干擾素的工藝制備流程

1什么是干擾素概念(interferon,IFN)：機體免疫細胞產(chǎn)生的一類細胞因子，是機體受到病毒感染時，免疫細胞通過抗病毒應(yīng)答反應(yīng)而產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似、功能接近的生物調(diào)節(jié)蛋白。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和抗原性的差異分為α、β、γ、ω等4個類型。當(dāng)前1頁，總共33頁。1.1天然干擾素的分類

1.

根據(jù)來源、基因序列和氨基酸組成分類

◆

I型干擾素：IFNα、IFNβ、IFNτ、IFNω

來源：白細胞、成纖維細胞、病毒感染的組織細胞等功能：抗病毒感染、抗腫瘤生長、免疫調(diào)節(jié)(較弱）

其中IFN-α為多基因產(chǎn)物，有23種以上的亞型。

◆

II型干擾素：干擾素γ（IFN)

來源：活化的T細胞和NK細胞產(chǎn)生功能：免疫調(diào)節(jié)

當(dāng)前2頁，總共33頁。

提高單核巨噬細胞、樹突狀細胞的抗原提呈能力

增強Tc細胞和NK細胞的殺傷活性

抑制TH2細胞形成，下調(diào)體液免疫應(yīng)答

趨化作用

抗病毒和抗腫瘤作用（次要）

2.

根據(jù)動物來源確定分類

人干擾素（HuIFN），小鼠干擾素（MuIFN）。

當(dāng)前3頁，總共33頁。不同來源的干擾素當(dāng)前4頁，總共33頁。1.2重組干擾素的臨床應(yīng)用廣譜抗病毒活性（rhuIFNα）慢性乙型、丙型、丁型肝炎；皰疹、病毒性角膜炎。直接抗腫瘤活性（rhuIFNα）毛細胞和慢性髓樣白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。免疫調(diào)節(jié)活性——治療慢性肉芽腫瘤（rhuIFNγ）多發(fā)性硬化癥rhuIFNβ當(dāng)前5頁，總共33頁。2基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝當(dāng)前6頁，總共33頁。干擾素生產(chǎn)工藝路線上市產(chǎn)品：重組人干擾素rhuIFN1986，rhuIFNα-2a，rhuIFNα-2b；

1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b；

2001－2002：PEG化IFN，PEG-Intron,Pegasys

表達產(chǎn)物：無糖基化，N-met，無活性包涵體工藝特點：發(fā)酵過程，隨后變性、復(fù)性過程?；蚬こ檀竽c桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝:當(dāng)前7頁，總共33頁。目的基因的分離克隆載體目的基因與克隆載體的體外重組→重組體導(dǎo)入大腸桿菌K12→受體菌的培養(yǎng)及篩選→從受體菌中獲取目的基因表達載體重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌受體菌的篩選，表達性、穩(wěn)定性等檢測工程菌→基因工程菌的制備當(dāng)前8頁，總共33頁。一、目的基因的分離與擴增1.破碎細胞，用Trizol法提取總的RNA2.將生產(chǎn)干擾素的人白細胞的mRNA分級分離然后進行凝膠電泳切取目的基因片段3.用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄，把總mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA4.以cDNA為模板、干擾素引物為引物，PCR，得到完全的干擾素基因的PCR產(chǎn)物5.人工加尾形成“粘性末端”當(dāng)前9頁，總共33頁。二、構(gòu)建重組質(zhì)粒1.提取載體（質(zhì)粒、病毒等），雙酶切，再把干擾素基因的PCR產(chǎn)物用相應(yīng)的酶酶切，用連接酶連接EcoRIBamHIEcoRIBamHI2.連接完成后分離純化，測序，與原干擾素序列比對。3.鑒定序列無誤后，導(dǎo)入受體細胞，篩選當(dāng)前10頁，總共33頁。三、重組體引入宿主細胞

將cDNA克隆到含有四環(huán)素、氨芐青霉素抗性基因的質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，重組的載體DNA分子在一定條件下轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，形成攜帶質(zhì)粒的菌株。當(dāng)前11頁，總共33頁。四、受體菌的篩選

