分離工程第六章

分離工程第六章第一頁，共一百零七頁，2022年，8月28日又稱層析或色層分離。屬高度純化技術(shù)。初步純化技術(shù)：超濾，離心，沉淀，溶劑萃取，膜分離，吸附等。高度純化技術(shù)：選擇性沉淀或結(jié)晶，電泳，絡(luò)合，層析等。對藥品，特別是注射用藥品和基因工程菌生成的產(chǎn)品，都需要高度純化。第二頁，共一百零七頁，2022年，8月28日氣相色譜液相色譜

特點分離精度高、設(shè)備簡單、操作方便。應(yīng)用物質(zhì)成分的定量分析與檢測；生物物質(zhì)的制備、分離和純化。第三頁，共一百零七頁，2022年，8月28日第一節(jié)色譜原理與分類第四頁，共一百零七頁，2022年，8月28日一、原理根據(jù)混合物中，溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分配行為的差別，引起移動速度的不同而進(jìn)行分離的方法?；ゲ幌嗳艿膬上喾謩e稱為：固定相和流動相。第五頁，共一百零七頁，2022年，8月28日色譜系統(tǒng)的基本組成第六頁，共一百零七頁，2022年，8月28日第七頁，共一百零七頁，2022年，8月28日生物分離主要用柱層析，柱層析處理量大。固定相分配系數(shù)大的后被洗脫。第八頁，共一百零七頁，2022年，8月28日二、分類流動相與固定相固定相的形狀第九頁，共一百零七頁，2022年，8月28日壓力以固體為固定相的液相柱層析中，根據(jù)操作壓力的不同分為：流動相流動方向軸向流層析徑向流層析優(yōu)點：規(guī)模放大容易；柱效率高。缺點：柱設(shè)備造價較高。第十頁，共一百零七頁，2022年，8月28日分離操作方式根據(jù)分離操作方式不同分為:第十一頁，共一百零七頁，2022年，8月28日洗脫展開（洗脫層析）料液中的溶質(zhì)根據(jù)其在固定相和流動相間分配行為的不同，在層析柱出口處被展開形成相互分離的層析峰。第十二頁，共一百零七頁，2022年，8月28日迎頭分析（前流分析法）將混合物溶液（料液）連續(xù)通過色譜柱，只有吸附力最弱的組分以純品狀態(tài)最先自柱中流出，其它各組分都不能達(dá)到分離。色譜峰呈階梯式第十三頁，共一百零七頁，2022年，8月28日頂替展開利用一種吸附力比各被吸附組分都強(qiáng)的物質(zhì)來洗脫，這種物質(zhì)稱為頂替劑。頂替劑將料液中所含溶質(zhì)按其與固定相親和力的大小不同從柱中次序頂替出來。第十四頁，共一百零七頁，2022年，8月28日頂替展開第十五頁，共一百零七頁，2022年，8月28日

可以選用不同的洗脫方案最簡單的是無梯度洗脫：即在整個色層分離中，使用一種恒定組分的洗脫液（恒定的洗脫能力）。如果溶質(zhì)的特性非常相似或非常不同這種形式的洗脫很少用，這種情況，有一些組分會快速洗脫而另一些會強(qiáng)烈地阻滯。采用梯度洗脫（階梯式洗脫）：洗脫劑的洗脫能力可以連續(xù)或分段的提高。三種操作方法中，洗脫展開最常用。第十六頁，共一百零七頁，2022年，8月28日分配機(jī)理根據(jù)溶質(zhì)與固定相之間的相同作用機(jī)理，液相層析法可分為：第十七頁，共一百零七頁，2022年，8月28日第二節(jié)凝膠過濾層析第十八頁，共一百零七頁，2022年，8月28日一、原理與操作原理利用凝膠粒子（凝膠過濾介質(zhì)）為固定相，根據(jù)料液中溶質(zhì)相對分子質(zhì)量的差別進(jìn)行分離的液相層析法。操作一般采用恒定洗脫法，即采用組成一定的洗脫液進(jìn)行洗脫展開。