RNA分子生物學(xué)技術(shù)

RNA分子生物學(xué)技術(shù)第1頁/共118頁導(dǎo)論再談中心法則RNA世界RNA生物學(xué)功能RNA組學(xué)第2頁/共118頁再談中心法則第3頁/共118頁4中心法則與RNA1961年,發(fā)現(xiàn)DNA依賴的RNA聚合酶1968年,提出RNA是最早的信息分子1982~1983年,發(fā)現(xiàn)核酶

1986年,提出“RNAworld”1947年,RNA第一次被描述1968年,提出中心法則第4頁/共118頁中心法則與組學(xué)第5頁/共118頁基因組：一種生物擁有的所有遺傳信息的總合是一個細(xì)胞（或病毒）所承載的全部遺傳信息，它代表了一種生物所具有的全部遺傳信息。真核生物基因組是指一套完整單倍體DNA（染色體DNA）及線粒體DNA或葉綠體DNA的全部序列，既有編碼序列，也有大量存在的非編碼序列。細(xì)菌基因組包含了擬核和質(zhì)粒中的DNA序列。病毒基因組有的為DNA（DNA病毒），有的則為RNA（RNA病毒）。*基因組（genome）第6頁/共118頁基因組學(xué)：包括結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、功能基因組學(xué)和比較基因組學(xué)基因組學(xué)（genomics）是闡明整個基因組的結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及基因之間相互作用的科學(xué)。研究內(nèi)容：結(jié)構(gòu)基因組學(xué)（structuralgenomics）:

遺傳圖譜、物理圖譜、序列圖譜以及轉(zhuǎn)錄圖譜和大規(guī)模DNA測序。功能基因組學(xué)（functionalgenomics）:分析鑒定基因組功能。比較基因組學(xué)（comparativegenomics）：基因組之間比較鑒定，研究生物進(jìn)化，預(yù)測新基因。第7頁/共118頁轉(zhuǎn)錄組學(xué)：研究全部RNA的表達(dá)及功能轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）

指生命單元（通常是一種細(xì)胞）所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA——包括指導(dǎo)蛋白質(zhì)翻譯的mRNA和非編碼RNA(non-codingRNA,ncRNA)的總和。RNA功能基因組學(xué)

又稱RNA組學(xué)（RNomics）：是分析、鑒定非信使小RNA（smallnon-messengerRNA,snmRNA）在特定狀態(tài)下表達(dá)差異、功能及其與蛋白質(zhì)的相互作用。第8頁/共118頁RNA組學(xué)：研究全部非mRNA小RNA的集合人類基因組序列特點(diǎn)：2萬2.5萬個基因，與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的序列占整個基因組的2%左右，其余98%的基因組序列沒有得到注釋。RNA組學(xué)研究范疇：小分子RNA，包括

snRNA、snoRNA、scRNA、催化性小RNA（smallcatalyticRNA）、小片段干涉RNA（smallinterferingRNA，siRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）第9頁/共118頁

以細(xì)胞、組織或機(jī)體在特定時間和空間上表達(dá)的所有蛋白質(zhì)即蛋白質(zhì)組（proteome）為研究對象，分析細(xì)胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)；了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系；并在整體水平上研究蛋白質(zhì)調(diào)控的活動規(guī)律，故又稱為全景式蛋白質(zhì)表達(dá)譜（globalproteinexpressionprofile）分析。

蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）蛋白質(zhì)組：全景式蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析第10頁/共118頁蛋白質(zhì)組學(xué)的中心任務(wù)：

研究細(xì)胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)組成及其活動規(guī)律蛋白質(zhì)組學(xué)的研究內(nèi)容：一、蛋白質(zhì)組表達(dá)模式的研究，即結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)（structuralproteomics）二、蛋白質(zhì)組功能模式的研究，即功能蛋白質(zhì)組學(xué)（functionalproteomics）第11頁/共118頁蛋白質(zhì)組學(xué)的主要任務(wù)：蛋白質(zhì)鑒定：可以利用一維電泳和二維電泳并結(jié)合生物質(zhì)譜、Western印跡、蛋白質(zhì)芯片等技術(shù)，對蛋白質(zhì)進(jìn)行全面的鑒定研究。翻譯后修飾的鑒定：磷酸化、糖基化、酶原激活等過程。蛋白質(zhì)功能確定：包括蛋白質(zhì)定位研究，蛋白質(zhì)活性，蛋白質(zhì)相互作用，酶活性和確定酶底物，細(xì)胞因子的生物分析，配基-受體結(jié)合分析等。第12頁/共118頁與蛋白質(zhì)組研究相關(guān)的數(shù)據(jù)庫蛋白序列數(shù)據(jù)庫（SWISS-PROT/TrEMBL；http://www.expasy.ch）基因序列數(shù)據(jù)庫（Genbank，/EMBL，http://www.ebi.ac.uk/）蛋白模式數(shù)據(jù)庫（Prosite，http://www.expasy.ch/sprot/prosite.html）蛋白質(zhì)二維凝膠電泳數(shù)據(jù)庫、蛋白三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（PDB，/；

FSSP，http://www.embl-ebi.ac.uk）蛋白翻譯后修飾數(shù)據(jù)庫（O-GLYCBASEhttp://www.cbs.dtu.dk/databases/OGLYCBASE）第13頁/共118頁疾病基因組學(xué)：

研究疾病相關(guān)基因、揭示疾病發(fā)病機(jī)制疾病基因組學(xué)研究的兩大任務(wù)：疾病基因或疾病相關(guān)基因疾病易感性的遺傳學(xué)基礎(chǔ)第14頁/共118頁藥物基因組學(xué)：

研究遺傳變異對藥物效能和毒性的影響藥物基因組學(xué)（pharmacogenomics）是功能基因組學(xué)與分子藥理學(xué)的有機(jī)結(jié)合，它不是以發(fā)現(xiàn)人體基因組基因?yàn)橹饕康模沁\(yùn)用已知的基因組學(xué)知識改善患者的治療。以藥物效應(yīng)及安全性為目標(biāo)，研究各種基因突變與藥效及安全性的關(guān)系，是研究高效、特效藥物的重要途徑，通過它為患者或者特定人群尋找合適的藥物。使藥物治療模式：診斷定向治療→基因定向治療。第15頁/共118頁腫瘤基因組解剖工程：

