實(shí)驗(yàn)五微生物培養(yǎng)基配制與滅菌

一.培養(yǎng)基：微生物生存的環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)1.基本成分：碳源、氮源、水、無機(jī)鹽2.特殊營養(yǎng)：維生素、生長因子等（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）3.pH、氧氣的需求：細(xì)菌：；

放線菌：；真菌：。4.種類：固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基有無凝固劑瓊脂分離鑒定工業(yè)生產(chǎn)化學(xué)成分：物理性質(zhì)：天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基當(dāng)前1頁，總共73頁。微生物培養(yǎng)基的配制與滅菌當(dāng)前2頁，總共73頁。目的要求1.明確培養(yǎng)基的配制原理和方法，掌握其配制的一般方法和步驟。2.了解幾種滅菌方法，掌握干熱滅菌法和加壓蒸汽滅菌法的原理及其使用方法。3.熟悉分離、培養(yǎng)微生物前的有關(guān)準(zhǔn)備工作及操作方法。（預(yù)習(xí)）當(dāng)前3頁，總共73頁。培養(yǎng)基配制原則⑴目的明確：⑵營養(yǎng)全面、濃度適宜、比例恰當(dāng)⑶適宜的pH值：有機(jī)碳源異養(yǎng)型：根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的選擇原料自養(yǎng)型：不加碳源加入緩沖劑細(xì)菌偏堿，真菌偏酸（CO2碳源）生產(chǎn)科研當(dāng)前4頁，總共73頁。培養(yǎng)基的配制方法和步驟稱量：按照配方正確稱取各種原料放于搪瓷杯中。溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒攪勻，溶解。調(diào)pH值：用1NNaOH或1NHCl調(diào)pH，用pH試紙對照。加瓊脂溶化：加熱過程中要不斷攪拌，可適當(dāng)補(bǔ)水。過濾分裝包扎，掛上標(biāo)簽（滅菌指示條），注明何種培養(yǎng)基和配制時(shí)間。滅菌：1210C20min倒置平板檢查：培養(yǎng)基滅菌后必須在370C下恒溫培養(yǎng)24h，確定無菌生長，方可使用。按培養(yǎng)基

配方稱量加水加

熱熔化調(diào)節(jié)

pH值過濾分裝

包裝滅菌檢查滅菌

徹底與否當(dāng)前5頁，總共73頁。培養(yǎng)基的配制和滅菌過程中的注意事項(xiàng)1.蛋白胨很易吸濕，在稱取時(shí)動(dòng)作要迅速。3.在瓊脂溶化過程中，應(yīng)控制火力，以免培養(yǎng)基因沸騰而溢出容器。同時(shí)，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底燒焦，配制培養(yǎng)基時(shí)，不可用銅或鐵鍋加熱溶化，以免離子進(jìn)入培養(yǎng)基中，影響細(xì)菌生長。4.pH不要調(diào)過頭，以免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。5.分裝過程中，注意不要使培養(yǎng)基沾在管（瓶）口上以免引起污染。2.稱藥品時(shí)嚴(yán)防藥品混雜，一把牛交匙用于一種藥品，或稱取一種藥品后，洗凈，擦干，再稱取另一藥品。瓶蓋也不要蓋錯(cuò)。當(dāng)前6頁，總共73頁。培養(yǎng)基配制

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器材培養(yǎng)基、玻璃器皿天平秤、藥匙當(dāng)前7頁，總共73頁。培養(yǎng)基的配制

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裝水以量桶裝取適當(dāng)量蒸餾水于玻璃容器中于玻璃容器上標(biāo)示培養(yǎng)基名稱當(dāng)前8頁，總共73頁。培養(yǎng)基配制–

秤藥放上秤藥紙并歸零以秤藥匙舀出適當(dāng)量培養(yǎng)基(請看培養(yǎng)基罐上說明)當(dāng)前9頁，總共73頁。培養(yǎng)基配制–

溶解培養(yǎng)基傾倒培養(yǎng)基時(shí)小心不要沾到玻璃壁上當(dāng)前10頁，總共73頁。注意事項(xiàng)–

配藥結(jié)束清理配藥桌面與天平清洗秤藥匙，擦干放回藥品放回藥品柜當(dāng)前11頁，總共73頁。培養(yǎng)基配制–

分裝調(diào)整分注器(Dispensette)