第十九頁，共一百零七頁，2022年，8月28日第二十頁，共一百零七頁，2022年，8月28日分子篩凝膠色譜原理第二十一頁，共一百零七頁，2022年，8月28日第二十二頁，共一百零七頁，2022年，8月28日第二十三頁，共一百零七頁，2022年，8月28日二、凝膠過濾介質(zhì)對凝膠過濾介質(zhì)的要求親水性高，表面惰性，即與溶質(zhì)不發(fā)生任何化學(xué)或物理相互作用；穩(wěn)定性高，對pH、離子強(qiáng)度及化學(xué)試劑穩(wěn)定，使用壽命長；具有一定的孔徑分布范圍；機(jī)械強(qiáng)度高，允許較高的操作壓力。第二十四頁，共一百零七頁，2022年，8月28日常用商品化凝膠過濾介質(zhì)葡聚糖凝膠SephadexG，傳統(tǒng)的軟凝膠過濾介質(zhì)，目前仍廣泛使用，但機(jī)械強(qiáng)度低。瓊脂糖凝膠Sepharose，常用，但機(jī)械強(qiáng)度較低；SepharoseCL，用環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)制備，機(jī)械強(qiáng)度較高；此類凝膠經(jīng)化學(xué)修飾后用于IEC、HIC和AC。第二十五頁，共一百零七頁，2022年，8月28日第二十六頁，共一百零七頁，2022年，8月28日其他TSK凝膠，利用親水性高分子合成制備，機(jī)械強(qiáng)度較高，經(jīng)化學(xué)修飾后也常用于IEC和AC；Superdex凝膠，將葡聚糖共價交聯(lián)到高度交聯(lián)的瓊脂糖珠體上制備的剛性凝膠，分離精度高，用于高效液相層析；Superose凝膠，瓊脂糖經(jīng)二次交聯(lián)制備的剛性凝膠，常用于高效IEC和AC。第二十七頁，共一百零七頁，2022年，8月28日凝膠特性參數(shù)排阻極限：不能擴(kuò)散到凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部的最小分子的相對分子質(zhì)量。分級范圍：可分離的溶質(zhì)的相對分子量范圍。溶脹率：溶脹后每克干凝膠吸收水分的百分?jǐn)?shù)。第二十八頁，共一百零七頁，2022年，8月28日凝膠粒徑：多用篩目或微米表示。粒徑越小，分離效率越高。軟凝膠粒徑較大，硬凝膠粒徑較小。床體積：1g干凝膠溶脹后所占有的體積?？障扼w積：層析柱中凝膠之間空隙的體積。一般用水溶性藍(lán)色葡聚糖（2000KD）測定。第二十九頁，共一百零七頁，2022年，8月28日三、應(yīng)用及特點應(yīng)用分離純化用于分離的相對分子質(zhì)量范圍：幾百到106。用于蛋白質(zhì)、多肽、脂質(zhì)、抗生素、糖類、核酸及病毒等生物物質(zhì)的分離純化。還可用于醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中無熱原水的制備及低分子生物制劑中抗原性雜質(zhì)的除去。第三十頁，共一百零七頁，2022年，8月28日脫鹽生物分離中主要用于生物大分子溶液的脫鹽及除去小分子物質(zhì)。還用于溶解目標(biāo)產(chǎn)物的緩沖液的交換。凝膠主體還可以加入其它交換基團(tuán)，如磺酸基，羧甲基，二乙基氨基乙基等，這些物質(zhì)既有分子篩效應(yīng)又具有一定的交換性能第三十一頁，共一百零七頁，2022年，8月28日Desaltingproteinsproteinssalts第三十二頁，共一百零七頁，2022年，8月28日相對分子質(zhì)量的測定在分級范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的分配系數(shù)（或洗脫體積）與相對分子質(zhì)量的對數(shù)成正比.m(v)=a-blgMr.故GFC可用于未知蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定。