闡明腫瘤相關(guān)基因

基因激活和/或失活及其復(fù)雜的相互作用是腫瘤發(fā)生的根本原因

癌癥基因組解剖計劃（CancerGenomeAnatomyProject，CGAP；又稱腫瘤cDNA工程）：擬逐步建立人類腫瘤細(xì)胞表達(dá)基因索引發(fā)展快速分析腫瘤細(xì)胞的技術(shù)獲知與腫瘤相關(guān)的基因、蛋白質(zhì)及其他生物標(biāo)記物建立腫瘤研究信息（數(shù)據(jù)與分析工具）、資源（克隆和文庫）及技術(shù)和方法學(xué)平臺第16頁/共118頁代謝組學(xué)（metabonomics）

測定一個生物/細(xì)胞中所有小分子（Mr1000）組成，描繪其動態(tài)變化規(guī)律，建立系統(tǒng)代謝圖譜，并確定這些變化與生物過程的聯(lián)系。

生命過程的表觀、生物化學(xué)的終極目標(biāo)。代謝組學(xué)：研究內(nèi)源性代謝物質(zhì)的動態(tài)變化

規(guī)律及與生物過程的聯(lián)系第17頁/共118頁代謝組學(xué)分為4個層次：①代謝物靶標(biāo)分析（metabolitetargetanalysis）②代謝譜分析（metabolicprofilinganalysis）③代謝組學(xué)（metabonomics）④代謝指紋分析（metabolicfingerprintinganalysis）代謝組學(xué)研究對象：生物體液——血樣、尿樣等完整的組織樣品、組織提取液和細(xì)胞培養(yǎng)液（一）代謝組學(xué)的任務(wù)：

分析生物/細(xì)胞代謝產(chǎn)物的全貌第18頁/共118頁

主要的分析工具①核磁共振（nuclearmagneticresonance，NMR）：

氫譜（1H-NMR）、碳譜（13C-NMR）及磷譜（31P-NMR）。②MS：

MS按質(zhì)荷比（m/z）進(jìn)行各種代謝物的定性或定量分析，可得到相應(yīng)的代謝產(chǎn)物譜。③色譜及聯(lián)用技術(shù)：

使樣品的分離、定性、定量一次完成，具有較高的靈敏度和選擇性。（二）代謝組學(xué)的主要分析工具：

核磁共振、色譜及MS第19頁/共118頁代謝組學(xué)研究側(cè)重于代謝物的組成、特性與變化規(guī)律，與生理學(xué)的聯(lián)系更加緊密。疾病→機(jī)體病理生理過程變化→代謝產(chǎn)物的改變→比較分析與正常人的代謝產(chǎn)物差異→發(fā)現(xiàn)和篩選出疾病新的生物標(biāo)記物→對相關(guān)疾病作出早期預(yù)警→發(fā)展新的有效的疾病診斷方法。藥物代謝組學(xué)的研究，可闡明藥物在不同個體體內(nèi)的代謝途徑及其規(guī)律，將為合理用藥和個體化醫(yī)療提供重要依據(jù)。（三）代謝組學(xué)：

是開展預(yù)測醫(yī)學(xué)和個體化醫(yī)學(xué)的重要手段第20頁/共118頁RNA世界

RNA是一種可以作為信使、酶和結(jié)構(gòu)組分的多功能分子。

RNA與DNA、蛋白質(zhì)，甚至RNA本身都能發(fā)生相互作用，在生命活動的各個環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要功能。大量非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)及其生物學(xué)功能多樣性被揭示。核酶的發(fā)現(xiàn)使得人們相信在生命的進(jìn)化過程中曾經(jīng)存在著一個活躍的RNA世界。

人們認(rèn)識到RNA的研究在揭示生命本質(zhì)和疾病防治方面都有著不可或缺的意義。第21頁/共118頁1982-1983年，ThomasCech和SidneyAltman等分別發(fā)現(xiàn)RNaseP的RNA亞基和嗜熱四膜蟲的前體rRNA中的居間序列(Interveningsequence．IVS)都具有酶的催化活性，它們是最早被發(fā)現(xiàn)的具有催化作用的RNA分子——核酶（ribozyme），為RNA轉(zhuǎn)錄后加工機(jī)制提供了新的認(rèn)識，并為生命起源的探討開拓了新的境界。1986年，WalterGilbert創(chuàng)造了“RNAworld”這個名詞，用于描述其提出的關(guān)于分子起源的假說：在生命進(jìn)化的早期存在一個只有RNA，沒有DNA和蛋白質(zhì)的世界；RNA既是遺傳信息載體又具有酶的催化功能，它們催化自身的合成。

第22頁/共118頁“RNA世界”目錄TheRNAWorld

(ThirdEdition,2006)RaymondF.GestelandThomasR.CechJohnF.Atkins

ColdSpringHarborLaboratoryPress第23頁/共118頁一、起源于RNA與RNA起源1.RNA的歷史、化學(xué)、地理生物學(xué)2.對RNA世界起源認(rèn)識的進(jìn)展3.原始細(xì)胞：包含遺傳聚合體的膜囊泡第24頁/共118頁二、建立功能RNA4.核糖開關(guān)與RNA世界5.自我切割核酸酶的催化策略：RNA世界的遺跡？6.I型內(nèi)含子如何起作用：RNA結(jié)構(gòu)與功能的范例研究第25頁/共118頁三、退出古老的RNA世界——合成酶與核糖體7.RNA、脂質(zhì)、膜8.氨基酰-tRNA合酶9.RNA在蛋白質(zhì)合成中的作用10.從RNA世界進(jìn)化而來的核糖體與蛋白質(zhì)翻譯第26頁/共118頁四、現(xiàn)代RNA世界中豐富的RNA角色11.核糖核蛋白世界12.不斷擴(kuò)展的小核內(nèi)核糖核蛋白世界13.剪接體結(jié)構(gòu)與功能14.RNA分子位點(diǎn)特異性修飾的范例：尿嘧啶插入、缺失

RNA編輯15.端粒酶RNA16.形狀多變的mRNA：折疊的得與失第27頁/共118頁五、RNA繼續(xù)戰(zhàn)勝DNA

17.II型內(nèi)含子：一類剪接RNA并入侵DNA的核酶

18.SINE和LINE：麻煩制造者、破壞者、先行者

19.短RNA生物學(xué)

