基因的克隆與分離

基因的克隆與分離第1頁(yè)/共96頁(yè)結(jié)構(gòu)基因的組成轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)核糖體識(shí)別區(qū)編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)起始密碼ATG開放讀碼框終止碼TAG、TAA、TGA第2頁(yè)/共96頁(yè)目的基因的定義準(zhǔn)備要分離、改造、擴(kuò)增或表達(dá)的基因。第3頁(yè)/共96頁(yè)第四章目的基因獲取1.直接分離法2.構(gòu)建基因組文庫(kù)分離法3.PCR分離法4.化學(xué)合成法第4頁(yè)/共96頁(yè)第一節(jié)

直接分離法231限制性內(nèi)切酶法隨機(jī)片斷化物理化學(xué)法第5頁(yè)/共96頁(yè)用限制性內(nèi)切酶把基因組DNA切成不同大小的片斷。酶切1.限制性內(nèi)切酶法第6頁(yè)/共96頁(yè)適合于從簡(jiǎn)單的基因組中分離目的基因,如質(zhì)?；虿《镜拇笮≈挥袔浊A基,大的也超不過幾十萬堿基,編碼基因比較少,獲得也比較簡(jiǎn)單.應(yīng)用對(duì)象1、對(duì)已知序列的DNA分子，只需要用已知識(shí)別序列的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行一次或幾次切割，分離純化所需要的DNA片斷，與適當(dāng)載體連接。2、對(duì)已知定位的目的基因，只要根據(jù)目的基因兩側(cè)的已知的酶切識(shí)別位點(diǎn)，一次就可以獲得。3、即使含目的基因的DNA分子未定序或定位，也只須通過酶切分析，隨后再通過部分酶切，構(gòu)建一個(gè)簡(jiǎn)單的基因文庫(kù)，從鉤出目的基因。第7頁(yè)/共96頁(yè)由于帶有粘性末端，產(chǎn)物可以直接與載體連接。目的基因內(nèi)部也可能有該內(nèi)切酶的切點(diǎn)。目的基因也被切成碎片！BamHIBamHIBamHIgene

優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)第8頁(yè)/共96頁(yè)控制內(nèi)切酶的用量和消化時(shí)間，使基因組中的酶切位點(diǎn)只有一部分被隨機(jī)切開。影響所切出的產(chǎn)物的長(zhǎng)度和隨機(jī)程度。2、隨機(jī)片斷化2.1限制性內(nèi)切酶局部消化法限制性內(nèi)切酶的選用原則①內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的堿基數(shù)②內(nèi)切酶粘性末端能與常用克隆位點(diǎn)相連。第9頁(yè)/共96頁(yè)（1）超聲波超聲波強(qiáng)烈作用于DNA，可使其斷裂成約300bp的隨機(jī)片斷。（2）高速攪拌1500轉(zhuǎn)/分下攪拌30min，可產(chǎn)生約8kb的隨機(jī)片斷。2.2機(jī)械切割法第10頁(yè)/共96頁(yè)基本原理：DNA分子的兩條鏈存在著G≡C、A＝T堿基配對(duì)，其中GC間存在3個(gè)氫鍵、AT間存在2個(gè)氫鍵，如果不同基因片段的堿基組成差異較大，其理化性質(zhì)，如浮力密度和解鏈溫度等也明顯不同，采用相應(yīng)的方法即可達(dá)到從生物基因組中分離目的基因的目的。密度梯度離心法非洲爪瞻5SDNA單鏈酶解法根據(jù)其熱穩(wěn)定海膽DNA3物理化學(xué)法第11頁(yè)/共96頁(yè)第四章目的基因獲取1.直接分離法2.構(gòu)建基因組文庫(kù)分離法3.PCR分離法4.化學(xué)合成法第12頁(yè)/共96頁(yè)

將某種生物細(xì)胞的整個(gè)基因組DNA切割成大小合適的片斷，并將所有這些片斷都與適當(dāng)?shù)妮d體連接，引入相應(yīng)的宿主細(xì)胞中保存和擴(kuò)增。