第三十三頁，共一百零七頁，2022年，8月28日特點優(yōu)點采用恒定洗脫法，操作條件溫和，收率接近100％；介質(zhì)不需清洗或再生，易實施循環(huán)操作，提高產(chǎn)品純度；脫鹽比透析速度快，精度高；比超濾剪應(yīng)力小，活性收率高；分離機(jī)理簡單，操作參數(shù)少，規(guī)模放大容易。缺點選擇性低，處理量??；洗脫展開后產(chǎn)品被稀釋。第三十四頁，共一百零七頁，2022年，8月28日第三節(jié)吸附與離子交換第三十五頁，共一百零七頁，2022年，8月28日1、吸附吸附：溶質(zhì)從液相或氣相轉(zhuǎn)移到固相的現(xiàn)象。活性炭：脫色，除臭等?；钚蕴糠Q吸附劑。吸附劑：多孔微粒。第三十六頁，共一百零七頁，2022年，8月28日活性炭（Activecarbon）活性炭種類顆粒大小表面積吸附力吸附量洗脫粉末活性炭小大大大難顆?；钚蕴枯^小較大較小較小難錦綸活性炭大小小小易第三十七頁，共一百零七頁，2022年，8月28日粉末活性炭第三十八頁，共一百零七頁，2022年，8月28日錦綸活性炭第三十九頁，共一百零七頁，2022年，8月28日大孔網(wǎng)狀吸附劑特點：脫色去臭效果理想；對有機(jī)物具有良好的選擇性；物化性質(zhì)穩(wěn)定；機(jī)械強(qiáng)度好；吸附速度快；解吸、再生容易。但價格昂貴，吸附效果易受流速以及溶質(zhì)濃度等因素的影響。第四十頁，共一百零七頁，2022年，8月28日大孔網(wǎng)狀吸附樹脂的種類非極性吸附樹脂：苯乙烯交聯(lián)而成，交聯(lián)劑為二乙烯苯，又稱芳香族吸附劑。中等極性吸附樹脂：甲基丙烯酸酯交聯(lián)而成，交聯(lián)劑亦為甲基丙烯酸酯，故又稱脂肪族吸附劑。極性吸附劑：丙烯酰胺或亞砜經(jīng)聚合而成，通常含有硫氧、酰胺、氮氧等基團(tuán)。第四十一頁，共一百零七頁，2022年，8月28日大孔吸附樹脂的吸附機(jī)理非離子型共聚物，借助于范德華力從溶液中吸附各種有機(jī)物，其吸附能力與樹脂的化學(xué)結(jié)構(gòu)、物理性能以及與溶質(zhì)、溶劑的性質(zhì)有關(guān)。通常遵循以下規(guī)律：非極性吸附劑可從極性溶劑中吸附非極性溶質(zhì)；極性吸附劑可從非極性溶劑中吸附極性物質(zhì)；中等極性吸附劑兼有以上兩種能力第四十二頁，共一百零七頁，2022年，8月28日吸附劑對溶質(zhì)的吸附作用按吸附作用力區(qū)分主要有三類：物理吸附：吸附劑、吸附質(zhì)之間范德華力?；瘜W(xué)吸附：吸附劑、吸附質(zhì)之間化學(xué)鍵力。離子交換吸附（簡稱離子交換）：吸附劑為離子交換劑，離子交換劑表面含有離子基團(tuán)或可離子化的基團(tuán)，通過靜電引力吸附帶相反電荷的離子，吸附過程中發(fā)生電荷的轉(zhuǎn)移。離子交換的吸附可通過調(diào)節(jié)pH或提高離子強(qiáng)度的方法洗脫。第四十三頁，共一百零七頁，2022年，8月28日常見的吸附類型及其主要特點物理吸附化學(xué)吸附吸附作用力分子間引力化學(xué)鍵合力選擇性較差較高所需活化能低高吸附層單層或多層單層達(dá)到平衡所需時間快慢第四十四頁，共一百零七頁，2022年，8月28日第四十五頁，共一百零七頁，2022年，8月28日有機(jī)高分子吸附劑：多孔性聚乙烯、多孔性聚酯等樹脂具有大網(wǎng)絡(luò)細(xì)孔結(jié)構(gòu)，用于抗生素，維生素B12分離濃縮。還有多孔性纖維素，瓊脂糖凝膠，葡聚糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠，羥基磷灰石(層析、電泳)。