20.細(xì)菌內(nèi)小RNA調(diào)控子的多能性

21.參與哺乳動物基因劑量調(diào)控的長鏈非編碼RNA第28頁/共118頁六、新興工具

22.RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

23.一種用于全原子RNA建模的模塊層次方法

24.功能RNA序列的自動化體外篩選與芯片應(yīng)用

25.基于單分子方法的RNA折疊、展開、動力學(xué)研究第29頁/共118頁RNA有何基本特點(diǎn)與功能？第30頁/共118頁RNA與蛋白質(zhì)共同負(fù)責(zé)基因的表達(dá)和表達(dá)過程的調(diào)控。RNA通常以單鏈的形式存在，但有復(fù)雜的局部二級結(jié)構(gòu)或三級結(jié)構(gòu)。RNA比DNA小的多。RNA的種類、大小和結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)比DNA表現(xiàn)出多樣性。RNA的基本特點(diǎn)

第31頁/共118頁RNA生物學(xué)功能構(gòu)成核糖核蛋白體小核內(nèi)核糖核蛋白世界剪接體結(jié)構(gòu)與功能RNA分子位點(diǎn)特異性修飾的范例：尿嘧啶插入、缺失RNA編輯端粒酶RNA形狀多變的mRNA：折疊的得與失第32頁/共118頁RNA的種類、分布、功能第33頁/共118頁CrystalStructureoftheRibosomeat5.5

?

ResolutionScience.2001.292:883-896.MaratM.Yusupov,1*GulnaraZh.Yusupova,1*AlbionBaucom,1KateLieberman,1ThomasN.Earnest,2J.H.

D.Cate,3HarryF.Noller1

1CenterforMolecularBiologyofRNA,SinsheimerLaboratories,UniversityofCaliforniaatSantaCruz,SantaCruz,CA95064,

USA.

2BerkeleyCenterforStructuralBiology,PhysicalBiosciencesDivision,LawrenceBerkeleyNationalLaboratory,Berkeley,CA94720,

USA.

3WhiteheadInstitute,Cambridge,MA01242,

USA.

第34頁/共118頁TheStructuralBasisofRibosomeActivityinPeptideBondSynthesis

Science.2000.289:920-930.PoulNissen,1*JeffreyHansen,1*NenadBan,1*PeterB.Moore,1,2ThomasA.Steitz1,2,3

1DepartmentofMolecularBiophysicsandBiochemistryand

2DepartmentofChemistry,YaleUniversity,and

3HowardHughesMedicalInstitute,NewHaven,CT06520-8114,USA.

*

Theseauthorscontributedequallytothiswork.第35頁/共118頁RNA組學(xué)第36頁/共118頁RNA組學(xué)研究全部非mRNA小RNA的集合人類基因組序列特點(diǎn)：2萬2.5萬個基因，與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的序列占整個基因組的2%左右，其余98%的基因組序列沒有得到注釋。RNA組學(xué)研究范疇（小分子RNA）包括：snRNA、snoRNA、scRNA、催化性小RNA（smallcatalyticRNA）、小片段干涉RNA（smallinterferingRNA，siRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）第37頁/共118頁NoncodingRNAs(ncRNAs)ineukaryotesSmallRNA(sRNA)inbacteriaSmallnuclearRNAs(snRNAs)SmallnucleolarRNAs(snoRNAs)MicroRNA(miRNA)SmalltemporalRNAs(stRNAs)SmallinterferingRNAs(siRNAs)RNAinterference(RNAi)GuideRNAs(gRNAs)tRNA/mRNA:tmRNA非編碼RNA的名稱與縮寫符號第38頁/共118頁RNA研究的進(jìn)步

與RNA技術(shù)的發(fā)展密切相關(guān)第39頁/共118頁RNA研究相關(guān)技術(shù)第40頁/共118頁RNA研究相關(guān)技術(shù)

RNA技術(shù)可以分為：RNA基礎(chǔ)研究相關(guān)的技術(shù)、RNA應(yīng)用相關(guān)的技術(shù)、RNA生物信息學(xué)技術(shù).

RNA基礎(chǔ)研究相關(guān)技術(shù)包括RNA分離純化和鑒定技術(shù)、RNA與其他生物大分子相互作用技術(shù)、RNA高級結(jié)構(gòu)的研究技術(shù)和其他相關(guān)RNA技術(shù);RNA應(yīng)用相關(guān)技術(shù)則包括用于生產(chǎn)其他產(chǎn)品的RNA技術(shù)和直接用于藥物開發(fā)的RNA技術(shù);RNA的生物信息學(xué)技術(shù)則有各種數(shù)據(jù)庫、非編碼RNA的預(yù)測、RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測和各種設(shè)計軟件.第41頁/共118頁第一節(jié)

RNA基礎(chǔ)研究相關(guān)技術(shù)第42頁/共118頁RNA基礎(chǔ)研究相關(guān)技術(shù)大致可分為四類：RNA分離純化和鑒定技術(shù)、RNA與其他生物大分子相互作用技術(shù)、RNA高級結(jié)構(gòu)的研究技術(shù)其他相關(guān)RNA技術(shù)。第43頁/共118頁RNA分離純化和鑒定技術(shù)

RNA分離純化和鑒定技術(shù)是幾乎所有RNA基礎(chǔ)研究的基點(diǎn)。（1889年，Altmann第一次分離純化出不含蛋白質(zhì)的核酸制品。

1893年，Kossel提出，酵母來源的核酸含有核糖，RNA的研究正式開始。）

現(xiàn)在各種材料的RNA提取和純化均包括三個步驟：破碎細(xì)胞釋放其內(nèi)含物、非RNA物質(zhì)的去除、RNA的濃縮。

Trizol的技術(shù)是目前應(yīng)用最廣泛和最著名的方法之一。對于稀有樣本還聯(lián)合體外轉(zhuǎn)錄發(fā)展了總RNA擴(kuò)增技術(shù)(cRNA擴(kuò)增)。第44頁/共118頁RNA可利用體外轉(zhuǎn)錄體系合成利用體外轉(zhuǎn)錄體系（invitrotranscriptionsystem）合成RNA是分子生物學(xué)常用技術(shù)。這種體外轉(zhuǎn)錄體系是現(xiàn)代發(fā)展起來的體外轉(zhuǎn)錄（invitrotranscription）技術(shù)——在含有RNA聚合酶（轉(zhuǎn)錄酶）、必要的蛋白質(zhì)因子、核苷三磷酸等條件的體外無細(xì)胞體系中，加入DNA模板，模仿體內(nèi)轉(zhuǎn)錄、生成RNA的過程。利用真核細(xì)胞核抽提物（nuclearextract）建立再造體系是當(dāng)前生物技術(shù)商家提供體外轉(zhuǎn)錄商品試劑盒（kit）的主要來源。第45頁/共118頁總RNA的分離純化

