法的建立；（3）TGF-β、TNF-α免疫組化檢測；（4）巨噬細胞吞噬功能的誘導及檢測；（5）標準腹膜透析腹膜轉運功能改變的研究。課題的特色和創(chuàng)新之處：（1）腹膜功能衰竭是一多因素參與的病理過程，由于西藥作用較為單一，因此在如何有效阻止/延緩腹膜功能衰竭的研究中顯得較為局限，而中藥黃芪具有多重藥理作用，在阻止/延緩腹膜功能衰竭的研究中具有較大的優(yōu)勢。（2）由于部分藥物無法進行腹腔內應用，因此以往的研究大多停留在體外試驗的水平，而黃芪可以安全地應用于腹腔內注射，本課題的研究成果能夠直接應用于臨床。H

H（3）通過從體外細胞培養(yǎng)、動物實驗、組織病理學以及臨床全面地對黃芪在阻止/延緩腹膜功能衰竭中的作用及機制進行研究，至今尚未見類似的研究報道。主要技術指標：（1）黃芪抑制間皮細胞TGF-β分泌的指標；（2）反映巨噬細胞免疫功能的TNF-α分泌水平以及吞噬功能的指標；（3）黃芪對腹膜間皮細胞的維護和抑制纖維化的指標；（3）黃芪對腹膜轉運功能的影響。三、研究方法及技術路線：研究工作總體思路：本研究首先通過人腹膜間皮細胞體外培養(yǎng)的方法在培養(yǎng)基中添加黃芪觀察其抑制由高糖引起的間皮細胞TGF-β過度表達中的作用，了解黃芪與腹膜間皮細胞TGF-β表達之間的關系。然后通過腹膜透析動物模型從組織病理學角度直觀了解黃芪對腹膜間皮細胞損傷的保護以及抑制腹膜纖維化方面的作用。最后通過在臨床上的應用了解黃芪對腹膜轉運功能以及腹膜免疫功能的影響，并探討其作用機制。從而為臨床上阻止/延緩長期腹膜透析患者因腹膜纖維化、腹膜反復感染導致H

H的腹膜功能衰竭提H

H供新的治療方法。技術路線：（1）體外細胞培養(yǎng)部分：從擇期手術小網膜切除的標本獲得人網膜組織，按照文獻方法培養(yǎng)間皮細胞，通過調整原代（1-9代）人腹膜間皮細胞培養(yǎng)液中葡萄糖濃度，在1.5%、4.5%葡萄糖條件下觀察添加與不添加黃芪對腹膜間皮細胞TGF-β表達的影響，TGF-β用免疫組化方法檢測。（2）動物模型部分：按照標準腹膜透析小鼠動物模型建立方法建立小鼠腹膜透析模型，分別采用添加和不添加黃芪的葡萄糖濃度為1.5%、4.5%的透析液進行腹膜透析，8周后取小鼠腹膜組織，10%甲醛溶液固定、脫水、石蠟包埋后HE、PAS、PASM染色，在光學顯微鏡下進行病理組織學檢查。（3）臨床部分：在臨床上選擇長期腹膜透析患者，采用自身對照的方法觀察添加黃芪前后患者腹膜轉運功能和患者透析液中度以及巨噬細胞吞噬功能的變化。TNF-α濃（4）總結資料，分析結果。研究方法：（1）組織細胞培養(yǎng)方法。H

H（2）動物實驗學研究方法。（3）組織病理學方法。（4）生化分析方法。H

H四、現(xiàn)有研究條件和工作基礎：1、現(xiàn)有工作基礎：--------臨床上有大量的長期腹膜透析的隨訪病人。研究者已成功掌握了人腹膜間皮細胞培養(yǎng)方法和腹膜透析小鼠動物模型建立方法，具備了TGF-β、TNF-α的檢測能力，以及本研究所需的組織病理學檢查條件。同時在預實驗中已經得出黃芪能有效抑制體外培養(yǎng)人腹膜間皮細胞TGF-β的表達。因此，本研究具有很強的可行性和較高的成功率。2、項目負責人近年來研究成績簡介近年發(fā)表相關論文：近年研究成果：3、研究隊伍：4、支撐條件：H