刻度分裝試管蓋上試管蓋當(dāng)前12頁，總共73頁。6.在使用高壓蒸氣滅菌鍋滅菌時(shí)，滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除是否完全極為重要，因?yàn)榭諝獾呐蛎泬捍笥谒魵獾呐蛎泬海?，?dāng)水蒸氣中含有空氣時(shí)，在同一壓力下，含空氣蒸氣的溫度低于飽和蒸氣的溫度。不能滅菌的物質(zhì)：

1.爆炸性物質(zhì)硝化丙烷、硝化甘油、硝化纖維，含氮硅酯。三硝基苯、三硝基甲苯、苦味酸、和其它爆炸性含氮復(fù)合物。過醋酸、過氧化甲乙酮、過氧化苯甲酰和其它過氧化有機(jī)物。

2.lgnitable物質(zhì)金屬鋰、鉀、鈉、黃磷、氧化硫，和紅磷。培養(yǎng)基的配制和滅菌過程中的注意事項(xiàng)當(dāng)前13頁，總共73頁。實(shí)驗(yàn)室的常用培養(yǎng)基：細(xì)菌：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；放線菌：高氏1號(hào)合成培養(yǎng)基培養(yǎng)；酵母菌：麥芽汁培養(yǎng)基；霉菌：查氏合成培養(yǎng)基；當(dāng)前14頁，總共73頁。牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基:用于分離和培養(yǎng)細(xì)菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，又稱天然培養(yǎng)基。

配方如下：牛肉膏3g蛋白胨10g氯化鈉5g瓊脂20g自來水1000mLpH7.2~7.4當(dāng)前15頁，總共73頁。淀粉瓊脂培養(yǎng)基（高氏一號(hào)），用于分離和培養(yǎng)放線菌，是一種合成培養(yǎng)基。配方如下：

可溶性淀粉20.0gKNO31.0gK2HPO40.5gMgSO4?7H2O0.5gNaCl0.5gFeSO4?7H2O0.01g瓊脂20g自來水1000mLpH7.4－7.6當(dāng)前16頁，總共73頁。查氏培養(yǎng)基，用于分離和培養(yǎng)霉菌，是一種合成培養(yǎng)基。配方如下：

NaNO32.0gK2HPO41.0gKCl0.5gMgSO40.5gFeSO40.01g

蔗糖30g

瓊脂20g自來水1000mLpH自然當(dāng)前17頁，總共73頁。LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基1000mlLB培養(yǎng)基的配方H2O定容至1000mL胰蛋白胨(Tryptone)10g氯化鈉（NaCl）10g瓊脂（agar）15g酵母提取物(Yeast

extract)5g

20g當(dāng)前18頁，總共73頁。YPD培養(yǎng)基foryeast1000mlYPD培養(yǎng)基的配方H2O定容至1000mL蛋白胨(peptone)20g瓊脂（agar）20g酵母提取物(Yeast

extract)10g

葡萄糖1-2%當(dāng)前19頁，總共73頁。耐高溫需保持干燥的物品，160～170℃1-2小時(shí)接種環(huán)、接種針等金屬用具70~75℃、30min80℃、15min100℃、5~6min消毒滅菌定義方法較為溫和理化方法，殺死部分有害菌體（不包括芽孢、孢子）強(qiáng)烈的理化方法，殺死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法巴氏消毒法化學(xué)藥劑紫外線灼燒滅菌干熱滅菌酒精、氯氣、石炭酸等高壓蒸汽滅菌培養(yǎng)基，100KPa、121℃、15～30min二.無菌技術(shù)：防止外來雜菌的污染1.消毒與滅菌：當(dāng)前20頁，總共73頁。濕熱滅菌的優(yōu)點(diǎn)濕熱滅菌法菌體吸收水分蛋白質(zhì)較易凝固濕熱的穿透力比干熱大，水的傳熱能力比許多非導(dǎo)體的固體強(qiáng)濕熱的蒸汽有潛熱存在，1g水在100℃由氣態(tài)變?yōu)橐后w態(tài)可放出2.26kJ，可增強(qiáng)滅菌效果當(dāng)前21頁，總共73頁。培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法當(dāng)前22頁，總共73頁。當(dāng)前23頁，總共73頁。放入殺菌鍋

