基因組比較基因組學(xué)

基因組比較基因組學(xué)第1頁(yè)/共53頁(yè)第一節(jié)人類基因組計(jì)劃該計(jì)劃是美國(guó)科學(xué)家1985年率先提出，1990年正式啟動(dòng)。美、英、德、法、日先后參加了此項(xiàng)工作，1999年我國(guó)成為HGP的第六個(gè)成員國(guó)。

HGP旨在闡明人類基因組DNA所具有的3×109核苷酸的序列，發(fā)現(xiàn)所有的人類基因并闡明其在染色體上的位置，破譯人類的全部遺傳信息，使得人類第一次在分子水平上全面地認(rèn)識(shí)自我。其研究?jī)?nèi)容還包括創(chuàng)建計(jì)算機(jī)分析管理系統(tǒng)，檢驗(yàn)相關(guān)的倫理、法律及社會(huì)問(wèn)題。

2000年完成了人類基因組“工作框架圖”。2001年公布了人類基因組圖譜及初步分析結(jié)果。

HGP的實(shí)施，揭開(kāi)了生命科學(xué)新的一頁(yè)，它可以造福于人類，但也面臨的倫理的挑戰(zhàn)。第2頁(yè)/共53頁(yè)1985年：5月，R.Sinsheimer在加州大學(xué)SantaCruz分校主持會(huì)議，討論將人類基因組全部測(cè)序的可行性；12月，西特斯公司（CetusCorp.）的K.Mullis和他的同事們發(fā)明了PCR技術(shù)，利用這項(xiàng)技術(shù)，科學(xué)家們能夠在短時(shí)間內(nèi)精確復(fù)制成百萬(wàn)的DNA片段，從而不再為遺傳物質(zhì)的用量而擔(dān)憂.1986年：3月，美國(guó)能源部（DepartmentofEnergy,DOE）在新墨西哥州召開(kāi)會(huì)議，討論人類基因組測(cè)序計(jì)劃；6月，科學(xué)家們齊聚紐約州冷泉港實(shí)驗(yàn)室，以“人類的分子生物學(xué)”為題討論人類基因組計(jì)劃可能帶來(lái)的利益和前景；同月，加州理工學(xué)院的L.Hood和L.Smith共同發(fā)明了第一臺(tái)DNA自動(dòng)測(cè)序儀；9月，DOE從1987年的財(cái)政預(yù)算中撥款530萬(wàn)美元，資助C.DeLisi開(kāi)始基因組研究.1987年：2月，W.Gibert從美國(guó)國(guó)家研究委員會(huì)（NationalResearchCouncil,NRC）辭職，組建Genome公司，同時(shí)宣稱該公司將參與人類基因組測(cè)序工作，并將為測(cè)序結(jié)果申請(qǐng)專利；4月，一個(gè)專家小組建議DOE在未來(lái)7年內(nèi)撥款10億美元，用以進(jìn)行人類基因圖譜測(cè)定和基因組測(cè)序，DOE主持的人類基因組計(jì)劃開(kāi)始實(shí)施；5月，華盛頓大學(xué)的D.Burke,M.Olson和G.Carle發(fā)明酵母人工染色體（YAC）克隆技術(shù)，使插入片段的長(zhǎng)度擴(kuò)大了10倍；10月，H.Donis-Keller發(fā)表了第一張帶有403個(gè)遺傳標(biāo)記的遺傳圖譜，由此在全世界范圍內(nèi)引發(fā)了測(cè)序競(jìng)爭(zhēng)；同月，杜邦公司將熒光鏈終止雙脫氧技術(shù)引入到DNA快速測(cè)序中；這一年，AppliedBiosystems公司將第一臺(tái)自動(dòng)測(cè)序儀推上市場(chǎng).1988年：2月，在一份至關(guān)重要的報(bào)告中，NRC批準(zhǔn)了人類基因組計(jì)劃，并提出分階段實(shí)施和每年2億美元的撥款申請(qǐng)；3月，在許多專家的提議下，J.Wyngaarden在弗吉尼亞州Reston召開(kāi)的會(huì)議上宣布，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NationalInstitutesofHealth,NIH）應(yīng)代替DOE成為人類基因組計(jì)劃中的主要負(fù)責(zé)機(jī)構(gòu).