總RNA的分離純化技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)完善，目前和將來的重要發(fā)展方向是RNA的進(jìn)一步分級分離，其中小RNA的分離是研究的熱點(diǎn)。目前主要有兩種：一是利用電泳根據(jù)分子大小分離；二是利用不同濃度的有機(jī)溶劑的沉降或吸附效率不同分離。第46頁/共118頁Trizol技術(shù)

Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞，抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。

特點(diǎn)：

1.Trizol試劑含有苯酚，具有毒性和刺激性，注意操作

2.RNase污染的主要來源是操作過程中手和空氣中的浮沉，注意配帶手套，樣品盡可能蓋嚴(yán)

3.細(xì)胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全會降低最后得率，因?yàn)橐徊糠諶NA會殘留在未裂解的細(xì)胞中。細(xì)胞裂解之后要看不見顆粒狀物質(zhì)（結(jié)締組織和骨除外）。在清洗和裂解細(xì)胞時最好在低溫下操作，防止在操作過程中釋放的內(nèi)源RNase降解了RNA

4.酵母和一些細(xì)菌由于細(xì)胞壁的特殊結(jié)構(gòu)，可以加入Trizol試劑同時加入無RNase的玻璃珠并劇烈振蕩，使細(xì)胞裂解充分

5.2-8℃避光保存一年

第47頁/共118頁準(zhǔn)備工作

RNA酶（RNase）是導(dǎo)致RNA降解最主要的物質(zhì)。此酶非常穩(wěn)定，在一些極端的條件下只可暫時失活，但限制因素去除后又迅速恢復(fù)活性。常規(guī)高溫高壓滅菌方法和蛋白抑制劑不能使所有的RNase完全失活。

1.它廣泛存在于人的皮膚上，因此制備RNA時必須戴手套

2.RNase的又一污染源是取液器。根據(jù)取液器制造商的要求對取液器進(jìn)行處理。一般情況下采用以DEPC配制的乙醇擦洗取液器的內(nèi)部和外部，可基本達(dá)到要求

3.塑料制品、玻璃和金屬物品的處理

（1）塑料制品：盡量使用一次性無菌塑料制品。已標(biāo)明RNase-free的塑料制品，如沒有開封使用過，通常不必再處理

第48頁/共118頁

處理的步驟如下：

在玻璃燒杯中注入去離子水，加入DEPC使其終濃度為0.05%~0.1%（DEPC-H2O）。（DEPC二乙基焦碳酸酯為活性很強(qiáng)的劇毒物，須在通風(fēng)櫥中小心使用）

將待處理的塑料制品放入一個可以高溫滅菌的容器中，注入DEPC-H2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通風(fēng)柜中37℃或室溫下處理過夜

將DEPC-H2O小心倒入廢液瓶中，將裝有DEPC-H2O處理過的塑料制品的容器以鋁箔封口，高溫高壓蒸汽滅菌至少30分鐘。

滅菌塑料制品烘烤干燥，置潔凈處備用

第49頁/共118頁（2）玻璃和金屬物品250℃烘烤3小時以上

DEPC(二乙基焦碳酸酯)

DEPC是RNA酶的化學(xué)修飾劑,它和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)反應(yīng)而抑制酶活性

DEPC與氨水溶液混合會產(chǎn)生致癌物,因而使用時需小心

試驗(yàn)所用試劑也可用DEPC處理,加入DEPC至0.1%濃度,然后劇烈振蕩10分鐘,再煮沸15分鐘或高壓滅菌以消除殘存的DEPC,否則DEPC也能和腺嘌呤作用而破壞mRNA活性

但DEPC能與胺和巰基反應(yīng),因而含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理

第50頁/共118頁實(shí)驗(yàn)步驟

1.取50~100mg的組織,加入1mlTrizol試劑，用勻漿器打勻(Trizol先放于冰上)

2.將勻漿室溫放置5min

3.加入200μl氯仿,劇烈震蕩混勻30s，冰上靜置3min

4.12000rpm，4℃離心15min

5.將上清液小心轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中（取400μl），加入等量體積的異丙醇，上下顛倒幾次混勻，室溫下放置15min。（此步中注意：不要吸取任何中間層物質(zhì)，寧缺勿爛。）

6.12000rpm，4℃離心15min

7.小心移去上清液，防止RNA沉淀丟失

第51頁/共118頁

8.用70%乙醇（DEPC處理的水配制）洗滌1次，加入700μl乙醇，將RNA沉淀彈起，漂洗。（此時RNA是不溶解的）

9.8000rpm，室溫離心10min

10.盡可能徹底地吸走上清，防止RNA沉淀丟失

11.真空離心干燥3~5分鐘，或放在室溫下使乙醇完全揮發(fā)掉

12.沉淀用30μlDEPC-H2O溶解。如發(fā)現(xiàn)沉淀難溶，68℃處理10min

第52頁/共118頁

13.RNA檢測

(1)測定樣品在260nm和280nm的吸光值按

1OD=40μg/mlRNA計算RNA的產(chǎn)量

OD260/OD280在1.8-2.0

(2)進(jìn)行甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳,確定RNA的完整性和污染情況第53頁/共118頁RNA鑒定

RNA鑒定技術(shù)，主要是分析RNA的量、大小、豐度、定位、剪切、修飾和序列等信息

純化的RNA可通過光譜分析和定量分析特定RNA大小最常用的技術(shù)是Northern雜交技術(shù)，它是由Alwine等在1977年建立的

第54頁/共118頁核酸定量（DNA或RNA的定量）A260=1.0相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA(dsDNA)40μg/ml單鏈DNA(ssDNAorRNA)20μg/ml寡核苷酸確定樣品中核酸的純度