H五、計劃進度：1、總進度和年度進度：2003.01—2003.03課題準備，訂購動物與試劑。2003.04—2003.06細胞培養(yǎng)研究部分。2003.06—2003.12動物實驗部分。2003.06—2004.09臨床部分。2004.09—2004.12總結資料，分析結果，科研鑒定。2、項目完成形式：（1）項目完成可通過論文形式考察，預計可在核心期刊發(fā)表論文4-6篇。（2）細胞培養(yǎng)研究部分通過對TGF-β表達的檢測可以了解高糖在腹膜間皮細胞TGF-β表達中作用，了解黃芪在拮抗TGF-β過度表達中的作用。（3）動物實驗部分通過腹膜組織病理學檢查了解黃芪對腹膜間皮細胞損傷的保護以及抑制腹膜纖維化方面的作用，可通過病理切片形式表達。（4）臨床研究部分可通過治療前后患者TGF-β、TNF-α水平以及巨噬細胞吞噬功能了解腹膜功能的改變，用差異性來表示。H

H（5）通過成果考核。（6）成果可達到國際先進水平。六、項目研究預期成果及效益：預期達到的主要技術指標：（1）黃芪有效抑制體外培養(yǎng)人腹膜間皮細胞的TGF-β的分泌。（2）應用黃芪后在腹膜透析動物模型腹膜組織病理檢查中發(fā)現(xiàn)黃芪能維護腹膜間皮細胞的完整性和抑制腹膜纖維化的發(fā)生。（3）黃芪能改善腹膜透析病人的腹膜轉運功能和增強巨噬細胞的免疫H

H功能。（4）該研究成果預期達到國際領先水平，為臨床上阻止/延緩腹膜功能衰竭提供新的治療方法。經濟效益和社會效益：H

H通過本課題的系列研究，預期可以明確黃芪有效阻止/延緩長期腹膜透析病人腹膜功能衰竭的進程，從而延長腹膜透析時間、提高腹膜透析質量。從經濟效益來講，腹膜透析是一種價格低廉的腎臟替代療法，長期的腹膜透析必將大大減輕社會及其個人的經濟負擔。從社會效益來講，腹膜透析具有較高的生活質量，可以使ESRD病人重返社會并參加力所能及的工作，產生積極的社會效應。并且，通過此療法的成功也可以提升中藥治療在國際上的影響。七、承擔項目單位及分工八、經費概算及來源：經費單價金額主要依據科目名稱數量（萬元）（萬元）H

H預文獻檢索算業(yè)務費論文發(fā)表3．0總額及分類科研鑒定0．1092/1200胰蛋白水解酶小牛血清細胞培養(yǎng)0．2200μlμl實驗材料0．03/1001000細胞培養(yǎng)0．30mlmlH

HRMPI1640培0．009/502000細胞培養(yǎng)0．04細胞培養(yǎng)0．14細胞培養(yǎng)0．50細胞培養(yǎng)0．50細胞培養(yǎng)0．40細胞培養(yǎng)0．70生化檢測0．50生化檢測0．40免疫誘導0．25養(yǎng)基0mlmlHAM-12培養(yǎng)0．014/505000基0mlml抗細胞角蛋白0．242/100200抗體μlμl抗波形蛋白抗0．242/100200μlμl抗Ⅷ因子抗原0．166/100200體抗體μl0．35/100200μlμlμl抗CD45抗體TGF-β單克隆抗體0．25/96次╳2TNF-α單克隆0．185/96╳2抗體次0．126/100200μgμg細菌脂多糖黃芪注射液腹膜透析液其他試劑1．503．001．001．50病理檢查動物實驗小鼠動物實驗1．002．00其他臨床標本收集總計：17萬元，其中自籌：萬元，申請撥款17萬元H

H九、研究人員：姓名單位性出生別年月專業(yè)技術職務專業(yè)承擔工作簽章項目主要負責人參加項目研究人員H

HH

H十、承擔單位審查及承諾意見、蓋章第一承擔單位（法人簽字）第二承擔單位（法人簽字）H

H蓋章月蓋章月年日年日十一、協(xié)作單位及審查承諾意見、蓋章H

H（法人簽字）蓋章年月日十二、項目主管部門審查承諾意見、蓋章H

H蓋章年月日H

H登記序號：項目編號：H

H中醫(yī)藥、中西醫(yī)結合科研項目課題設計書課題名稱：痛痹顆粒對骨關節(jié)炎細胞凋亡和增殖的機理研究H

H申報單位：課題負責人：計劃年限：郵政編碼：30306江蘇省中醫(yī)院朱萱萱210029聯(lián)系電話：86617141—申報日期：江蘇省中醫(yī)藥局制填寫提綱一、立項依據：與選題直接相關的國內外現(xiàn)狀、水平和發(fā)展趨勢；選題的理論和實踐依據；研究目的、意義；本研究達到的科學技術水平，預期社會經濟效益和應用推廣前景。二、科研假說或技術構思，主要研究內容、關鍵技術、目標（達到的主要技術指標或技術經濟指標），技術特征及創(chuàng)新之處，開發(fā)項目應說明開發(fā)規(guī)模。三、研究試驗方法及技術路（線工藝路）線。四、現(xiàn)有工作條件和基礎：開展本項研究的技術優(yōu)勢，現(xiàn)有的主要儀器設備及應用合格實驗動物的基本條件等；已有工作基礎，預試驗情況。H