理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的全部基因，稱為基因文庫(kù)。第二節(jié)構(gòu)建基因組文庫(kù)分離法1.基因文庫(kù)（genelibrary）第13頁(yè)/共96頁(yè)一、基因文庫(kù)某一生物部分基因的集合叫該生物的亞基因組文庫(kù)。某一生物全部基因的集合叫該生物的基因文庫(kù)。第14頁(yè)/共96頁(yè)①載體的制備；②高純度大分子量基因組DNA（HighmolecularweightDNA,HMWDNA）的提??；③HMWDNA

的部分酶切與脈沖電泳分級(jí)分離；④載體與外源片段的連接與轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞；⑤重組克隆的挑取和保存?；蚪MDNA文庫(kù)的構(gòu)建程序包含5個(gè)部分：第15頁(yè)/共96頁(yè)斷點(diǎn)完全隨機(jī)，片斷長(zhǎng)度合適于載體連接。超聲波（300bp）或機(jī)械攪拌（8kb）。

①

物理切割法：內(nèi)切酶Sau3A進(jìn)行局部消化?？傻玫?0-30kb的隨機(jī)片斷。②

酶切法：2.基因文庫(kù)構(gòu)建的一般步驟（1）染色體DNA片段的制備第16頁(yè)/共96頁(yè)（2）目前常用的載體

載體能夠容載的DNA片斷大小直接影響到構(gòu)建完整的基因文庫(kù)所需要的重組子的數(shù)目。載體容量越大，所要求的DNA片斷數(shù)目越少，所需的重組子越少。（1）對(duì)載體的要求載體系列：

容量為約20kpcosmid載體：

容量為

45kbYAC：

容量為230kb-1700kbBAC:容量為

300kb（2）載體與基因組DNA大片段的連接構(gòu)建基因文庫(kù)的載體選用第17頁(yè)/共96頁(yè)①

粘性末端直接連接載體與外源DNA大片段的兩個(gè)末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A與BamHI的酶切末端。直接連接、人工接頭或同聚物加尾。②人工接頭法（adapter）人工合成的限制性內(nèi)切酶粘性末端片斷。載體與基因組DNA大片段的連接方式第18頁(yè)/共96頁(yè)各種酶的接頭可以向公司定做或購(gòu)買接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶粘性末端③同聚物加尾第19頁(yè)/共96頁(yè)限制酶切位點(diǎn)限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應(yīng)體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫(kù)第20頁(yè)/共96頁(yè)文庫(kù)的代表性和隨機(jī)性文庫(kù)的代表性：指文庫(kù)中所有克隆所攜帶的DNA片段可以覆蓋整個(gè)基因組，也就是說，可以從該文庫(kù)中分離任何一段基因組DNA。第21頁(yè)/共96頁(yè)一個(gè)文庫(kù)要包含99%的基因組DNA時(shí)所需要的克隆數(shù)目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文庫(kù)包含了整個(gè)基因組DNA的概率（99%）f:插入載體的DNA片斷的平均長(zhǎng)度占整個(gè)基因組DNA的百分?jǐn)?shù)N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）3.基因組文庫(kù)的大小第22頁(yè)/共96頁(yè)例如：人的基因組是

3×109bp，插入DNA片斷的平均長(zhǎng)度如果是1.7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61×GfN=4.61×GfG：Genome大??；f：fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×105第23頁(yè)/共96頁(yè)文庫(kù)的質(zhì)量檢測(cè)