在這之后，Wyngaarden被任命為NIH主席；6月，第一屆基因組年會(huì)在冷泉港召開(kāi)；9月，NIH宣布成立人類基因組研究辦公室，并任命發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的J.Watson為主任；10月，NIH與DOE達(dá)成諒解備忘錄，雙方同意在人類基因組計(jì)劃中團(tuán)結(jié)協(xié)作.1989年：1月，洛克菲勒大學(xué)的N.Zinder主持了第一次HGP顧問(wèn)委員會(huì)會(huì)議；9月，Olson,Hood,Botstein和Cantor共同描繪了基因圖譜測(cè)定的新戰(zhàn)略；同月，DOE與NIH共同組建了一個(gè)委員會(huì)，以解決基因組計(jì)劃可能帶來(lái)的倫理、法律和社會(huì)問(wèn)題；10月，NIH的人類基因組研究辦公室升級(jí)為人類基因組研究國(guó)家中心（NationalCenterofHumanGenomeResearch,NCHGR），并被授予撥款權(quán).1990年：L.Smith,B.Karger和N.Dovichi分別領(lǐng)導(dǎo)的3個(gè)小組各自獨(dú)立地發(fā)展了毛細(xì)管電泳技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)后來(lái)被廣泛應(yīng)用于大規(guī)模測(cè)序中；4月，NIH和DOE一起發(fā)表了一個(gè)五年計(jì)劃，內(nèi)容包括測(cè)定完整的遺傳圖譜和物理圖譜（每100kb含一個(gè)標(biāo)記），并在2005年之前完成模式生物的基因組測(cè)序；8月，NIH決定對(duì)四種模式生物開(kāi)始大規(guī)模測(cè)序嘗試.這四種模式生物是：支原體（Mycoplasmacapricolum）、大腸桿菌（Escheriachiacoli）、線蟲（Caenorhabditiselegans）和釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）；10月，NIH和DOE宣布這一年的10月1日為人類基因組計(jì)劃的正式啟動(dòng)時(shí)間.同月，生物技術(shù)信息中心（NationalCenterofBiotechnologyInformation,NCBI）的D.Lipman與E.Myers發(fā)表了用于進(jìn)行同源序列比較的BLAST算法.1991年：6月，NIH的生物學(xué)家J.C.Venter發(fā)表了一種發(fā)現(xiàn)表達(dá)基因的新戰(zhàn)略，即使用表達(dá)序列標(biāo)簽（ExpressedSequenceTag,EST）；一個(gè)月之后，Venter在國(guó)會(huì)聽(tīng)證會(huì)上披露，NIH堆積了上千份表達(dá)基因的專利申請(qǐng)，由此引發(fā)了一場(chǎng)關(guān)于基因能否獲得專利的大爭(zhēng)論；10月，日本開(kāi)始對(duì)水稻基因組測(cè)序；12月，用于基因查找的第一個(gè)程序GRAIL開(kāi)發(fā)成功.1992年：4月，就基因申請(qǐng)專利的問(wèn)題，Watson在與B.Healy爭(zhēng)論之后辭去了NCHGR主任的職位，后者隨后被任命為NIH主席；6月，Venter離開(kāi)NIH組建了基因組研究所（TheInstituteofGenomeResearch,TIGR），這是一個(gè)位于馬里蘭州Rockville的非盈利機(jī)構(gòu)；7月，英國(guó)慈善機(jī)構(gòu)WellcomeTrust投資9500萬(wàn)美元，加入人類基因組計(jì)劃；9月，加州理工學(xué)院的M.Simon和他的同事們發(fā)明細(xì)菌人工染色體（BAC）克隆的新技術(shù)，使大規(guī)模克隆成為可能，BAC后來(lái)成為基因組研究中的“硬通貨”；10月，美國(guó)和法國(guó)的兩支研究隊(duì)伍分別完成了人類Y染色體和第21條染色體的第一張物理圖譜；12月，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間討論，NIH和DOE為鼓勵(lì)資源共享放寬了對(duì)數(shù)據(jù)資源的限制，規(guī)定研究人員必須在6個(gè)月之內(nèi)將新的數(shù)據(jù)傳送到公共數(shù)據(jù)庫(kù)中；同月，美國(guó)和法國(guó)的上述兩個(gè)研究機(jī)構(gòu)又分別完成了鼠和人的遺傳圖譜.1993年：4月，密歇根大學(xué)的F.Collins被任命為NCHGR的領(lǐng)導(dǎo)人；10月，NIH和DOE發(fā)布了新的五年計(jì)劃，按照這個(gè)計(jì)劃，到1998年底，將有80Mb的DNA被測(cè)序，而人類基因組將在2005年被全部測(cè)序.與此同時(shí)，位于英國(guó)劍橋的Sanger中心在J.Sulston的領(lǐng)導(dǎo)下加入人類基因組計(jì)劃，并成為一個(gè)重要的測(cè)序中心.1994年：9月，愛(ài)荷華大學(xué)的J.Murray與法國(guó)Généthon的Cohen及他們的同事們完成了人類基因組中的第一個(gè)完整遺傳連接圖譜.1995年：5～8月，測(cè)序染色新技術(shù)和熱穩(wěn)定聚合酶開(kāi)發(fā)成功；7月，第一個(gè)基因組——流感嗜血桿菌（Haemophilusinfluenzae）的全序列發(fā)表，大小為1.8Mb；9月，日本政府撥款1590萬(wàn)美元，用以資助3個(gè)研究機(jī)構(gòu)從事基因組測(cè)序工作；10月，斯坦福大學(xué)的P.Brown和他的同事們發(fā)表了第一篇關(guān)于完整cDNA探針芯片的論文.1996年：2月，各國(guó)科學(xué)家聚集在百慕大群島召開(kāi)會(huì)議，討論并通過(guò)了數(shù)據(jù)資源共享的問(wèn)題，規(guī)定此后的測(cè)序結(jié)果必須在24小時(shí)內(nèi)傳送到公共數(shù)據(jù)庫(kù)中，這就是著名的百慕大原則；4月，NIH資助6個(gè)研究小組嘗試人類基因組的大規(guī)模測(cè)序；同月，Affymetrix將DNA芯片商品化；10月，釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）的基因組全部測(cè)序完成；11月，RIKEN的Y.Hayashizaki小組完成了第一套小鼠全長(zhǎng)cDNA的測(cè)序.1997年：1月，NCHGR升級(jí)為美國(guó)國(guó)家基因組研究所（NationalHumanGenomeResearchInstitute，NHGRI），DOE也成立了相應(yīng)的聯(lián)合基因組研究所（JointGenomeInstitute）；9月，大腸桿菌（Escherichiacoli）基因組全部測(cè)序完成，全長(zhǎng)5Mb；同月，毛細(xì)管測(cè)序儀出現(xiàn).1998年：1月，NIH公布了一項(xiàng)新計(jì)劃，其目的是在浩如煙海的DNA堿基序列中尋找單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphisms,SNPs）；5月，PEBiosystems公司開(kāi)發(fā)成功PEPrism3700毛細(xì)管測(cè)序儀；同月，Venter宣布成立一個(gè)新公司，取名Celera，并宣稱將在3年內(nèi)，投資3億美元，采用“全基因組鳥槍法”（wholegenomeshotgun）完成人類基因組的全部測(cè)序,同時(shí)Ventor宣布Celera公司的數(shù)據(jù)將不遵從百慕大原則.與此同時(shí)，WellcomeTrust將它對(duì)人類基因組計(jì)劃的投資加倍，達(dá)到了3億3千萬(wàn)美元，以此作為對(duì)Celera公司的回應(yīng).從此，人類基因組測(cè)序在“公”（HGP）與“私”（Celera）之間展開(kāi)了激烈競(jìng)爭(zhēng)；10月，NIH和DOE宣布將在2001年完成人類基因組工作框架圖，并將全部測(cè)序的最后期限從2005年提前到2003年；12月，線蟲（Caenorhabditiselegans）基因組測(cè)序完成.1999年：3月，作為對(duì)Celera公司的應(yīng)戰(zhàn)，NIH再次宣布將人類基因組工作框架圖的完成時(shí)間提前到2000年春季，大規(guī)模的測(cè)序工作主要集中在以下五個(gè)測(cè)序中心：.