純

DNA:A260/A280=1.8

純

RNA:A260/A280=2.0核酸紫外吸收第55頁/共118頁衡量特異mRNA豐度方法

經(jīng)典的衡量某一特異mRNA豐度的方法的有：Northern雜交核糖核酸酶保護(hù)定量的反轉(zhuǎn)錄PCR

等為研究異質(zhì)細(xì)胞群中RNA和DNA序列的定位，還發(fā)展了原位雜交術(shù)目前這方面的技術(shù)發(fā)展方向是大規(guī)模化和高通量，其中基因芯片技術(shù)有著相當(dāng)大的優(yōu)勢第56頁/共118頁RNA加工修飾鑒定技術(shù)

有關(guān)RNA加工修飾的鑒定技術(shù)有多種

其中利用核酸酶對RNA進(jìn)行作圖，定位內(nèi)含子和外顯子；通過核提取物等進(jìn)行體外剪切分析。最近發(fā)展的基因芯片技術(shù)可以高通量地分析RNA剪接。

與RNA修飾和RNA編輯研究相關(guān)的技術(shù)主要有：

snoRNA指導(dǎo)的2‘-O-核糖甲基化修飾鑒定技術(shù)假尿苷化修飾鑒定技術(shù)

mRNA的各種編輯鑒定技術(shù)等第57頁/共118頁

另外，利用引物延伸法、S1核酸酶法等可以進(jìn)行RNA末端鑒定。

近年來發(fā)展的CAGE(capanalysisgeneexpression)，SAGE(serialanalysisofgeneexpression)等技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)RNA末端大規(guī)模鑒定。

其基本原理是在RNA5‘端加上帶酶切位點(diǎn)的接頭，酶切后可產(chǎn)生帶有5’端序列的短片段，經(jīng)過連接和測序，即可獲得大量5‘Tag序列信息。通過分析Taq的頻率可同時估計基因的表達(dá)情況。第58頁/共118頁小RNA豐度測定

隨著siRNA、microRNA、snoRNA等非編碼RNA研究的不斷深入，小RNA的分析和鑒定技術(shù)也逐步完善。目前有關(guān)小RNA豐度測定主要是利用改進(jìn)反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)，常見有三種方案：一、在兩端加RNA接頭二、通過在3‘端加polyA尾模擬mRNA三、利用stem-loop反轉(zhuǎn)錄引物技術(shù)

第59頁/共118頁

前兩者同樣可用于小RNA文庫的構(gòu)建，之后通過測序，可以獲得小RNA的序列信息，在大規(guī)模實(shí)驗(yàn)的條件下，根據(jù)獲得的克隆頻數(shù)也能分析相應(yīng)的表達(dá)水平。也有一小部分小RNA序列是在生物信息學(xué)預(yù)測的結(jié)果基礎(chǔ)上進(jìn)一步驗(yàn)證獲得的。

目前，高通量小RNA分析鑒定技術(shù)常用的是改進(jìn)的非編碼RNA芯片技術(shù)；對于特定的小RNA的分析鑒定除上述技術(shù)以外還有改良的Northern技術(shù)等。第60頁/共118頁克隆ncRNA的方法計算機(jī)分析法基因克隆法蛋白質(zhì)-RNA分離法第61頁/共118頁計算機(jī)分析法大致過程：

利用計算機(jī)軟件從已知基因組序列中尋找基因間區(qū)中的snoRNA序列，然后模擬其高級結(jié)構(gòu)，設(shè)計引物擴(kuò)增其序列和克隆，或人工合成其序列，測定其功能。第62頁/共118頁小RNA的克隆和鑒定小鼠腦組織勻漿總RNA8%PAGE回收50-110nt(fractionI)和110-500nt(fractionII)Poly(A)聚合酶加C尾cDNApSPORT1PCR高密度陣列雜交除去高豐度、已知的小RNA未雜交的cDNA測序詳見：http://exppc01.uni-muenster.de/expath/snmrnas.htm第63頁/共118頁蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物分離法分離蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物，除去蛋白質(zhì)，純化RNA分子，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，克隆，測序，結(jié)果分析。

所得RNA的cDNA克隆必須進(jìn)行Northern雜交，以確認(rèn)其轉(zhuǎn)錄物大小是否相符。第64頁/共118頁RNA與其他大分子相互作用研究技術(shù)

RNA與蛋白相互作用在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，相應(yīng)的技術(shù)也與細(xì)胞技術(shù)和蛋白質(zhì)技術(shù)交叉。通過光交聯(lián)進(jìn)行RNA的體外修飾并增加RNP的穩(wěn)定性，利用凝膠阻滯和硝酸纖維素濾膜結(jié)合實(shí)驗(yàn)技術(shù)分析RNA-蛋白質(zhì)作用常數(shù)，用免疫共沉淀技術(shù)分離特異的RNP。

RNA足跡、修飾干擾分析和RNP中寡核苷酸靶向的RNaseH切割保護(hù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)也常用于鑒定重要的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。第65頁/共118頁

目前這方面研究也有向大規(guī)模發(fā)展的趨勢，主要有兩種方案：

一是在細(xì)胞水平利用光交聯(lián)技術(shù)后，通過免疫共沉淀或者其他親和技術(shù)，獲取某個或某類蛋白的所有結(jié)合RNA基序，進(jìn)一步通過分離純化和測序等，獲得RNA與蛋白質(zhì)的相互作用信息。反過來，利用標(biāo)記的RNA或者已知的RNA結(jié)合蛋白也可獲得相應(yīng)與RNA相互作用的蛋白或其他大分子，再通過蛋白質(zhì)組技術(shù)獲得相應(yīng)信息。如RNAi和microRNA作用過程中許多新蛋白的發(fā)現(xiàn)就是通過這種技術(shù)完成的，從而逐步揭示了細(xì)胞內(nèi)RNA干擾的分子機(jī)制。第66頁/共118頁

二是利用各種文庫篩選技術(shù)，如酵母三雜交技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、核糖體展示技術(shù)、抑制細(xì)菌轉(zhuǎn)錄終止檢測技術(shù)、Northwestern技術(shù)等篩選RNA結(jié)合蛋白?；蚍催^來通過構(gòu)建天然或人工RNA文庫篩選與蛋白質(zhì)特異結(jié)合的RNA序列。第67頁/共118頁

RNA與DNA或RNA的相互作用也是基因調(diào)控的重要方面

如siRNA或microRNA與靶mRNA的結(jié)合，導(dǎo)致靶mRNA的降解或翻譯抑制；或者與靶DNA結(jié)合指導(dǎo)DNA的甲基化等。從這也衍生出許多相關(guān)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，例如microRNA的實(shí)驗(yàn)性尋靶技術(shù)。第68頁/共118頁RNA高級結(jié)構(gòu)研究技術(shù)