克隆數(shù)越多，平均插入片段越長(zhǎng)，插入效率和基因組覆蓋度越高，文庫(kù)質(zhì)量就越好。一般覆蓋倍數(shù)達(dá)到4-6倍覆蓋率。第24頁(yè)/共96頁(yè)指文庫(kù)的對(duì)象不是全基因組范圍，而是基因組的某一區(qū)段，如基因組某一特定大小酶切片段的組合，一條染色體或更小的區(qū)段（如一個(gè)YAC或BAC克隆等）。亞基因組文庫(kù)第25頁(yè)/共96頁(yè)例如：將基因組DNA用多種限制性內(nèi)切酶切割，Southern雜交顯示目標(biāo)基因在8.3kb的Spel片段上則可將Spel酶切的基因組DNA中的8.3kb片斷回收，用于構(gòu)建DNA文庫(kù)。第26頁(yè)/共96頁(yè)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建1、cDNA文庫(kù)的特征1）基因表達(dá)的時(shí)空性決定cDNA文庫(kù)的取材，構(gòu)建cDNA文庫(kù)時(shí)最好選取目的基因表達(dá)量最高的發(fā)育時(shí)期或這一時(shí)期的特殊組織。第27頁(yè)/共96頁(yè)根葉花花藥莖穗下節(jié)幼胚第28頁(yè)/共96頁(yè)2）表達(dá)量的差異決定構(gòu)建cDNA文庫(kù)要具有合適的容量。3)mRNA的豐度高豐度mRNA：5000多個(gè)拷貝，占總mRNA的22%中等豐度mRNA：200-300個(gè)拷貝，占總mRNA的49%低豐度mRNA：1-15個(gè)拷貝，占總mRNA的29%第29頁(yè)/共96頁(yè)2、均一化cDNA文庫(kù)通過一定的策略和方法，將構(gòu)建好的獨(dú)立cDNA文庫(kù)進(jìn)行一定處理，降低高豐度和中等豐度基因在cDNA文庫(kù)中的比例，從而使高豐度、中等豐度和低豐度基因在文庫(kù)中出現(xiàn)的頻率相對(duì)一致，這種cDNA文庫(kù)稱均一化cDNA文庫(kù)。第30頁(yè)/共96頁(yè)1.cDNA以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄出的DNA稱cDNA。2.cDNAlibrarymRNAcDNA3’

3’

5’

5’

反轉(zhuǎn)錄酶引物利用某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，轉(zhuǎn)入細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行保存和擴(kuò)增，稱cDNA文庫(kù)。二、cDNA文庫(kù)的構(gòu)建第31頁(yè)/共96頁(yè)3.cDNA文庫(kù)的特點(diǎn)（1）不含內(nèi)含子序列。（2）可以在細(xì)菌中直接表達(dá)。（3）包含了所有編碼蛋白質(zhì)的基因。（4）比DNA文庫(kù)小的多，容易構(gòu)建。第32頁(yè)/共96頁(yè)（1）總RNA（totalRNA）提取提取總RNA有商業(yè)化的試劑盒（kit）。4.構(gòu)建cDNA文庫(kù)的一般步驟（2）mRNA的分離純化利用真核mRNA都含有一段polyA尾巴，將mRNA從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。mRNA只占總RNA的1%-2%。第33頁(yè)/共96頁(yè)第34頁(yè)/共96頁(yè)反轉(zhuǎn)錄酶①

cDNA第一鏈合成逆轉(zhuǎn)錄酶能以RNA為模板合成cDNA。用OligodT（或隨機(jī)引物）作引物，合成cDNA的第一鏈。

mRNAcDNA3’

5’

5’

AAAAAAATTTTTTTOligodT引物（3）cDNA的合成第35頁(yè)/共96頁(yè)用堿處理或用RNaseH降解mRNA-DNA雜交分子中的mRNA。mRNAcDNA3’

3’

5’

5’

反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’

3’

5’

5’

引物cDNA第一鏈3’

5’

引物或RNaseH堿②降解mRNA模板第36頁(yè)/共96頁(yè)剩下的cDNA單鏈的3’末端一般形成一個(gè)彎回來的雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu)，可成為合成第二條cDNA鏈的引物。用DNA聚合酶合成第二鏈DNA.。cDNA第一鏈5’

cDNA第二鏈合成DNA聚合酶cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’

3’

③cDNA第二鏈合成第37頁(yè)/共96頁(yè)核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)（但這會(huì)導(dǎo)致cDNA中有用的序列被切掉?。ヽDNA第一鏈cDNA第二鏈5’

3’

cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’

3’

5’

3’