由于質(zhì)粒重組時有3種基本方式，即：目的基因與克隆載體重組，目的基因片段與目的基因片段重組，克隆載體與克隆載體重組；另外重組過程可能會發(fā)生基因突變情況當(dāng)前12頁，總共33頁。五、分析保存

對基因工程大腸桿菌進行評價分析，并保存菌種。當(dāng)前13頁，總共33頁。干擾素的發(fā)酵工藝過程啟開種子制備種子液發(fā)酵培養(yǎng)粗提精提半成品制備半成品檢定分裝凍干成品檢定成品包裝當(dāng)前14頁，總共33頁。1．菌種培養(yǎng)?。?0℃下保存的甘油管菌種（工作種子批），于室溫下融化。然后，接入搖瓶，培養(yǎng)溫度30℃，pH7.0，250r/min活化培養(yǎng)18±2小時后，進行吸光值測定和發(fā)酵液雜菌檢查。2．種子罐培養(yǎng)將已活化的菌種接入裝有30L培養(yǎng)基的種子罐中，接種量10%，培養(yǎng)溫度30℃，pH7.0，級聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，控制溶解氧為30%，培養(yǎng)3～4小時，轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中，同時取樣發(fā)酵液進行顯微鏡檢查和LB培養(yǎng)基劃線檢查，控制雜菌

當(dāng)前15頁，總共33頁。3.發(fā)酵罐培養(yǎng)將種子液通入300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量10%，培養(yǎng)溫度30℃，pH7.0。級聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，控制溶解氧30%，培養(yǎng)4小時。然后控制培養(yǎng)溫度20℃，pH6.0，溶解氧60%，繼續(xù)培養(yǎng)5～6.5小時。同時進行發(fā)酵液雜菌檢查，當(dāng)OD值達9.0±1.0后，用5℃冷卻水快速降溫至15℃以下，以減緩細胞衰老?；蛘邔l(fā)酵液轉(zhuǎn)入收集罐中，加入冰塊使溫度迅速降至10℃以下。4.菌體收集將已降溫的發(fā)酵液轉(zhuǎn)入連續(xù)流離心機，16000r/min離心收集。進行干擾素含量、菌體蛋白含量、菌體干燥失重、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)一致性、質(zhì)粒穩(wěn)定性等項目的檢測。菌體于－20℃冰柜中保存時，不得超過12個月。每保存3個月，檢查一次活性。當(dāng)前16頁，總共33頁。3.干擾素的分離純化工藝過程

3.1、干擾素分離工藝過程3.2、干擾素的純化工藝過程當(dāng)前17頁，總共33頁。3.1干擾素分離工藝過程菌體裂解預(yù)處理初級分離當(dāng)前18頁，總共33頁。(1)菌體裂解

裂解緩沖液：純化水配制，2℃～10℃（pH7.5）使用保護劑：EDTA，PMSF。破碎菌體：2厘米以下的碎塊攪拌：加裂解緩沖液，2℃～10℃，2hr凍融:細胞完全破裂，釋放干擾素。當(dāng)前19頁，總共33頁。(2)預(yù)處理-沉淀加絮凝劑聚乙烯亞胺:2℃～10℃，攪拌45min，對菌體碎片進行絮凝。加凝聚劑醋酸鈣溶液:2℃～10℃,攪拌15min，對菌體碎片、DNA等進行沉淀。當(dāng)前20頁，總共33頁。(3)離心

連續(xù)流離心機：2℃～10℃，16000r/min收集上清液：含有重組干擾素蛋白質(zhì)雜質(zhì)沉淀：121℃、30min蒸汽滅菌,焚燒處理。當(dāng)前21頁，總共33頁。（4）初級分離

鹽析:硫酸銨，2℃～10℃，攪勻,靜置過夜。離心：連續(xù)流離心機，16000r/min保存：收集沉淀，粗干擾素，4℃保存。當(dāng)前22頁，總共33頁。3.2、干擾素純化工藝過程溶解粗干擾素沉淀與疏水層析陰離子交換層析與濃縮陽離子交換層析與濃縮凝膠過濾層析無菌過濾分裝當(dāng)前23頁，總共33頁。(1)溶解粗干擾素