RNA高級結(jié)構(gòu)、RNA與其結(jié)合蛋白的高級結(jié)構(gòu)是RNA研究的重要組成部分。

RNA在體內(nèi)是以RNP形式存在的，因此研究RNP的結(jié)構(gòu)更具有意義。與之相關(guān)技術(shù)有各種顯微技術(shù)、X光晶體衍射技術(shù)和磁共振技術(shù)等。

（高分辨率核糖體晶體結(jié)構(gòu)的解析、Argonaute蛋白晶體結(jié)構(gòu)的研究等都是這些技術(shù)發(fā)展的成果，并為RNAi機(jī)制的闡明起到巨大幫助。）第69頁/共118頁其他RNA研究相關(guān)技術(shù)

在RNA的研究中不可避免的會遇到RNA降解問題，這就需要利用RNA保存技術(shù)，這是RNA研究中最基礎(chǔ)也是最重要的技術(shù)之一。各種RNA工具酶如RNA聚合酶、RNA酶、RNA連接酶和反轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)，使得進(jìn)行RNA操作更加方便和容易，從而也促進(jìn)RNA技術(shù)不斷創(chuàng)新，應(yīng)用范圍更加廣泛。第70頁/共118頁獲得已知序列的RNA分子

無論基礎(chǔ)或應(yīng)用研究中，都有可能需要大量獲得已知序列的RNA分子。

RNA合成技術(shù)包括：體外轉(zhuǎn)錄合成技術(shù)直接化學(xué)合成技術(shù)體內(nèi)合成技術(shù)利用tRNA骨架在體內(nèi)大量表達(dá)出研究者需要RNA分子第71頁/共118頁第二節(jié)

RNA應(yīng)用相關(guān)技術(shù)第72頁/共118頁RNA應(yīng)用相關(guān)技術(shù)

雖然RNA的研究蓬勃開展，但是在相當(dāng)長的時間里RNA還主要停留在基礎(chǔ)研究階段。

直到20世紀(jì)80年代末，核酶專利的出現(xiàn)使得RNA應(yīng)用技術(shù)的研究迅速升溫。從新RNA應(yīng)用技術(shù)的建立到專利出現(xiàn)的時間差也在不斷縮短。

這方面技術(shù)也可大致分為兩大類：

用于生產(chǎn)其他產(chǎn)品的RNA技術(shù)直接用于藥物開發(fā)的RNA技術(shù)。

第73頁/共118頁

用于生產(chǎn)其他產(chǎn)品的RNA技術(shù)主要是指蛋白質(zhì)合成方面，如蛋白質(zhì)的體外合成

將RNA的體外合成技術(shù)與蛋白質(zhì)體外合成系統(tǒng)聯(lián)合在一起可以制備許多生物工程技術(shù)不能生產(chǎn)的毒蛋白、人工合成氨基酸摻入蛋白質(zhì)等

大規(guī)模蛋白質(zhì)體外合成技術(shù)必將是今后RNA應(yīng)用技術(shù)發(fā)展的一個重要方向

第74頁/共118頁多聚核蛋白體(polysome)：mRNA與多個核糖體的聚合物——使蛋白質(zhì)合成以高速度、高效率進(jìn)行目錄第75頁/共118頁電鏡下的多聚核糖體現(xiàn)象目錄第76頁/共118頁rRNA與蛋白質(zhì)組成核糖體

目錄

蛋白質(zhì)合成場所第77頁/共118頁核糖體的組成目錄原核生物核糖體70SMt2.7×106

真核生物核糖體80SMt4.2×106第78頁/共118頁直接用于藥物開發(fā)的RNA技術(shù)

目前應(yīng)用較廣泛的主要有：反義核酸(狹義的)技術(shù)、核酶技術(shù)、SELEX技術(shù)(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment)、RNA干擾、引誘物(decoy)技術(shù)上述各種技術(shù)獲得的RNA或DNA及其類似物的作用都是抑制基因表達(dá)，因此，這些分子本身可作為各種疾病治療用的藥物許多這方面的藥物已經(jīng)獲準(zhǔn)上市或處于臨床研究階段第79頁/共118頁反義核酸技術(shù)

1978年，Zamecnik等證明特異互補(bǔ)的寡核苷酸在體外能有效地抑制Rous肉瘤病毒(RSV)增殖。

1984年，Izant和Weintraub等首次提出反義核酸技術(shù)(antisensetechnology)的概念。

反義技術(shù)：

指根據(jù)堿基互補(bǔ)原理，用人工或生物體合成的特異互補(bǔ)的DNA或RNA片段(或其化學(xué)修飾產(chǎn)物)抑制或封閉目的基因表達(dá)的技術(shù)。

第80頁/共118頁

廣義地講，反義寡核苷酸技術(shù)、反義RNA技術(shù)、核酶技術(shù)、RNAi技術(shù)等都屬于反義技術(shù)范疇。

目前，傳統(tǒng)的反義核酸藥物已經(jīng)發(fā)展到了第三代，主要包括肽核酸(peptidenucleicacids，PNA)、鎖定核酸(lockednucleicacid，LNA)等多種化學(xué)修飾的寡核苷酸。第一個反義核酸藥物(VitravenekTM)已經(jīng)進(jìn)入商業(yè)市場，還有多種反義核酸進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)。第81頁/共118頁核酶技術(shù)

幾乎在發(fā)現(xiàn)反義RNA的同時,人們發(fā)現(xiàn)了一類具有酶活性的單鏈RNA分子，即核酶(ribozyme)1982年，Cech首先提出Ribozyme的概念，并認(rèn)為核酶在生物體內(nèi)普通存在核酶發(fā)現(xiàn)的意義：改變了酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)概念，揭示了RNA在生物體內(nèi)的多功能特性，RNA既是遺傳物質(zhì),還具有多功能的催化作用，是生命科學(xué)發(fā)展過程又一里程碑

第82頁/共118頁83一些內(nèi)含子RNA具有自我剪接和催化功能由RNA分子催化自身內(nèi)含子剪接的反應(yīng)稱為自我剪接(self-splicing)自身剪接內(nèi)含子的RNA具有催化功能，是一種核酶(ribozyme)