④去掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)第38頁(yè)/共96頁(yè)在雙鏈cDNA末端接上人工接頭，即可與載體連接，轉(zhuǎn)入受體菌。或借助末端轉(zhuǎn)移酶給載體和雙鏈cDNA的3’端分別加上幾個(gè)C或G，成為粘性末端。接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶⑤cDNA與載體連接第39頁(yè)/共96頁(yè)第40頁(yè)/共96頁(yè)一個(gè)cDNA文庫(kù)要包含99%的mRNA時(shí)所需要的克隆數(shù)目。N=ln(1-p)ln(1-)p:文庫(kù)包含了完整mRNA的概率（99%）:某一種低豐度（不足14份拷貝）mRNA占細(xì)胞整個(gè)mRNA的比例N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）1n1n⑥

cDNA文庫(kù)的大小第41頁(yè)/共96頁(yè)獲得目的基因的其他方法㈠構(gòu)建差示文庫(kù)篩選特殊基因差示文庫(kù)（differentiallibrary）又稱扣除文庫(kù)（subtractedlibrary）,是反映不同組織細(xì)胞或同一種細(xì)胞在不同生理狀態(tài)下,基因表達(dá)差異的cDNA文庫(kù)。㈡mRNA差異顯示法獲得目的基因

mRNA差異顯示（mRNAdifferentialdisplayDD）PCR法全稱為DD-PCR法其用途和應(yīng)用目的與構(gòu)建差示文庫(kù)大體一致。㈢基因改造可獲得新型目的基因采用基因拼接、基因缺失或點(diǎn)突變等方法，使表達(dá)產(chǎn)物量提高或降低毒性，有助于研究基因間的相互作用（如協(xié)同／抑制效應(yīng)）。

第42頁(yè)/共96頁(yè)應(yīng)用差別雜交或扣除雜交法分離克隆的目的基因第43頁(yè)/共96頁(yè)差別雜交（differentialhybridization）又稱差別篩選(differentialscreening)

適用于分離經(jīng)特殊處理而被誘發(fā)表達(dá)的mRNA的cDNA?？鄢s交（subtractivehybridization）又叫扣除cDNA克隆（subtractivecDNAcloning）通過構(gòu)建扣除文庫(kù)得以實(shí)現(xiàn)。第44頁(yè)/共96頁(yè)差別雜交：需要兩種不同的細(xì)胞群體（目的基因正常表達(dá)、目的基因不表達(dá)），分別制備兩種不同mRNA提取物，以兩種總mRNA探針平行雜交，對(duì)有表達(dá)目的基因的細(xì)胞總mRNA構(gòu)建的克隆文庫(kù)進(jìn)行篩選。第45頁(yè)/共96頁(yè)第46頁(yè)/共96頁(yè)差別雜交的局限性：

1.雜交靈敏度低，對(duì)于低峰度的mRNA尤為明顯

2.工作量大，重復(fù)性差，兩套平行濾膜之間的DNA保有量有差別，導(dǎo)致雜交信號(hào)不一致。第47頁(yè)/共96頁(yè)其它方法（用于基因分離和鑒定的輔助方法）

1)抑制消減雜交法（SSH,SuppressionSubstractionHybridiazation)

該法是一種用于分離和鑒定差異表達(dá)基因的革命性方法，特別適宜于那些差異表達(dá)量很低的基因，其富集效率在1000倍以上。需要2gpoly(A)RNA和化3-4天時(shí)間。主要步驟：

i.利用SMART或常規(guī)方法制備待測(cè)ts-cDNA（testercDNA）和驅(qū)動(dòng)ds-cDNA（drivercDNA）

ii.用限制酶RsaI酶切2種cDNA，獲得具有平端結(jié)構(gòu)的ds-cDNA片段

iii.將待測(cè)cDNA樣品分為兩份，分別與2種不同的匹配接頭相連接。兩接頭的5’端序列是相同的，而其3’端則是不同的第48頁(yè)/共96頁(yè)iv.每份待測(cè)cDNA樣品中加入過量的驅(qū)動(dòng)cDNA，加熱變性后再?gòu)?fù)性，形成a、b、c、d4種分子，a類分子包括等量的高豐度和低豐度序列。由于非目的DNA已與驅(qū)動(dòng)cDNA形成了c類分子而使差異表達(dá)的基因序列大大地富集了—第1輪PCR