麻薩諸塞州的Whitehead生物醫(yī)學(xué)研究所、位于圣路易斯的華盛頓大學(xué)、位于休斯敦的Baylor醫(yī)學(xué)院、英國(guó)劍橋的Sanger中心和位于加利福尼亞州DOE下屬的聯(lián)合基因組研究所；4月，10家公司與WellcomeTrust簽署協(xié)議，合作開(kāi)展SNP研究，并計(jì)劃將公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的SNP數(shù)據(jù)每季度更新一次；9月，NIH宣布將在3年內(nèi)投資1億3千萬(wàn)美元，完成小鼠基因組的測(cè)序；12月，英國(guó)、日本和美國(guó)的科學(xué)家們共同完成了第一條人染色體——第22條染色體的全部測(cè)序工作.2000年：3月，Celera公司完成果蠅（Drosophilamelanogaster）基因組（180Mb）的全部測(cè)序工作，在當(dāng)時(shí)所有已測(cè)序的基因組中是最大的，同時(shí)這也證明了“全基因組鳥槍法”的可行性；3月，由于對(duì)數(shù)據(jù)資源共享的政策持不同觀點(diǎn)，HGP與Celera公司的合作計(jì)劃破產(chǎn)；5月，德國(guó)和日本的科學(xué)家公布了人類第21條染色體的測(cè)序結(jié)果；6月26日，這是一個(gè)值得紀(jì)念的日子，HGP與Celera公司的領(lǐng)導(dǎo)人在白宮的慶祝儀式上共同宣布了人類基因組工作框架圖的完成，并約定將雙方的研究成果同時(shí)發(fā)表；12月，第一個(gè)植物基因組——擬南芥（Arabidopsisthaliana）基因組被全部測(cè)序，大小為125Mb.2001年：2月，HGP將自己測(cè)定的人類基因組工作框架圖發(fā)表在《Nature》（2001,409(6822)）上；Celera公司則將它們的成果發(fā)表在《Science》（2001,291(5507)）上.發(fā)表的“工作框架圖”已能覆蓋人類基因組的97%，其中至少92%的序列已組裝得準(zhǔn)確無(wú)誤，并顯示其中只有3萬(wàn)到4萬(wàn)個(gè)編碼蛋白質(zhì)的基因，這是人類基因組研究的一個(gè)重要里程碑.第3頁(yè)/共53頁(yè)HGP取得的成就完成了人類基因組工作草圖繪制,揭示了人類基因組若干細(xì)節(jié)基本上測(cè)定了人類基因組上的堿基序列一些模式生物(果蠅、擬南介等)和作物（如水稻）基因草圖繪制成功，測(cè)序基本完成促進(jìn)了生物信息學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、糖組學(xué)的迅猛發(fā)展人類基因組草圖繪就，中國(guó)科學(xué)家功不可沒(méi)第4頁(yè)/共53頁(yè)華大基因測(cè)序?qū)嶒?yàn)室NationalCenterforHumanGenomeResearch(NCHGR)楊煥明，基因組學(xué)家。中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所研究員。1952年10月生于浙江溫州樂(lè)清市，籍貫浙江樂(lè)清。1978年畢業(yè)于原杭州大學(xué)(現(xiàn)浙江大學(xué))，1982年于原南京鐵道醫(yī)學(xué)院(現(xiàn)東南大學(xué))獲碩士學(xué)位，1988年獲丹麥哥本哈根大學(xué)博士學(xué)位，2007年12月27日，當(dāng)選為中國(guó)科學(xué)院院士。曾任中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所所長(zhǎng)。第5頁(yè)/共53頁(yè)第一節(jié)人類基因組計(jì)劃人類基因組計(jì)劃主要內(nèi)容包括繪制人類基因組的4張圖，即遺傳(連鎖)圖、物理圖、DNA序列圖和轉(zhuǎn)錄圖。1.遺傳圖(geneticmap)