四膜蟲rRNA的剪接采用自我剪接方式第83頁/共118頁

核酶（ribozyme）是具有催化功能的RNA分子。核酶又稱核酸類酶、酶RNA、類酶RNA。核酶的功能很多,有的能夠切割RNA,有的能夠切割DNA,有些還具有RNA連接酶、磷酸酶等活性。核酶通過催化轉(zhuǎn)磷酸酯和磷酸二酯鍵水解反應(yīng)參與RNA自身剪切、加工過程。

與蛋白質(zhì)酶相比，核酶的催化效率較低，是一種較為原始的催化酶。第84頁/共118頁

核酶技術(shù)原理：

核酶RNA分子通過堿基配對原則與靶mRNA結(jié)合發(fā)揮酶活性，在特定的位點(diǎn)特異性滅活靶RNA分子，同時兼具反義抑制效果。

核酶可以在體外合成，也可以經(jīng)表達(dá)載體導(dǎo)入后在細(xì)胞內(nèi)合成。

脫氧核酶(deoxyribozyme)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類具有催化活性的單鏈DNA分子。脫氧核酶兼具ASON反義抑制作用和核酶的靶向性剪切活性等雙重優(yōu)勢，而且穩(wěn)定性較好。第85頁/共118頁核酶類型到目前為止，人們發(fā)現(xiàn)的核酶共有6種類型：I類內(nèi)含子RNaseP錘頭狀核酶發(fā)夾狀核酶丁型肝炎核酶VS核酶

第86頁/共118頁

通過對這6類核酶組成及結(jié)構(gòu)的研究，人們利用錘頭狀、發(fā)夾狀、斧頭狀核酶的特點(diǎn)，人工合成所需要的核酶。錘頭狀核酶的二級結(jié)構(gòu)是由核酶和底物復(fù)合物組成的三個莖環(huán)結(jié)構(gòu)。

RNA底物通過二個莖環(huán)結(jié)合到核酶上，切割位點(diǎn)由一個非配對堿基及與之相連的二個莖環(huán)結(jié)構(gòu)組成。切割發(fā)生在非配對的3’側(cè)，切割產(chǎn)物5’端是羥基。3`端是一個2’3’環(huán)磷酸二酯，核酶催化水解底物需要被水解部有一個特殊的三聯(lián)密碼，NUX、(N{G、A．U；XA、U，C)當(dāng)三聯(lián)碼為GUC時，被水解的活性最高。第87頁/共118頁核酶技術(shù)的特點(diǎn)①序列特異性；②不編蛋白質(zhì)，無免疫原性；③可以重復(fù)利用，所以研究進(jìn)展迅速第88頁/共118頁SELEX技術(shù)第89頁/共118頁SELEX技術(shù)

適配分子技術(shù)是一種最近發(fā)展起來的體外篩選和放大技術(shù)，通過該技術(shù)可得到一段能與各種目標(biāo)分子高親和、高特異結(jié)合的核酸序列，該核酸序列稱之為適配分子(aptamer)。

Aptamer一詞來源于拉丁文Aptus，意即適合的意思(fit)，而這種體外的篩選技術(shù)稱之為指數(shù)級富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)即SELEX(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment)。簡言之，Aptamer就是一段核酸序列，它能與相應(yīng)的配體高特異性和高親合力地結(jié)合。從原始文庫中篩選配體相應(yīng)的Aptamer的技術(shù)稱為SELEX技術(shù)。

Aptamer具有廣泛的實(shí)用性，它能用于任何以分子識別為基礎(chǔ)的診斷和治療。第90頁/共118頁原理

從大量的隨機(jī)序列的寡核苷酸庫中鑒定出一種數(shù)量很少的具有獨(dú)特性質(zhì)的核酸序列的方法是由Tuerk和Ellington等在1990年建立的，它是一種通過體外反復(fù)選擇和放大從巨大的核苷酸組合庫中篩選特定核苷酸序列的方法。

SELEX過程中，首先是用組合化學(xué)合成DNA的方法合成隨機(jī)序列的核酸庫，庫中的每一個成員是一個線形的寡聚物，庫中分子多樣性的程度取決于隨機(jī)寡核苷酸的長度。理論上講，一個40個堿基的隨機(jī)序列可有1.2X1024種核苷酸排列順序(440=1.2X1024)。實(shí)際上1μmol的固相DNA合成的隨機(jī)組合核苷酸庫的序列多樣性僅限制于1014—1015種，能否找出與靶分子相互作用的稀有序列，很大程度上取決于組合庫的多樣性，在所有種類的組合隨機(jī)序列庫中寡核苷酸庫的多樣性最為豐富。

篩選過程中，首先在一定的溫度下將寡核苷酸隨機(jī)序列庫與靶分子共同孵育于特定的緩沖液中，組合庫中的極少數(shù)分子將與靶分子結(jié)合，然后用物理的方法將結(jié)合的分子與末結(jié)合的分子分離開來。標(biāo)準(zhǔn)的方法是將蛋白靶分子固定于硝酸纖維素濾膜上，而其他小的靶分子則固定于固相載體的表面，因此，未與靶分子結(jié)合的序列很容易被沖洗掉，而與靶分子結(jié)合的序列將被分離出來并放大以獲得一個序列庫，再對這一序列庫進(jìn)行下一輪的篩選和放大。

第91頁/共118頁SELEX技術(shù)原理第92頁/共118頁

由于aptamer具有精確識別、易體外合成與修飾等特性，SELEX技術(shù)在分析化學(xué)、基因調(diào)控、蛋白質(zhì)組研究、疾病治療與新藥研發(fā)等方面得到廣泛的應(yīng)用。更重要的是，aptamer的靶分子范圍很廣，與靶分子間的親和力和特異性更高，從SELEX技術(shù)建立至今，SELEX技術(shù)和aptamer的研究不斷受到新的挑戰(zhàn)與更新。第93頁/共118頁SELEX技術(shù)改良

經(jīng)過15年的發(fā)展，SELEX技術(shù)不斷得到改進(jìn)與完善，實(shí)現(xiàn)了篩選流程的自動化、篩選形式的多樣化、篩選結(jié)果的快速化，aptamer也有了多種應(yīng)用形式。

各種改良SELEX技術(shù)：自動化SELEX消減SELEX(subtractiveSELEX)毛細(xì)管電泳SELEX(CE-SELEX)加尾SELEX(tailoredSELEX)無引物基因組SELEX(primer-freegenomicSELEX)切換SELEX(togglingSELEX)表達(dá)盒SELEX(expressioncassetteSELEX)變構(gòu)篩選(allostericselection)