v.將第1輪雜交的樣品進(jìn)行第2輪雜交：將2種樣品混合后再加入驅(qū)動(dòng)cDNA，被富集的a類分子可形成b、c、e等3類雜交分子，e類分子是由2個(gè)具有不同單鏈匹配接頭的雙鏈待測(cè)cDNA組成，該類分子是被大大富集了的差異表達(dá)基因vi.整個(gè)群體分子經(jīng)過2輪PCR反應(yīng)：補(bǔ)平末端和差異表達(dá)基因的擴(kuò)增vii.擴(kuò)增結(jié)果：a、c和d分子因未形成雙鏈或只有單端引物，而b類分子可形成鍋柄狀分子，因而無法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，只有e分子才能被擴(kuò)增第49頁(yè)/共96頁(yè)第50頁(yè)/共96頁(yè)應(yīng)用mRNA差別顯示技術(shù)（DDRT-PCR）分離克隆的目的基因

(differentialdisplayreversetranscriptionpolymerasechainreaction)第51頁(yè)/共96頁(yè)原理：

用3’-端錨定引物和反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一鏈；用3’-端錨定引物和5’-端10-mer隨機(jī)引物組成引物對(duì)，以反轉(zhuǎn)錄第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增（DDRT-PCR），在標(biāo)準(zhǔn)的序列膠中電泳2~3小時(shí)，可顯示出50~100條長(zhǎng)度在100~5000bp之間的DNA條帶。第52頁(yè)/共96頁(yè)3’-錨定引物：

P.Liang等人設(shè)計(jì)合成了全部12種不同的引物，用以反轉(zhuǎn)錄mRNA，合成第一鏈cDNA。這種引物通常叫作3'-端錨定脫氧核苷酸引物，并用5'-T11MN或5'-T12MN通式表示。其中M為除了T以外的任何一種核苷酸（即A、G或C），而N則為任何一種核苷酸（即A、G、C或T），故MN共有12種不同的排列組合方式。mRNA:5’-NMAAAAAA…AA-3’(12種序列)3’-NMTTTTTTT…TT-5’

第53頁(yè)/共96頁(yè)第54頁(yè)/共96頁(yè)5’-隨機(jī)引物：

10-mer，更好的同第一鏈結(jié)合，從而呈現(xiàn)出更多種的mRNA。一般用20種隨機(jī)引物和12種3’-端錨定引物組成的全部240組引物對(duì)PCR擴(kuò)增后，所產(chǎn)生的大約20000條條帶，基本涵蓋了在一定的發(fā)育階段某種類型細(xì)胞中所表達(dá)的全部的mRNA。第55頁(yè)/共96頁(yè)第二節(jié)

獲得目的基因方法的選擇一、根據(jù)獲得目的基因的研究目的選擇方法為了研究基因全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)、調(diào)控、DNA信息分析構(gòu)建基因組文庫(kù)，為了開展目的基因重組表達(dá)制藥、治療構(gòu)建cDNA文庫(kù)。若目的基因序列明確可設(shè)計(jì)引物通過PCR/RT-PCR克隆。若目的基因序列短小可化學(xué)合成。二、根據(jù)目的基因本身特點(diǎn)選擇方法對(duì)從基因組中克隆的基因(內(nèi)含子)只能真核表達(dá)對(duì)從cDNA中克隆的基因(無內(nèi)含子)可在原核/真核表達(dá)要選擇mRNA表達(dá)豐富的組織材料，PCR克隆的基因必須測(cè)序。三、根據(jù)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備條件選擇方法