配制純化緩沖液：超純水，pH7.5磷酸緩沖液，0.45μm濾器和10ku超濾系統(tǒng)，百級層流下收集。冷卻至2℃～10℃。檢查:緩沖液的pH值和電導(dǎo)值。溶解：2℃～10℃，勻漿，完全溶解。當(dāng)前24頁，總共33頁。(2)沉淀與疏水層析

等電點沉淀（1）：磷酸調(diào)節(jié)至pH5.0，沉淀雜蛋白，離心收集上清液。疏水層析：干擾素吸附在疏水層析柱中

除非疏水性蛋白

洗脫與收集：0.01M磷酸緩沖液（pH8.0）當(dāng)前25頁，總共33頁。等電點沉淀（2）：磷酸調(diào)節(jié)pH4.5，調(diào)節(jié)電導(dǎo)值40ms/cm，2℃～10℃，靜置過夜超濾：1000ku超濾膜過濾，除去大蛋白。透析除鹽：調(diào)整溶液pH8.0，電導(dǎo)值，10ku超濾膜，0.005M緩沖液。當(dāng)前26頁，總共33頁。(3)無菌過濾分裝0.22μm濾膜過濾干擾素溶液分裝－20℃以下的冰箱中保存。當(dāng)前27頁，總共33頁。(4)檢測項目

干擾素鑒別試驗干擾素效價測定蛋白質(zhì)含量，純度測定，分子量宿主殘余蛋白、殘余DNA干擾素結(jié)構(gòu)鑒定：紫外光譜，肽譜，N端序列其他：熱原，內(nèi)毒素，殘留抗生素當(dāng)前28頁，總共33頁。半成品檢定（1）效價測定

用細胞病變抑制法，以Wish細胞、VSV病毒為基本檢測系統(tǒng)，測定中必須用國家或國際參考品校準為國際單位。（2）蛋白質(zhì)含量測定福林-酚法，以中國藥品生物制品檢定所提供的標準蛋白為標準。（3）比活性效價的國際單位與蛋白質(zhì)含量的毫克數(shù)之比。（4）純度電泳純度用非還原型SDS法，銀染顯色應(yīng)為單一區(qū)帶，經(jīng)掃描儀測定純度應(yīng)在95%以上。當(dāng)前29頁，總共33頁。（5）相對分子量測定還原型SDS，加樣量不地域微克，同時用已知相對分子量的蛋白標準系列做對照，以遷移率為橫坐標，相對分子量的對數(shù)為縱坐標作圖，計算相對分子量。與理論值比較，誤差不得高于10%。（6）殘余外源性DNA含量測定用放射性核素或生物素探針法測定，每劑量中殘余外源性DNA應(yīng)低于100pg。（7）殘余血清IgG含量測定在應(yīng)用抗體親和層析法作為純化方法時必須進行此項檢定。（8）殘余抗生素活性測定半成品中不應(yīng)有抗生素活性存在。當(dāng)前30頁，總共33頁。（9）紫外光譜掃描

檢查半成品的光譜吸收值，最大吸收值應(yīng)在280±2納米。（10）肽圖測定用CNBr裂解法，測定結(jié)果應(yīng)符合干擾素的結(jié)構(gòu)，且批與批之間應(yīng)一致。（11）等電點測定等電聚焦電泳。（12）除菌半成品應(yīng)做干擾素效價測定、無菌試驗和熱源質(zhì)試驗。當(dāng)前31頁，總共33頁。成品檢定（1）物理性狀凍干品白色或微黃色疏松體，加入注射水后不得含有肉眼可見不溶物。（2）鑒別試驗應(yīng)用ELISA或中和試驗檢定。（3）水分測定用卡氏法，應(yīng)低于3%。（4）無菌試驗同半成品。當(dāng)前32頁，總共33頁。（5）熱原質(zhì)試驗