H五、計劃進度：根據總的研究期限、年度計劃進度，分別列出具體的目標和進度的考核指標。六、參加（協(xié)作）單位意見及具體分工（附協(xié)議書）。七、經費概算（包括其他部門的撥款、貸款、自籌記憶取得的自主）和核算依據，以及分年度使用計劃。填寫說明一、內容填寫自備附頁，用紙大小和封頁一致，字跡清楚，裝訂整齊后按申報要求上報。二、填寫提綱所列內容，要全面詳細、如實填寫。三、封面上“登記序號”“項目編號”請勿填寫。1、立項依據1.1研究目的、意義H

H骨關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）又稱退行性關節(jié)病，以關節(jié)軟骨發(fā)生彌漫性龜裂、纖維化和脫失及因骨組織增生性變化為特征的一組臨床征候群，是多見于中年以后的慢性進行性關節(jié)疾患。該病發(fā)病率隨年齡增長而升高，據調查，在美國目前2億多人口中，就有骨關節(jié)炎4500萬，發(fā)病率占總人口的20%，在老年人中所占比例更高，50歲以上人群中，OA的患病率僅次于心血管疾病，位居第二位。在我國，根據流行病學調查顯示，55—64歲的人群中發(fā)病率達40%，而65歲以上人群的患病率達60%~90%。隨著計劃生育政策的長久實施及經濟發(fā)展，我國已進入老齡化社會，OA的發(fā)病率還將越來越高，這不僅嚴重危害人民的生活、健康，對社會也將造成很大負擔。同時世界其他國家也面臨著同樣的問題，因而OA引起了國際、國內醫(yī)學界的相當重視。近年來對OA的研究頗多，在發(fā)病機制、檢測手段以及治療方法上均取得較大進步，但總的來說還缺乏令人滿意的突破性進展。西藥治療OA的主要手段是非甾體藥，但存在副作用大、作用單一及有較多禁忌癥等缺點。雖然中藥治療OA也取得了一些經驗，但對其具體的作用機制有深入研究的卻很少，因此在中醫(yī)理論的指導下，運用現(xiàn)代科學技術，對療效確切的中藥復方進行深入的機理研究，使中藥治療OA的療效在國際先進行列中占一席之地，是擺在我們面前非常重要的課題。H

H1.2國內外現(xiàn)狀水平和發(fā)展趨勢近十年來，國內外對OA進行了較深入地研究，大致歸納如下：1.2.1流行病學研究已廣泛開展在近100種不同類型的關節(jié)疾病中，OA是影響人類健康最常見的關節(jié)疾患之一，沒有明顯的種族和地域差異，本病的患病率隨年齡增加而增高，故隨著人類平均壽命的延長，患病率也有增高的趨勢。Felson等報道70歲以下人群膝OA患病率為7%（男6.4%，女11.4%），80歲以上為11.2%（男5.4%，女15.8%）；而放射學膝OA70歲以上為27.4%（男30.4%，女25.1%），80歲以上為43.7%。Butter等報道，44歲以下、45—59歲、60歲以上人群中，放射血OA患病率各為6.2%、21.6%和42.0%。國內陳順樂等隊13541名鋼鐵工人的調查結果顯示，癥狀性OA患病率2.2%；無癥狀性OA患病率53%，其中30—39、40—49、50—59歲患病率各為11%、27%和62%。學醫(yī)院統(tǒng)計551例，結果40歲以下、40—49、50—59和60歲以上各占12.2%、17.4%、26.1%和44.3%。另外不同關節(jié)OA易感性不同。美國在衛(wèi)生統(tǒng)計中心調查結果，OA患病率以手最高，以下依次為足、膝、髖。國內陳順樂等調查結果OA是頸椎最多，以下依次為腰椎、膝、手和腕。本病性別差異在脊柱差別不大，但手、膝、髖OA均以女性較多，且女性骨關節(jié)炎的遺傳易感性較男性高。在H