部分文庫(kù)無需自行構(gòu)建，有商品出售。目的基因序列明確，也無需建庫(kù)，可直接用PCR/RT-PCR克隆。第56頁(yè)/共96頁(yè)基因組DNA文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的比較第57頁(yè)/共96頁(yè)1、cDNA文庫(kù)以mRNA為材料，特別適用于某些RNA病毒，例如流感病毒；因其不通過DNA中間體，所以研究其唯一的方法就是cDNA克隆。2、cDNA基因文庫(kù)的篩選比較簡(jiǎn)單易行。他的文庫(kù)所含的克隆數(shù)是基因文庫(kù)的十分之一，或更少。3、由于每一個(gè)cDNA克隆都含有一種mRNA序列，這樣在目的基因的選擇中出現(xiàn)假陽(yáng)性的概率比較低，而相比之下基因組文庫(kù)克隆的選擇較復(fù)雜，假陽(yáng)性的概率就高。⑦cDNA文庫(kù)與基因組文庫(kù)相比的優(yōu)越性表現(xiàn)在第58頁(yè)/共96頁(yè)4、cDNA克隆可用于在細(xì)菌中能進(jìn)行表達(dá)的基因克隆，直接應(yīng)用于基因工程操作。原因是：高等真核生物與原核生物在結(jié)構(gòu)組成上的最大區(qū)別是前者含有內(nèi)含子間隔序列，而后者沒有。通過基因文庫(kù)中篩選的目的基因難以在原核生物中表達(dá)。而cDNA是經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后得來的其內(nèi)含子部分已被刪除。5、cDNA克隆還可以用于真核細(xì)胞mRNA的結(jié)構(gòu)和功能的研究一種特異的mRNA在細(xì)胞中往往占很小的比例，難以直接研究其序列、結(jié)構(gòu)和功能。一般是通過比較基因組進(jìn)行確定⑦cDNA文庫(kù)與基因組文庫(kù)相比的優(yōu)越性表現(xiàn)在第59頁(yè)/共96頁(yè)1、受材料來源的影響

2、遺傳信息量有限3、構(gòu)建的cDNA文庫(kù)中高豐度的（含量）mRNA含量比低豐度的易得和分離，其實(shí)現(xiàn)在構(gòu)建的cDNA基本上是高豐度的而低豐度的很少⑧cDNA文庫(kù)與基因組文庫(kù)相比的缺點(diǎn)第60頁(yè)/共96頁(yè)第四章目的基因獲取1.直接分離法2.構(gòu)建基因組文庫(kù)分離法3.PCR分離法4.化學(xué)合成法第61頁(yè)/共96頁(yè)如果知道目的基因的全序列或其兩端的序列，通過合成一對(duì)與引物互補(bǔ)的引物，就可以十分有效的擴(kuò)增出所需的目的基因。省時(shí)省力第三節(jié)PCR擴(kuò)增獲得目的基因第62頁(yè)/共96頁(yè)（1）提取基因組DNA作模板（2）根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物（3）PCR擴(kuò)增真核生物基因組含有內(nèi)含子！適合擴(kuò)增原核生物基因。1.直接從基因組中擴(kuò)增第63頁(yè)/共96頁(yè)原核基因組部分原核細(xì)胞提取基因組DNAPCR擴(kuò)增第64頁(yè)/共96頁(yè)（1）提取基因組

totalRNA（2）反轉(zhuǎn)錄合成總cDNA作模板（4）PCR擴(kuò)增（3）根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。適合擴(kuò)增真核生物基因。2.從mRNA中擴(kuò)增:RT-PCR第65頁(yè)/共96頁(yè)目的基因的引物1反轉(zhuǎn)錄成目的基因cDNA第一鏈目的基因的引物2目的