遺傳圖又稱連鎖圖(linkagemap)是指基因或DNA標(biāo)記(如多態(tài)性遺傳標(biāo)記)在染色體上以遺傳距離表示相對(duì)位置的圖。遺傳距離通常以基因或DNA片段在染色體交換過(guò)程中分離的頻率--厘摩(cM)來(lái)表示。

第6頁(yè)/共53頁(yè)第7頁(yè)/共53頁(yè)分子生物學(xué)技術(shù)在遺傳標(biāo)記上的應(yīng)用：RFLP：限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。DNA序列上的微小變化，甚至1個(gè)核苷酸的變化，也能引起限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)的丟失或產(chǎn)生，導(dǎo)致酶切片段長(zhǎng)度的變化。多態(tài)性限制性位點(diǎn)DNA(等位基因1)DNA(等位基因2)加入限制性內(nèi)切酶4個(gè)片段3個(gè)片段*第8頁(yè)/共53頁(yè)小衛(wèi)星標(biāo)記和微衛(wèi)星標(biāo):

有大量的重復(fù)序列存在于人類基因組中，包括重復(fù)單位長(zhǎng)度在15-65個(gè)核苷酸的小衛(wèi)星DNA(minisatelliteDNAlabel)，重復(fù)單位長(zhǎng)度在2-6個(gè)核苷酸的微衛(wèi)星DNA(microsatelliteDNAlabel)，后者又稱為簡(jiǎn)短串連重復(fù)(shottandemrepeatpolymorphism,STR)。第9頁(yè)/共53頁(yè)SNP：?jiǎn)魏塑账岬亩鄳B(tài)性。DNA遺傳標(biāo)記，可能也是最好的遺傳標(biāo)記，是分散于基因組中的單個(gè)堿基的差異。這種差異包括單個(gè)堿基的缺失和插入，但更常見(jiàn)到是單個(gè)核苷酸的替換，即單核苷酸的多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)。第10頁(yè)/共53頁(yè)第11頁(yè)/共53頁(yè)第12頁(yè)/共53頁(yè)2.物理圖(physicalmap)

物理圖指表示DNA序列上DNA標(biāo)記之間實(shí)際距離的圖。通常由DNA的限制酶片段或克隆的DNA片段有序排列而成。標(biāo)記之間的物理距離以DNA上核苷酸數(shù)目的多少(kb，表示千堿基對(duì)，或Mb，1Mb=1000kb)來(lái)表示。第13頁(yè)/共53頁(yè)

遺傳圖所表現(xiàn)的，是通過(guò)連鎖分析確定的各基因間的相對(duì)位置；物理圖則表現(xiàn)染色體上每個(gè)DNA片段的實(shí)際順序。物理圖是指以已知核苷酸序列的DNA片段（序列標(biāo)簽位點(diǎn)，sequence-taggedsite，STS）為“路標(biāo)”，以堿基對(duì)（bp，kb，Mb）作為基本測(cè)量單位（圖距）的基因組圖。PCR

現(xiàn)在的測(cè)序技術(shù)還不能對(duì)整個(gè)DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定，因此須先將它切成一個(gè)個(gè)大小不同的片段，然后將這些片段連起來(lái)，構(gòu)成連續(xù)的序列。切割的工具，是一類限制性內(nèi)切核酸酶，它能識(shí)別DNA中的特定序列，并在該位點(diǎn)對(duì)DNA鏈進(jìn)行切割。有一類稀有的限制性內(nèi)切核酸酶，由于DNA中這樣的序列比較少，所以用它可將DNA分子切割成約100萬(wàn)堿基大小的大片斷。這樣的片段有利于排序，不過(guò)必須用脈沖場(chǎng)凝膠電泳法，才能將它們分開(kāi)。2.物理圖（PhysicalMap）第14頁(yè)/共53頁(yè)第15頁(yè)/共53頁(yè)基因組測(cè)序