HFramingham的研究中，F(xiàn)elaon等發(fā)現(xiàn)女性體重減少11磅，骨關節(jié)炎形成的風險相應減少50%。Saase等調查結果，膝OA患病率男、女峰值分別為24.7%和54.6%。根據1994年統(tǒng)計，在美國，骨關節(jié)炎的消耗為155億美元，約為類風濕關節(jié)炎的3倍，其中一半以上消耗緣于工作喪失。在我國雖未作全國大范圍的普查，但隨著老齡化社會進程的不斷加快，OA的發(fā)病率會越來越高，這必將給家庭、社會帶來沉重負擔。1.2.2病因、發(fā)病機制有了巨大突破目前基礎研究認為軟骨的損傷與退變是OA的根本，隨著分子生物學免疫學的發(fā)展，近年來眾多學者對OA關節(jié)軟骨退行性改變的原因從不同角度進行了大量研究，其發(fā)病機制仍未完全明了，又提出了許多學說，如軟骨下骨內高壓學說：由于骨血液動力學的改變，在骨髓腔容積不變的前提下增加內容物引起壓力增高，即表現(xiàn)為骨內壓力增高。骨內高壓持續(xù)增高存在下關節(jié)滑液pH值下降，成分改變，干擾并破壞了軟骨細胞的正常代謝導致細胞變性壞死，膠原纖維解聚，蛋白多糖分解，軟骨下骨破壞、修復，最終產生骨性關節(jié)炎。自由基學說：認為自由基對軟骨細胞DNA和PG的合成具有抑制作用。自由基作用軟骨細胞后，引發(fā)膜脂質過氧化，使脂質過氧化代謝產物丙二醛增多，丙二醛可與DNA發(fā)生交聯(lián)，自由基也可直接攻擊軟骨細胞H

HDNA即合成DNA所需的酶，使DNA鏈斷裂、堿基損傷從而影響了DNA的合成，也造成前列腺（PG）合成障礙。骨關節(jié)炎時，滑膜、滑液、血管翳內常有中性白細胞、巨嗜細胞浸潤，其表面受免疫復合物、補體等作用能釋放大量O2-和H2O2；細胞因子學說：細胞因子對骨關節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展起了重要作用，如白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子（TNF）等在OA中水平明顯增高。IL-1具有刺激軟骨細胞分泌一氧化氮、前列腺E和IL-6的作用，引起滑膜炎癥和疼痛，同時IL-1也是軟骨基質降解的主要驅動因子；軟骨酶降解學說：OA軟骨細胞的基質降解酶類的合成與分泌率明顯增加，并與關節(jié)炎的重嚴程度密切相關。參與降解基質大分子的降解酶類可以增加達到幾倍。酸性和中性蛋白酶可以降解蛋白多糖的核心蛋白?；|金屬蛋白酶，尤其是基質溶素和膠原酶，參與關節(jié)軟骨的降解過程，這些酶類可以降解細胞外基質的所有成分，與循環(huán)系統(tǒng)中的纖維蛋白溶酶和局部合成的纖溶酶原一起，快速降解軟骨。在滑膜細胞和軟骨細胞產生的IL-1和TNF的作用下，軟骨細胞以酶原的形式分泌大量的基質金屬蛋白酶，而對金屬蛋白酶組織抑制劑無影響，使二者失衡從而增加對軟骨主要成分Ⅱ型膠原和蛋白聚糖合成的抑制作用，使軟骨進行性破壞；一氧化氮學說：NO是一種細胞間信使分子，可介導許多生物學現(xiàn)象。NOS可催化重要炎性介質NO的產生，H

HOA患者血清、滑液中NO含量明顯高于正常。NO可通過抑制軟骨細胞增殖，促進軟骨細胞凋亡，改變蛋白多糖和膠原蛋白的合成與分泌功能，同時使軟骨細胞分泌透明質酸減少，滑膜粘蛋白解聚，抑制軟骨細胞合成軟骨基質，促進軟骨細胞糖酵解，使軟骨破壞。細胞凋亡學說：細胞凋亡是細胞死亡的形式之一，許多正常組織均可發(fā)現(xiàn)凋亡，但凋亡亢進與不足則會引起相關疾病，在骨關節(jié)炎患者軟骨中軟骨細胞的凋亡有異常表現(xiàn)，且凋亡細胞數目與骨關節(jié)炎嚴重程度明顯相關。凋亡小體存在于軟骨細胞小孔或間隙內，其產生的焦磷酸鹽能從溶液中沉積鈣，有NTPPH（nucleosidtriphosphatepyrophosphohydrolase）和堿性磷酸酶作用,造成余下軟骨細胞修復過程失敗，而逐漸發(fā)展成關節(jié)軟骨的完全丟失。OA軟骨細胞凋亡主要通過兩種相互獨立的途徑完成，一種是同滑膜炎癥無關的途徑,由NO介導;另一種是同滑膜炎癥相關的途徑,由Fas介導。典型的OA不存在明顯的炎癥反應,此時軟骨細胞凋亡以NO途徑為主;當產生炎癥反應時,則通過Ｆas途徑加劇軟骨細胞凋亡和關節(jié)破壞。NO通過兩種方式造成組織及細胞損傷。一是高濃度的NO能抑制多種與線粒體呼吸傳遞系統(tǒng)及檸檬酸循環(huán)有關的酶,從而抑制線粒體呼吸,造成組織損傷;二是NO與超氧化陰離子Ｏ2-反應,生成氧化亞硝基陰離子ONOO-,在酸性條件下(如病理條件)迅速分解為OH-和NO2自由基,這兩種自由基具有很強的H

H細胞毒性H

H,可造成組織細胞損傷。在OA患者中,受損區(qū)軟骨細胞的凋亡比例明顯高于未受損區(qū)。Fas表達的結果與其相符,OA受損區(qū)的Fas表達遠高于未受損區(qū),提示Fas表達可誘導軟骨細胞凋亡。除NO途徑和Fas途徑外,還有一些因素可導致軟骨細胞凋亡、關節(jié)破壞,如IL-1、IL-8、TNF-α、PGE2、AggrecanG1區(qū)等。1.2.3治療方面有了不少新方法目前中西醫(yī)治療OA的藥物較多，西藥治療OA主要有三大類，第一類為快作用藥，即非甾體藥，特點是發(fā)揮作用快，但副作用較大，對胃腸、肝腎、血小板均有較大影響，OA多為老年人，長期服用此類藥尤其不能耐受，且部分藥物價格不菲，而且于由過分的鎮(zhèn)痛，導致病人失去警惕過分運動，以致出現(xiàn)“消炎痛髖”，從長期療效來看反而不佳，最新觀點認為乙酰氨基酚應作為治療OA的首選藥，但尚有一定爭議，且同樣存在上述副作用；第二類為慢作用藥，發(fā)揮作用慢，療效不確切，價格昂貴，臨床上尚未廣泛運用；第三類為軟骨保護劑，尚未問世。關節(jié)清理術、膝關節(jié)置換術，適應癥較少，費用高，創(chuàng)傷大，病人難以接受。中哦藥治療OA的研究取得了可喜的進步，但中藥治療仍存在較多共性的問題：①多屬臨床經驗，無對照組，特別是西藥對照組觀察，處方不固定。②缺乏用客觀的最新的國際公認的、量化的臨床觀察指標及療效判斷標準為手段來尋找治療H

HOA的中藥。③未針對OA發(fā)病機制進行臨床及動物試驗從生化、免疫、病理、細胞分子水平來探討中藥的藥物作用機理。④缺乏高效的、作用綜合、副作用小的新藥。中醫(yī)認為OA屬痹癥中的痹、痛痹、骨痹，認為其病因與年老體衰、長期勞損、外感風寒濕邪有關，明確指出肝腎虧虛、氣血不足、筋骨失養(yǎng)為OA的發(fā)病基礎，而寒濕、痰瘀為病理因素及病理產物。周尊謙等人在傳統(tǒng)中醫(yī)理論基礎上，闡述了膝OA—骨內高壓—血瘀證—氧自由基之間的密切關系；了膝OA與血瘀證之間的內在系聯(lián)，旨在為運用活血化淤藥治療OA提供理論依據。治療方面從古到今絕大部分醫(yī)家皆針對其病因病機采用益肝腎、強筋骨、補氣血治其本；散寒通絡、化痰勝濕治其標。獨活寄生湯是用于治療風寒濕痹、關節(jié)疼痛和腦血管后遺癥的傳統(tǒng)固防，具有補肝腎、活血通絡之功，臨床常見本方加減治療OA，療效比較肯定。朱健兒以本方加味治療262例，總有效率94.7%。單文龍等用本方加減治療骨關節(jié)炎24例，有效率為87.5%。陸智報道用本方加減治療104例，總有效率91.3%。1.2.4實驗研究方面有了較大的進展隨著對OA發(fā)病機理的不斷深入認識，對OA的實驗研究方面也開始了向多層次多角度的方向發(fā)展。動物實驗不再只局限于微循環(huán)和一般抗炎、鎮(zhèn)痛試驗，現(xiàn)已使用針對OA的動物實驗，并采用相關的H