基因cDNA第二鏈PCRmRNA第66頁(yè)/共96頁(yè)利用簡(jiǎn)并引物獲取目的基因第67頁(yè)/共96頁(yè)一利用ncbi搜索不同物種中同一目的基因的蛋白或cDNA編碼的氨基酸序列因?yàn)槊艽a子的關(guān)系，不同的核酸序列可能表達(dá)的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez檢索系統(tǒng)，查找到一條相關(guān)序列即可。隨后利用這一序列使用BLASTp(通過蛋白查蛋白)，在整個(gè)Nr數(shù)據(jù)庫(kù)中中查找與之相似的氨基酸序列。二、對(duì)所找到的序列進(jìn)行多序列比對(duì)將搜索到的同一基因的不同氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，可選工具有ClustalW，也可在線分析http://www.ebi.ac.uk/clustalw/。三、確定合適的保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物至少需要上下游各有一個(gè)保守區(qū)域，且兩個(gè)保守區(qū)域相距50～400個(gè)aa為宜，使得pcr產(chǎn)物在150~1200bp之間，最重要的是每一個(gè)保守區(qū)域至少有6個(gè)aa殘基，因?yàn)槊織l引物至少18bp左右。若比對(duì)結(jié)果保守性不是很強(qiáng)很可能找不到6個(gè)aa的保守區(qū)域，這時(shí)可以根據(jù)物種的親緣關(guān)系，選擇親緣相近的物種進(jìn)行二次比對(duì)，若保守性仍達(dá)不到要求，則需進(jìn)行三次比對(duì)。總之，究竟要選多少序列來比對(duì)，要根據(jù)前一次比對(duì)的結(jié)果反復(fù)調(diào)整。最終目的就是有兩個(gè)6個(gè)aa且兩者間距離合適的保守區(qū)域。第68頁(yè)/共96頁(yè)四、利用軟件設(shè)計(jì)引物當(dāng)?shù)玫奖Ｊ貐^(qū)域后，就可以利用專業(yè)的軟件來設(shè)計(jì)引物了，其中pp5支持簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)，將參與多序列比對(duì)的序列中的任一條導(dǎo)入pp5中，再將其翻譯成核苷酸序列，有密碼子簡(jiǎn)并性，其結(jié)果是有n多條彼此只相差以個(gè)核苷酸的序列群，該群可用一條有簡(jiǎn)并性的核苷酸鏈來表示（其中R＝A／G，Y＝C／T，M＝A／C，K＝G／T，S＝C／G，W＝A／T，H＝A／C／T，B＝C／G／T，V＝A／C／G，D＝A/G/T,N=A／C／G/T），該具有簡(jiǎn)并性的核苷酸鏈必然包含上一步中找到的氨基酸保守區(qū)域的對(duì)應(yīng)部分，在pp5中修改參數(shù)，令其在兩個(gè)距離合適的保守的nt區(qū)域內(nèi)尋找引物對(duì)，總之要保證上下游引物都落在該簡(jiǎn)并鏈的保守區(qū)域內(nèi)，結(jié)果會(huì)有數(shù)對(duì)，分?jǐn)?shù)越高越好。五、對(duì)引物的修飾若得到的引物為：5-NAGSGNGCDTTANCADK-3則其簡(jiǎn)并度＝4×2×4×3×4×3×2=2304，很明顯該條引物的簡(jiǎn)并度多高不利于pcr。我們可以通過用次黃嘌呤代替N（因?yàn)榇吸S嘌呤能很好的和4種堿基配對(duì)）和根據(jù)物種密碼子偏好這兩種方法來降低簡(jiǎn)并度。最后，這樣子設(shè)計(jì)出來簡(jiǎn)并引物對(duì)，適用于用于比對(duì)的氨基酸序列所屬物種及與這些物種分類地位相同的其他物種。第69頁(yè)/共96頁(yè)值得注意的是常規(guī)PCR，可以合成的DNA片段長(zhǎng)度有限，一般在1KB以內(nèi)，大于他擴(kuò)增效果顯著下降。？未知序列的DNA更長(zhǎng)的DNA第70頁(yè)/共96頁(yè)特殊類型的PCR1、套式PCR（nestedPCR）