一次測(cè)序一般只能測(cè)定1000堿基對(duì)，然后用已知序列的下游部分合成引物，進(jìn)行另一次測(cè)序，如此一步步地“步行”，逐步完成較大片段的測(cè)序。因此，需先用質(zhì)粒建立許多克隆，構(gòu)成質(zhì)粒文庫(kù)，再對(duì)這些質(zhì)?？寺∵M(jìn)行測(cè)序，然后用電腦搭配成鄰接克隆群。

由于自動(dòng)化和電腦的應(yīng)用，現(xiàn)在一天已可進(jìn)行10萬(wàn)個(gè)測(cè)序反應(yīng)。華盛頓大學(xué)、貝勒醫(yī)學(xué)院等機(jī)構(gòu)，均已完成幾百萬(wàn)到幾千萬(wàn)堿基對(duì)的測(cè)序，錯(cuò)誤率僅萬(wàn)分之一，測(cè)序速度和準(zhǔn)確性已大大提高。2.物理圖（PhysicalMap）第16頁(yè)/共53頁(yè)第17頁(yè)/共53頁(yè)3.轉(zhuǎn)錄圖(expressionprofiling)

在整個(gè)人類基因組中，只有1%～5%的DNA序列為編碼序列。在人體某一特定組織的細(xì)胞中，一般只有10%的基因是表達(dá)的。如果能把某段DNA序列相應(yīng)的mRNA確定下來(lái)，就抓住了基因的主要部分，即可轉(zhuǎn)錄部分。所以，一張人類基因組的轉(zhuǎn)錄圖，即cDNA圖或表達(dá)序列圖，EST)才是人類基因圖的雛形。用已在染色體定位的YACDNA或BACDNA為探針，與所有可能相關(guān)的各組織cDNA文庫(kù)雜交，尋找其同源克隆并做進(jìn)一步分析。第18頁(yè)/共53頁(yè)4.序列圖(humangenomesequence)

序列圖是指整個(gè)人類基因組的核苷酸序列圖，也是最詳盡的物理圖。測(cè)定的總長(zhǎng)度約為1m。由30億個(gè)核苷酸對(duì)組成的序列圖就是人類基因組計(jì)劃。因此，這一“代表性人類個(gè)體”的基因與序列，在理論上可以代表全人類的基因組信息，在實(shí)際意義上可用于任何個(gè)體的基因診斷、基因分析。既包括可轉(zhuǎn)錄序列，也包括非轉(zhuǎn)錄序列，是轉(zhuǎn)錄序列、調(diào)節(jié)序列和功能未知序列的總和。第19頁(yè)/共53頁(yè)第二節(jié)人工染色體構(gòu)建

酵母人工染色體(YeastArtificialChromosome,YAC)為創(chuàng)制基因組物理圖譜提供了極大的方便。YAC是迄今容量最大的克隆載體，插入片段平均長(zhǎng)度為500-1000kb，最大可以達(dá)到2Mb。

自主復(fù)制序列：ARS序列(autonomousreplicationsequence)著絲粒序列:CEN序列(centromericsequences)端粒序列：TEL序列(telomeresequence)第20頁(yè)/共53頁(yè)第二節(jié)人工染色體構(gòu)建

人工染色體含有三種必需成分：著絲粒(CEN)：位于染色體中央，呈紐扣狀結(jié)構(gòu)，在有絲分裂時(shí)結(jié)合微管并調(diào)控染色體的運(yùn)動(dòng)，也是姐妹染色單體配對(duì)時(shí)的最后位點(diǎn)，接收細(xì)胞信號(hào)而使姐妹染色體分開(kāi)。