H指標進行檢測。目前實驗研究內容主要有以下幾個方面，研究最多的是H

HOA的血液流變學、氧自由基及一氧化氮含量等，這些試驗一般均可通過建立骨關節(jié)炎的模型來完成，也可通過使用其它相似的模型檢測相關指標來進行，如可建立急性血淤模型來檢查血液流變學指標，使用老齡動物通過檢測體內SOD及MDA含量推斷藥物的抗氧自由基的能力等。在NO對OA影響的實驗中，一般采用硝酸還原酶法來測定NO含量，運用PT-PCR技術測定NOS基因表達。IL-1、IL-6、TNF等細胞因子、軟骨降解酶尤其是基質金屬蛋白酶、誘導關節(jié)滑膜炎癥的物質如纖溶酶原/纖溶酶原激活物和前列腺素PGE2、軟骨細胞的細胞凋亡及增殖情況、性激素水平等也越來越多地被作為檢測指標使用到實驗研究中來。1.3選題的理論和實踐依據祖國醫(yī)學并無骨關節(jié)炎的病名，從歷代文獻來看本病應歸屬于“骨痹”、“痛痹”范疇。我們認為OA病人除了肝腎虧虛，寒濕痹阻外，一般OA病人體重超重較多，也即為痰濕偏盛之體，另外脾虛生濕及寒濕痹阻日久濕聚成痰，痰淤交阻是引起膝關節(jié)腫脹畸形、活動受限的重要因素，所謂頑癥怪病皆質之于痰淤?；诂F(xiàn)代醫(yī)學對OA發(fā)病機理的深入研究，我們在補益肝腎、活血通絡基礎上，結合中藥對緩解軟骨降解，增加軟骨細胞功能，抑制滑膜增生及炎癥的研究成果，于H

H1995年即對《備急千金要方》中的獨活寄生湯進行化裁，重用活血化淤，加用化痰清熱之品，總結制定出了高效、藥源廣泛、安全可行的痛痹顆粒，并于1999年采用痛痹顆粒的組方治療膝OA，方中以獨活為君藥，以祛下焦與筋骨間風寒濕邪；威靈仙舒筋通絡止痹痛；淫羊藿、懷牛膝補肝腎，強筋骨，通經絡，其中懷牛膝為引經藥；當歸養(yǎng)血柔肝、舒筋活血；川芎則通達四肢關節(jié)，為血中氣藥；虎杖活血清熱解毒，同時防諸藥辛燥太過。諸藥合用共起補肝腎、祛風濕、化瘀痰之功，冀能消炎止痛，保護軟骨。通過36例的臨床研究、觀察，結果表明本方療效顯著且副作用小。因此有必要對痛痹顆粒治療骨性關節(jié)炎的作用機制尤其是該方對軟骨細胞的細胞凋亡與增殖機理做進一步的研究，冀能證實痛痹顆粒的臨床療效，明確其作用機制，并初步探討本病發(fā)病的可能機理，為新藥問世提供客觀的依據，所以進行設計并立題。1.4本研究達到的科學技術水平，預期社會效益和應用推廣前景1.4.1繼承和發(fā)揚祖國醫(yī)學，保持中醫(yī)特色，以臨床療效為前提，以實驗研究為基礎，制造規(guī)范化大鼠的膝OA模型，從發(fā)病機理探討本藥的作用機制。本實驗采用可靠地國際公認的方法復制動物模型，并采用最新的檢測指標IL-1、TNF、SOD、MDA、NO等，總之本研究基于現(xiàn)代醫(yī)學對OA發(fā)病機制的最新研究成果，從生化、免疫等多H

H個角度多個層次，系統(tǒng)觀察并進行歸納總結，確保本課題不但可行而且先進，冀能填補省內外運用中藥治療H

HOA的空白，并希望以此為基礎，進一步從細胞水平（包括本藥對軟骨細胞及細胞凋亡與增殖的影響）研究中藥對OA的長久作用及影響，從而達到擠身國際先進水平的目的，讓中藥真正走向世界。1.4.2目前，中藥治療OA的方法頗多，但大多以臨床療效研究為主，大樣本、規(guī)范化的研究很少，中醫(yī)中藥治療機理的研究，雖有涉及，但大多分散且存在一定的重復性，理想的治療藥物尚未問世，具有公認療效的小兒遷延性腹瀉臨床治療方案尚未確立，其療效評價體系尚需研究確定，尤其是缺少中醫(yī)藥治療學整體研究思路與方法，使中藥復方治療OA的療效機理尚未能全面揭示，影響了該領域研究的深入。而痛痹顆粒是在中醫(yī)理論指導下選用《千金要方》中獨活寄生湯進行加減所得，并采用可靠的實驗模型及最新的國際公認的相關指標進行實驗研究，觀察其對OA的確切療效及作用機理，這必將對OA的中醫(yī)理論產生較大影響，同時對臨床治療也起到更好的指導作用，從而產生較好的社會經濟效益。隨著改革開放的形勢發(fā)展，以及中國加入WTO與國際接軌的進程的不斷完善，祖國醫(yī)學國際地位不斷的提高，我們將從祖國醫(yī)學寶庫中發(fā)掘出的治療OA的高效藥物與現(xiàn)代新技術、新方法進行研究總結，從而為人類造福，為振興中醫(yī)事業(yè)做出應有的貢獻。H