(Autoclave)

滅菌培養(yǎng)基配制–

滅菌當(dāng)前24頁，總共73頁。加水蓋過鐵板放東西關(guān)門調(diào)整溫度時(shí)間關(guān)緊泄壓閥注意事項(xiàng)–

殺菌鍋的使用當(dāng)前25頁，總共73頁。注意事項(xiàng)–

殺菌釜使用滅菌結(jié)束后，等壓力降回零時(shí)才可打開門進(jìn)入殺菌釜之物品，蓋子不可關(guān)太緊或太松當(dāng)前26頁，總共73頁。注意事項(xiàng)–

殺菌釜使用拿滅菌后物品請記得帶耐熱手套當(dāng)前27頁，總共73頁。培養(yǎng)基配制–

平板培養(yǎng)基滅過菌之固態(tài)培養(yǎng)基于無菌操作臺(tái)(Laminarflow)內(nèi)倒制平板培養(yǎng)基(Plate)日光燈UV燈風(fēng)扇當(dāng)前28頁，總共73頁。培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法當(dāng)前29頁，總共73頁。培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法當(dāng)前30頁，總共73頁。間歇滅菌法：待滅菌的物品放在滅菌器或蒸籠里，每天蒸煮1次，每次煮沸1h，連續(xù)3d重復(fù)進(jìn)行。在每兩次蒸煮之間，將物品（指培養(yǎng)基）放在370C恒溫條件下培養(yǎng)過夜，這樣可以使每次蒸煮后未殺死殘留的芽孢萌發(fā)成營養(yǎng)體，以便下次蒸煮時(shí)殺滅。培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法當(dāng)前31頁，總共73頁。過濾除菌法：不能用加熱滅菌的液體物質(zhì)（如維生素、血清），一般可用細(xì)菌過濾器進(jìn)行除菌。培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法當(dāng)前32頁，總共73頁。紫外線滅菌法：一般30W燈管，9m3空間，距地面2m每次打開紫外線照射0.5h，就使室內(nèi)空氣滅菌。若照射紫外線時(shí)先噴灑石炭酸等化學(xué)消毒劑，可增強(qiáng)滅菌效果。紫外線雖有較強(qiáng)的殺菌力，但穿透力弱，即使一薄層玻璃或水層就能將大部分紫外線濾除，因此只適用于空氣及表面殺菌。培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法當(dāng)前33頁，總共73頁?；瘜W(xué)藥劑消毒滅菌：微生物實(shí)驗(yàn)室中常用的化學(xué)殺菌劑有升汞、甲醛、高錳酸鉀、酒精、碘酒、龍膽紫、石炭酸、漂白粉、新潔爾滅、煤酚皂溶液，它們有的是殺菌劑，有的是抑菌劑。培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法當(dāng)前34頁，總共73頁。本次實(shí)驗(yàn)報(bào)告內(nèi)容記錄本實(shí)驗(yàn)配制培養(yǎng)基的名稱、數(shù)量，并圖解說明其配制過程，指明要點(diǎn)。當(dāng)前35頁，總共73頁。思考題固體培養(yǎng)基加瓊脂的作用是什么？干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌和有何不同？培養(yǎng)基配制完成后，為什么必須立即滅菌?若不能及時(shí)滅菌應(yīng)如何處理?已滅菌的培養(yǎng)基如何進(jìn)行無菌檢查?當(dāng)前36頁，總共73頁。實(shí)驗(yàn)五第二節(jié)

微生物檢驗(yàn)的基本操作技術(shù)當(dāng)前37頁，總共73頁。主要內(nèi)容無菌技術(shù)M的接種與分離技術(shù)微生物的培養(yǎng)方法微生物的生長現(xiàn)象與觀察當(dāng)前38頁，總共73頁。（一）什么是無菌技術(shù)指在微生物實(shí)驗(yàn)工作中，控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施。當(dāng)前39頁，總共73頁。（二）無菌環(huán)境無菌室無菌柜超凈工作臺(tái)當(dāng)前40頁，總共73頁。1、無菌室（1）無菌室的結(jié)構(gòu)：更衣間、緩沖間、操作間（2）無菌室的消毒和防污染每日（使用前）紫外線照射（1~2小時(shí)）.每周用甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（2小時(shí)）.每月用新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進(jìn)行消毒。當(dāng)前41頁，總共73頁。2、超凈工作臺(tái)