端粒（TEL）：主要功能是防止染色體融合、降解、確保其完整復(fù)制。端粒酶以其自身RNA為模板，在染色體端部添加上端粒重復(fù)序列，并參與端粒長(zhǎng)度和細(xì)胞增殖的調(diào)控。第21頁(yè)/共53頁(yè)第二節(jié)人工染色體構(gòu)建第22頁(yè)/共53頁(yè)復(fù)制起點(diǎn)：DNA復(fù)制通常由起始蛋白與特定的DNA序列相互作用開(kāi)始。DNA合成的起始位點(diǎn)和DNA復(fù)制起點(diǎn)(遺傳位點(diǎn))所需的Cis靶區(qū)常位于同一段長(zhǎng)約100bp的DNA上。第二節(jié)人工染色體構(gòu)建第23頁(yè)/共53頁(yè)第二節(jié)人工染色體構(gòu)建第24頁(yè)/共53頁(yè)第二節(jié)人工染色體構(gòu)建第25頁(yè)/共53頁(yè)YAC的主要缺點(diǎn)1．存在高比例的嵌合體，即一個(gè)YAC克隆含有兩個(gè)本來(lái)不相連的獨(dú)立片段；2．部分克隆子不穩(wěn)定，在轉(zhuǎn)代培養(yǎng)中可能會(huì)發(fā)生缺失或重排；3．難與酵母染色體區(qū)分開(kāi)，因?yàn)閅AC與酵母染色體具有相似的結(jié)構(gòu)。4．操作時(shí)容易發(fā)生染色體機(jī)械切割。第二節(jié)人工染色體構(gòu)建第26頁(yè)/共53頁(yè)

以細(xì)菌寄主系統(tǒng)(BAC)為基礎(chǔ)的克隆載體形成嵌合體的頻率較低，轉(zhuǎn)化效率高，又易于分離。科學(xué)家用"染色體建造"法用F質(zhì)粒及其調(diào)控基因構(gòu)建細(xì)菌載體，克隆大片段DNA。該質(zhì)粒主要包括oriS，repE（控制F質(zhì)粒復(fù)制）和parA、parB（控制拷貝數(shù)）等成分。第二節(jié)人工染色體構(gòu)建第27頁(yè)/共53頁(yè)第二節(jié)人工染色體構(gòu)建細(xì)菌人工染色體的構(gòu)建riS和repE控制F質(zhì)粒的復(fù)制parA和parB控制質(zhì)粒拷貝數(shù)第28頁(yè)/共53頁(yè)BAC的優(yōu)點(diǎn)

1．易于用電擊法轉(zhuǎn)化E.coli（轉(zhuǎn)化效率比轉(zhuǎn)化酵母高10-100倍）；

2．超螺旋環(huán)狀載體，易于操作；

3．F質(zhì)粒本身所帶的基因控制了質(zhì)粒的復(fù)制；

4．很少發(fā)生體內(nèi)重排。第二節(jié)人工染色體構(gòu)建第29頁(yè)/共53頁(yè)

此外，有人把人類染色體端粒DNA上單個(gè)α-衛(wèi)星DNA單元多聚化形成1Mb左右的大片段并與人類基因組DNA混合，產(chǎn)生了能被復(fù)制、能正常分裂并得到長(zhǎng)期穩(wěn)定保存的人工合成的染色體，長(zhǎng)度約為6-10Mb，稱為MAC（哺乳類人工染色體）。第二節(jié)人工染色體構(gòu)建第30頁(yè)/共53頁(yè)第三節(jié)全基因組鳥槍法測(cè)序第31頁(yè)/共53頁(yè)第三節(jié)全基因組鳥槍法測(cè)序全基因組鳥槍法測(cè)序的主要步驟：

第一、建立高度隨機(jī)、插入片段大小為2kb左右的基因組文庫(kù)。

第二、高效、大規(guī)模的末端測(cè)序。對(duì)文庫(kù)中每一個(gè)克隆，進(jìn)行兩端測(cè)序。

第三、序列集合。開(kāi)發(fā)軟件，盡量排除錯(cuò)誤的連鎖匹配。

第四、填補(bǔ)缺口。有兩種待填補(bǔ)的缺口，一是沒(méi)有相應(yīng)模板DNA的物理缺口，二是有模板DNA但未測(cè)序的序列缺口。第32頁(yè)/共53頁(yè)第三節(jié)全基因組鳥槍法測(cè)序鳥槍法測(cè)序的缺點(diǎn)