利用兩對(duì)引物，從一個(gè)模板的同一區(qū)域擴(kuò)增出不同長(zhǎng)度而設(shè)計(jì)的特殊方法。他較常規(guī)PCR靈敏度大大提高，同時(shí)也能有較強(qiáng)的特異性。2、不對(duì)稱PCR利用引物濃度不同（50：1或100：1）------單鏈DNA，用作DNA序列分析的模板。3、反向PCR未知序列的一種PCR方法第71頁(yè)/共96頁(yè)旁側(cè)序列的克隆及測(cè)定反向PCR（InversePCR）溫度非對(duì)稱交互PCR（TAIL-PCR,thermalasymmetricinterlacedPCR）AL-PCR(adaptorligationPCR）T-LinkerPCR(T-linker-specificligationPCR）SiteFinding-PCR

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I-PCR是1988年由Triglia最早提出的反向PCR(InversePCR,IPCR)是最早提出的基于PCR的染色體步行技術(shù)之一。IPCR的實(shí)驗(yàn)程序包括,用限制性內(nèi)切酶酶切DNA;酶切后的DNA片段用T4DNA連接酶進(jìn)行自連接,產(chǎn)生環(huán)狀DNA片段;以環(huán)化產(chǎn)物為底物,用根據(jù)已知片段設(shè)計(jì)的反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,從而得到含有未知片段的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1)

第73頁(yè)/共96頁(yè)TAIL-PCR在利用特異引物和隨機(jī)引物進(jìn)行PCR中一般有3種產(chǎn)物生成：(1)由特異性引物和簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物；(2)由同一特異性弓l物擴(kuò)增出的產(chǎn)物；(3)由同一簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物。在TAIL-PCR反應(yīng)中，其中后2種目標(biāo)產(chǎn)物可以通過以嵌套的特異性引物進(jìn)行的后續(xù)反應(yīng)來消除。TAIL-PCR的基本原理是利用目標(biāo)序列旁的已知序列設(shè)計(jì)3個(gè)嵌套的特異性引物(specialprimer，簡(jiǎn)稱sp1，sp2，sp3，約20bp)，用它們分別和1個(gè)具有低Tm值的短的隨機(jī)簡(jiǎn)并引物(Arbitrarydegenerateprime，AD，約14bp)相組合，以基因組DNA為模板．根據(jù)引物的長(zhǎng)短和特異性的差異設(shè)計(jì)不對(duì)稱的溫度循環(huán)，通過分級(jí)反應(yīng)來擴(kuò)增特異引物(流程如圖所示)。第74頁(yè)/共96頁(yè)第75頁(yè)/共96頁(yè)第76頁(yè)/共96頁(yè)TAIL-PCR共分3次反應(yīng)。第一次反應(yīng)包括5次高特異性、1次低特異、10次較低特異性反應(yīng)和12個(gè)熱不對(duì)稱的超級(jí)循環(huán)。5次高特異性反應(yīng)，使sp1與已知的序列退火并延伸，增加了目標(biāo)序列的濃度；1次低特異性的反應(yīng)使簡(jiǎn)并引物結(jié)合到較多的目標(biāo)序列上；10次較低特異性反應(yīng)使2種引物均與模板退火，隨后進(jìn)行12次超級(jí)循環(huán)。經(jīng)上述反應(yīng)得到了不同濃度的3種類型產(chǎn)物：特異性產(chǎn)物(I)型和非特異性產(chǎn)物(Ⅰ型和Ⅲ型)。第二次反應(yīng)則將第一級(jí)反應(yīng)的產(chǎn)物稀釋1000倍作為模板，通過10次熱不對(duì)稱的超級(jí)循環(huán)，使特異性產(chǎn)物被選擇地?cái)U(kuò)增，而非特異產(chǎn)物含量極低。第三次反應(yīng)又將第二次反應(yīng)的產(chǎn)物稀釋作模板，再設(shè)置普通的PCR反應(yīng)或熱不對(duì)稱超級(jí)循環(huán)，通過上述3次PCR反應(yīng)可獲得與已知序列鄰近的目標(biāo)序列。

第77頁(yè)/共96頁(yè)SiteFinding-PCR:asimpleandefficientPCRmethodforchromosomewalkingNucleicAcidsResearch,2005,Vol.33,No.13第78頁(yè)/共96頁(yè)第79頁(yè)/共96頁(yè)第80