利用SELEX技術(shù)篩選獲得的針對VEGF的RNA配基(aptamer)已經(jīng)獲得美國FDA批準(zhǔn)上市，商品名為Macugen，用于老年性視網(wǎng)膜黃斑營養(yǎng)不良(AMD)的治療。第94頁/共118頁RNA干擾技術(shù)

早在1990年，人們就發(fā)現(xiàn)植物中存在轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。

1995年，康乃爾大學(xué)的Guo在利用反義RNA技術(shù)特異性地抑制秀麗新小桿線蟲(C.elegans)中的par-1基因的表達(dá)時，意外發(fā)現(xiàn)對照實(shí)驗(yàn)中給線蟲注射正義RNA(senseRNA)也能抑制par-1基因的表達(dá)。直到1998年，F(xiàn)ire和Mello才首次揭示雙鏈RNA能夠特異抑制具有相同序列的靶mRNA的表達(dá)，并將這一現(xiàn)象稱為RNA干涉(RNAinterference，RNAi)。在隨后的短短一年中，RNAi現(xiàn)象被廣泛地發(fā)現(xiàn)存在于大多數(shù)真核生物中，RNAi技術(shù)也被迅速應(yīng)用到生命研究的各個領(lǐng)域。

第95頁/共118頁

目前，RNAi技術(shù)作為基因功能研究和疾病基因治療的革命性工具，已經(jīng)在醫(yī)藥開發(fā)、基因治療和功能基因組研究等方面得到廣泛應(yīng)用，并于2006年獲得諾貝爾獎。

RNAi技術(shù)的作用基礎(chǔ)是siRNA的基因沉默作用。第96頁/共118頁RNA干擾

一些小的雙鏈RNA可以高效、特異地阻斷體內(nèi)特定基因表達(dá),促使ｍRNA降解,誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型,稱為RNA干擾(RNAinterference,RNAi,也譯作RNA干預(yù)或者干涉)。第97頁/共118頁RNA干擾原理第98頁/共118頁RNAi－一種新的遺傳學(xué)研究工具RNAi是植物、果蠅、線蟲和很可能包括哺乳動物在內(nèi)的許多生物抵抗病毒感染和限制轉(zhuǎn)座子運(yùn)動的一種自然存在的防御機(jī)制。RNAi可以作為一種簡單、有效的代替基因敲除的遺傳工具，來制備特定基因缺失表型的個體,從而研究該基因的功能.它正在功能基因組學(xué)領(lǐng)域掀起一場真正的革命,并將徹底改變這個領(lǐng)域的研究步伐,為此被SCIENCE評為2002年最重要的科研成果之一。在哺乳動物細(xì)胞中用siRNA(21－23核苷酸長的小分子干擾ＲＮＡ片段(smallinterferingRNAs,siRNAs,又被稱為引導(dǎo)RNAs)。能高效阻斷某個特定基因的表達(dá),這項(xiàng)技術(shù)在疾病的基因治療上也有光明的應(yīng)用前景。特別可以用于阻斷某些突變基因的表達(dá),或者由蛋白過量表達(dá)引起的疾病。第99頁/共118頁共抑制現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)

ＲＮＡｉ研究的早期線索早在20年前,來自于美國和荷蘭的兩個轉(zhuǎn)基因植物實(shí)驗(yàn)組Richjorgensen和同事,在對矮牽牛(petunias)進(jìn)行的研究中有個奇怪的發(fā)現(xiàn):將一個能產(chǎn)生色素的基因置于一個強(qiáng)啟動子后,導(dǎo)入矮腳牽牛中,試圖加深花朵的紫顏色,結(jié)果沒看到期待中的深紫色花朵,多數(shù)花成了花斑的甚至白的。jorgensen將這種現(xiàn)象命名為共抑制(cosuppression),因?yàn)閷?dǎo)入的基因和其相似的內(nèi)源基因同時都被抑制。開始這被認(rèn)為是矮牽牛特有的怪現(xiàn)象,后來發(fā)現(xiàn)在其他許多植物中,甚至在真菌中也有類似的現(xiàn)象。

第100頁/共118頁第101頁/共118頁基因沉默

轉(zhuǎn)錄階段基因沉默(transcriptionalgenesilencing,orTGS)：

對于部分植物來說,轉(zhuǎn)基因引發(fā)的基因沉默可能是因?yàn)榛蛱禺惖募谆鴮?dǎo)致,這被稱為轉(zhuǎn)錄階段基因沉默.轉(zhuǎn)錄后發(fā)生的基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing,orPTGS)：Ｈａｍｉｌｔｏｎ等,率先在發(fā)生ＰＴＧＳ的西紅柿中檢測出與被沉默基因同源的約25ｎｔ的短片段ＲＮＡ,而未發(fā)生ＰＴＧＳ的西紅柿則不能檢出25ｎｔ的ＲＮＡＨａｍｉｌｔｏｎＡＪｅｔａｌ.Ｓｃｉｅｎｃｅ,1999,286(5441):950—952

第102頁/共118頁第103頁/共118頁第104頁/共118頁

目前在體內(nèi)或體外RNAi中應(yīng)用的siRNA主要有兩種來源：體外化學(xué)合成或轉(zhuǎn)錄的siRNA和利用DNA載體在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生。由化學(xué)合成或體外轉(zhuǎn)錄的方法得到~21nt的siRNA，目前應(yīng)用得最廣泛。尤其是經(jīng)過修飾后提高穩(wěn)定性的siRNA仍可表現(xiàn)特異的基因沉默作用，為其在體內(nèi)的應(yīng)用提供了可能的前景，而且目前的研究表明，無論在細(xì)胞或動物體內(nèi)，應(yīng)用此類siRNA均不影響體內(nèi)miRNA的表達(dá)和功能，進(jìn)一步說明siRNA應(yīng)用的可靠性。

第105頁/共118頁

也有根據(jù)靶基因mRNA設(shè)計的長dsRNA經(jīng)Dicer剪切成一系列~21nt的siRNA(統(tǒng)稱為esiRNA)，能更有效、更方便地抑制基因的表達(dá)，但是其缺點(diǎn)是可能存在非特異效應(yīng)。隨著miRNA研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)根據(jù)miRNA設(shè)計的發(fā)夾RNA，或基于