隨著所測(cè)基因組總量增大，所需測(cè)序的片段大量增加，各個(gè)片段重疊或一個(gè)連續(xù)體的概率是2n2-2n；高等真核生物（如人類）基因組中有大量重復(fù)序列，導(dǎo)致判斷失誤。第33頁(yè)/共53頁(yè)第三節(jié)全基因組鳥槍法測(cè)序第34頁(yè)/共53頁(yè)

鳥槍法測(cè)序不能鑒別高等真核生物基因組中的重復(fù)序列第35頁(yè)/共53頁(yè)第三節(jié)全基因組鳥槍法測(cè)序?qū)B槍法的改進(jìn)

(1)Clonecontig法。首先用稀有內(nèi)切酶把待測(cè)基因組降解為數(shù)百kb以上的片段，再分別測(cè)序。

(2)靶標(biāo)鳥槍法(diretedshotgun)。首先根據(jù)染色體上已知基因和標(biāo)記的位置來(lái)確定部分DNA片段的相對(duì)位置，再逐步縮小各片段之間的缺口。第36頁(yè)/共53頁(yè)改進(jìn)后的鳥槍法測(cè)序原理圖第37頁(yè)/共53頁(yè)基因組的序列主要分為3類通過(guò)比較確知其生理功能的；在數(shù)據(jù)庫(kù)中有匹配的蛋白質(zhì)序列，但不知道功能的；在現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有匹配的蛋白質(zhì)序列的新基因。第四節(jié)比較基因組學(xué)

比較基因組學(xué)（comparativegenomics）是通過(guò)對(duì)一種生物相關(guān)基因的認(rèn)識(shí)來(lái)理解、詮釋甚至克隆分離另一種生物的基因第38頁(yè)/共53頁(yè)第四節(jié)比較基因組學(xué)1.通過(guò)基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行全局性分析數(shù)據(jù)存放。堿基百分含量分析。無(wú)論是GC富含區(qū)還是AT富含區(qū)，都可能是一些特殊功能的區(qū)域。ORF分析。首先要用多個(gè)不同的軟件來(lái)要找到并估測(cè)基因組中的每一個(gè)ORF。

開(kāi)放閱讀框（ORF，Openreadingframe）是基因序列的一部分，包含一段可以編碼蛋白的堿基序列，一個(gè)起始和終止密碼子之間的序列。第39頁(yè)/共53頁(yè)部分典型真核和原核生物基因組成成分分析第40頁(yè)/共53頁(yè)人基因組片段分析第41頁(yè)/共53頁(yè)人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中蛋白質(zhì)編碼基因的部分重要參數(shù)比較性質(zhì)平均值外顯子（內(nèi)源性）長(zhǎng)度/bp外顯子（內(nèi)源性）個(gè)數(shù)內(nèi)含子長(zhǎng)度/bp3’非翻譯區(qū)（UTR）5’非翻譯區(qū)（UTR）開(kāi)放閱讀框（ORF）長(zhǎng)度/bp核基因長(zhǎng)度/kb1458.83365770300134027第42頁(yè)/共53頁(yè)物種完成年份總長(zhǎng)度/Mp已完成總長(zhǎng)的百分?jǐn)?shù)/%占常染色質(zhì)百分?jǐn)?shù)/Mb基因數(shù)/Mb酵母19961293100483線蟲19989699100197果蠅20001166497117擬南芥200011592100221人類第21染色體200034751007人類第22染色體199934709716人類全基因組(PublicSequence)20012693849012人類全基因組(CeleraSequence)200126548399-9315基本完成DNA序列分析的真核生物基因組比較第43頁(yè)/共53頁(yè)不同物種中單拷貝基因的數(shù)量及占基因總數(shù)比較物種單拷貝基因個(gè)數(shù)單拷貝基因占基因總量的%流感嗜血桿菌酵母果蠅線蟲擬南芥1587510510736141771160188.871.472.555.235.0第44頁(yè)/共53頁(yè)第四節(jié)比較基因組學(xué)2.通過(guò)基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較基因組研究尿殖道