H2.科研假說或技術構想：主要內容、技術關鍵目的，技術特征及創(chuàng)新之處，開發(fā)項目應說明開發(fā)規(guī)模。2.1主要內容2.1.1探討OA的病因病機，提出新見解，發(fā)展中醫(yī)理論。2.1.2運用現(xiàn)代科學技術，開展實驗研究，從分子生物學、免疫學、生理生化學等多方面來探討“痛痹顆?！敝委熛A的療效機制及藥理毒理作用。2.2主要技術關鍵2.2.1膝OA模型的復制目前所使用的OA動物模型一般可分為兩大類，其一是誘發(fā)模型，即通過各種操作方法如制動、手術、關節(jié)內注藥、關節(jié)內植入軟骨碎片或微粒等誘導OA產生；另一類為自發(fā)模型，即不用任何外界干預，動物自發(fā)OA，如C57黑鼠等。在選擇動物模型時一般應考慮動物的種屬（包括其生活習性、關節(jié)結構、組織學及病理學特征）、不同方法的造模機制和OA模型的特點，并應參照研究目的加以選擇。在誘發(fā)模型中，常用的方法是手術造成關節(jié)的應力改變及關節(jié)腔內注入木瓜蛋白酶，這兩種方法都能復制出較成功較高的OA模型，且操作較為簡單。具體的造模機制在于低應力可以造成軟骨厚度減少，H

HSO染色變淡，水分增加，蛋白聚糖聚集度損傷等變化，木瓜蛋白酶作為一種蛋白水解酶會引起關節(jié)軟骨的退行性改變。在具體的造模過程中我們選用以上兩種方法來分別復制動物模型。用于動物模型的動物一般有狗、兔、鼠等，我們選用大鼠做OA模型，因為該模型關節(jié)軟骨退變的組織學特征與人類相似，且動物來源較廣泛，且經濟。2.2.2關節(jié)軟骨細胞的獲取和培養(yǎng)基于來源廣泛，操作可行的原則，目前用于體外培養(yǎng)的軟骨細胞一般均為兔關節(jié)軟骨細胞原代培養(yǎng)所得。軟骨需在嚴格無菌的條件下分離，經過一系列的漂洗、消化等工作后獲取軟骨細胞。目前還沒有專門用于軟骨細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液，國外采用的培養(yǎng)液種類繁多，有199、1640、F12、改良Eagle等，國內的有199、1640、DMEM（高糖）等，其中加入胎牛血清（占15%），一般以使用DMEM培養(yǎng)液居多。在培養(yǎng)液中還含有一些輔助添加劑，包括25mmol/LHepes、1mmol/L丙酮酸鈉、2mmol/L谷氨酰胺、50umol/L二硫基乙醇以及10萬單位/L的青霉素和10萬單位/L的鏈霉素，PH7.4。培養(yǎng)過程中一般使用5%CO237℃的恒溫培養(yǎng)箱。2.2.3采用的檢測手段及指標在病理組織形態(tài)學的檢查中，一般采用以下幾個觀察指標：①大體肉眼觀察軟骨及滑膜表面情況；H

H②HE染色觀察有關的形態(tài)變化；③Masson三色染色觀察膠原的變化；④Sanfranin-O即沙紅O染色用于組織學評分，評分方法按Mankin法；⑤電鏡下觀察軟骨細胞內結構形態(tài)變化及其周圍膠原纖維的變化。在細胞培養(yǎng)的相關檢測中，我們采用MTT法檢測軟骨細胞的增殖能力，用全自動生化分析儀對檢測總蛋白含量，使用細胞流式儀進行細胞凋亡的測定，對iNOS、NO含量的測定則使用分型NOS試劑盒和NO試劑盒。2.3目標（達到的主要技術指標或技術經濟指標）、技術特征及創(chuàng)新之處。現(xiàn)代科學技術與中醫(yī)藥理論相結合，深入研究中醫(yī)藥治療OA的作用機制，為臨床應用提供更加科學有利的客觀依據，發(fā)揮中醫(yī)藥治療OA的特色和優(yōu)勢，為臨床常見、嚴重影響人類健康的OA研究出有效、安全、便于推廣應用的中醫(yī)藥治療方法，使能迅速緩解癥狀，大大減輕病人痛苦，降低膝骨關節(jié)炎的致殘率和復發(fā)率，且副作用小的簡、便、廉、驗的中藥制劑問世。治療膝OA的新藥生產及對其在治療中所起作用機制的深入探討，既符合國情又能夠走向世界，產生較大的社會和經濟效益，這必然形成高新技術產業(yè)進入高新領域，對促進科技進步，發(fā)展中醫(yī)藥，有著積極的作用，同時這也是中藥現(xiàn)代化研究的發(fā)展方向和新的探索。H