超凈臺(tái)的使用與保養(yǎng):（1）風(fēng)速保持在米/秒;（2）使用前開啟紫外燈照射30分鐘以上;（3）讓超凈臺(tái)預(yù)工作10－15分鐘;（4）使用完畢后，用70%酒精將臺(tái)面和臺(tái)內(nèi)四周擦拭干凈.當(dāng)前42頁，總共73頁。

（三）無菌器材滅菌器材：玻璃器皿、培養(yǎng)基、無菌衣等.

消毒器材：無菌室內(nèi)的凳子、試管架、天平、工作臺(tái)、手等當(dāng)前43頁，總共73頁。（四）無菌操作1、目的：（1）是保證待檢物品不被環(huán)境中微生物的污染；（2）是防止被檢微生物在操作中污染環(huán)境或感染操作人員。當(dāng)前44頁，總共73頁。2、進(jìn)入無菌室前的準(zhǔn)備（1）、定期檢查無菌環(huán)境的空氣是否符合規(guī)定；（2）、用紫外線滅菌處理30~60分鐘；（3）、檢查無菌器材是否完備；（4）、洗手消毒；（5）、手部消毒后，再穿戴無菌工作服。當(dāng)前45頁，總共73頁。3、檢驗(yàn)操作過程的無菌操作要求（1）、在操作中不應(yīng)有大幅度或快速的動(dòng)作；（2）、使用玻璃器皿應(yīng)輕取輕放。（3）、在正火焰上方操作；（4）、接種用具在使用前、后都必須灼燒滅菌；（5）、在接種培養(yǎng)物時(shí)，協(xié)作應(yīng)輕、準(zhǔn)。（6）、不能用嘴直接吸吹吸管。（7）、帶有菌液的吸管、玻片等器材應(yīng)及時(shí)置于盛有5%來蘇爾溶液的消毒桶內(nèi)消毒。

當(dāng)前46頁，總共73頁。無菌操作斜面接種時(shí)的無菌操作(1)接種滅菌

(2)開啟棉塞

(3)管口滅菌

(4)挑起菌苔

(5)接種

(6)塞好棉塞當(dāng)前47頁，總共73頁。1.接種環(huán)前端鐵絲部分以酒精燈燒紅來菌，后端鐵棒部分過火無菌操作–

取菌技巧1當(dāng)前48頁，總共73頁。2.試管前端過火3.打開試管蓋無菌操作–

取菌技巧1當(dāng)前49頁，總共73頁。4.試管傾斜，放入接種環(huán)無菌操作–

取菌技巧1當(dāng)前50頁，總共73頁。5.試管前端過火，蓋上試管蓋6.接種環(huán)燒紅滅菌無菌操作–

取菌技巧1當(dāng)前51頁，總共73頁。5.試管前端過火，蓋上試管蓋6.接種環(huán)燒紅滅菌無菌操作–

取菌技巧1當(dāng)前52頁，總共73頁。2.自Plate

上取單一菌落(方法一：蓋子微開遮住培養(yǎng)基，避免空氣中菌體掉入)(方法二：plate反面拿起)無菌操作–

取菌技巧2當(dāng)前53頁，總共73頁。1.擠出安全吸球內(nèi)空氣，插上滅過菌之玻璃吸管2.向上為吸，向下為放無菌操作–

取菌技巧3當(dāng)前54頁，總共73頁。1.調(diào)整Pipetman

刻度(P1000吸取范圍200~1000μl)2.插上滅過菌之Tip(用力插緊)無菌操作–

取菌技巧4當(dāng)前55頁，總共73頁。3.按鈕壓至第一段(不可壓至最底)4.深入液面下2~4mm無菌操作–

取菌技巧4當(dāng)前56頁，總共73頁。5.慢慢釋放按鈕，即可吸取液體無菌操作–

取菌技巧4當(dāng)前57頁，總共73頁。1.試管前端過火2.打開試管蓋無菌操作–

接菌技巧當(dāng)前58頁，總共73頁。方法一：以接種環(huán)沾菌，放入