H3.實驗研究方法及技術路線。3.1對實驗性大鼠骨性關節(jié)炎的防治作用OA模型的制備：（1）取SD雄性大鼠50只，體重200～220g，固定，常規(guī)備皮消毒，沿髕韌帶內側緣切口，切斷雙后肢內側副韌帶及膝前內側筋膜擴張部，并在斷端處修剪去除約2mm，造成雙后肢膝外翻畸形。術后第二天放造模大鼠于拖箱內每天趕其行走30m。（2）取SD雄性大鼠50只，體重200～220g，4%木瓜蛋白酶溶液與0.03mol/L半胱氨酸溶液1：1混置0.5小時后，分別在第1、3、5、7天于實驗大鼠膝關節(jié)腔內注入混合液20ul。方法：將造模后的大鼠隨機分為模型組、陽性對照組（維骨力組）、治療組，另設正常對照組，分別灌胃給藥或蒸餾水，連續(xù)7周。七周后將動物麻醉后，立即將大鼠以仰臥位固定，頸總取血，接入試管中，2000rmp15min離心獲取含藥血清；切開關節(jié)囊，進行大體觀察后，然后以銳利刀片切取膝關節(jié)前正中部分的滑膜組織，作HE染色，電鏡下觀察。再用銳利刀片切取股骨內倮軟骨使其呈2mm×1mm全層軟骨標本，2.5%戊二醛溶液固定，電鏡下觀察。所余之股骨內倮連同軟骨下骨一并切下，10%福爾馬林溶液固定24小時以上，分別作HE、沙紅-O及Masson三色染色后光鏡檢查，取樣后即可將動物處死。H

H觀察指標：①大體肉眼觀察軟骨及滑膜表面情況；②HE染色觀察有關的形態(tài)變化；③Masson三色染色觀察膠原的變化；④Sanfranin-O即沙紅O染色用于組織學評分，評分方法按Mankin法（附評分等級表如下）；⑤電鏡下觀察軟骨細胞內結構形態(tài)變化及其周圍膠原纖維的變化。評分等級Ⅰ.結構正0常表面面面結結結構構構微中嚴出出出層層層小等不不不規(guī)規(guī)規(guī)則則則隙隙隙失失失壞1表2表重3過4渡射化層層層現(xiàn)現(xiàn)現(xiàn)裂裂裂輻5鈣6過7渡射化消消消輻8鈣9結構完全破10H

HⅡ.細胞1.切線的區(qū)域正常脹失0細1胞胞腫消細22.過渡和輻射的區(qū)域正常多多多隆隆隆少少少失0少1量的的細胞胞增中2等量的細胞增大3量細的增少4量量克克中5等量的克大6的細少7量的胞減中8等量的細胞減大9量的胞細胞消減細10Ⅲ.變異標記H

H完整層糊叉0多1模2血管的交3Ⅳ.血管翳形成沒有量量量0少1中等2大33.2對體外培養(yǎng)兔膝關節(jié)軟骨細胞的影響3.2.1兔膝軟骨細胞的原代培養(yǎng)無菌條件下取兩周齡新西蘭白兔后肢關節(jié)，用刀片取關節(jié)表面軟骨，收集在含磷酸緩沖液（PBS）的無菌小培養(yǎng)皿內，反復清洗除去軟骨片表面的血液，以及可能勿帶之滑膜組織。漂洗完畢后，用無菌的眼科小剪刀在培養(yǎng)皿中將其細切至不大于1mm3。切碎后將其裝入10u試管內，按1：10量加入消化酶類進行化學解離。先用0.25%胰酶消化30min，然后去除胰酶，加入0.2%膠原酶Ⅱ消化7~8小時后，1500rpm10min離心，棄上清，加入PBS，搖勻在同上離心棄上清，在加PBS反復三次，最后一次加H

H含15%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打均勻，200目篩網過濾，放入培養(yǎng)瓶中，5%CO237℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定期換液，并觀察照相，長滿后用0.25%胰酶消化傳代。H

H3.2.2對軟骨細胞增殖反應的作用將在培養(yǎng)瓶中長滿的細胞消化，接入96孔培養(yǎng)板中，100ul/孔，