第四十六頁，共一百零七頁，2022年，8月28日離子交換樹脂的結(jié)構(gòu)具有三維空間立體結(jié)構(gòu)的網(wǎng)絡(luò)骨架聯(lián)接在骨架上的活性基團(tuán)活性基團(tuán)所帶的相反電荷的活性離子（可交換離子）第四十七頁，共一百零七頁，2022年，8月28日樹脂的網(wǎng)絡(luò)骨架第四十八頁，共一百零七頁，2022年，8月28日離交樹脂三維空間立體結(jié)構(gòu)第四十九頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2、離子交換劑分為陽離子交換劑和陰離子交換劑陽離子有交換能力陰離子有交換能力活性基團(tuán)為酸性活性基團(tuán)為堿性第五十頁，共一百零七頁，2022年，8月28日離子交換的分類按活性基團(tuán)分類，可分為陽離子交換樹脂(cationexchange)（含酸性基團(tuán)）和陰離子交換樹脂(anionexchange)（含堿性基團(tuán)）。具體又可以分為：強(qiáng)陽、弱陽強(qiáng)陰、弱陰第五十一頁，共一百零七頁，2022年，8月28日離子交換的一般過程第五十二頁，共一百零七頁，2022年，8月28日根據(jù)有離子交換能力的pH范圍不同分為：強(qiáng)酸性、弱酸性陽離子交換劑強(qiáng)堿性、弱堿性陰離子交換劑第五十三頁，共一百零七頁，2022年，8月28日常用的離子交換樹脂強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂：活性基團(tuán)是-SO3H（磺酸基）和-CH2SO3H（次甲基磺酸基）；弱酸性陽離子交換樹脂：活性基團(tuán)有-COOH,

-OCH2COOH,C6H5OH等弱酸性基團(tuán)；強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂：活性基團(tuán)為季銨基團(tuán)，如三甲胺基或二甲基-?-羥基乙基胺基；弱堿性陰離子交換樹脂：活性基團(tuán)為伯胺或仲胺，堿性較弱；第五十四頁，共一百零七頁，2022年，8月28日強(qiáng)離子交換劑的離子化率基本不受pH值影響，離子交換作用的pH范圍寬，弱離子交換劑的離子化率受pH值影響很大，離子交換作用的pH范圍小。弱酸性陽離子交換劑在pH值減低時，離子化率逐漸降低，離子交換能力逐漸減弱，弱堿性離子交換劑在pH升高時，離子化率逐漸降低，離子交換能力逐漸喪失。離子化率與離子交換能力成正比。第五十五頁，共一百零七頁，2022年，8月28日P184表6、2列出了生物分離中常用的離子交換基團(tuán)常用于蛋白質(zhì)交換的離子交換基團(tuán)陰離子交換基：二乙胺乙基（DEAE)季銨乙基（QAE)。陽離子交換基：羧甲基（CM),膦酸基(P),磺丙基（SP)。所用的基質(zhì)材料主要有纖維素，葡聚糖凝膠和瓊脂凝膠。第五十六頁，共一百零七頁，2022年，8月28日DEAEanionexchanger第五十七頁，共一百零七頁，2022年，8月28日CMCCationExchanger第五十八頁，共一百零七頁，2022年，8月28日第五十九頁，共一百零七頁，2022年，8月28日第六十頁，共一百零七頁，2022年，8月28日離子交換操作方法樹脂預(yù)處理離子交換吸附洗脫第六十一頁，共一百零七頁，2022年，8月28日第六十二頁，共一百零七頁，2022年，8月28日交換容量：單位質(zhì)量的干燥離子交換劑或單位體積的濕離子交換劑所能吸附的一價離子的毫摩爾數(shù)。是表征離子交換能力的主要參數(shù)。陽離子交換劑：R-H++NaOH=R-Na++H2O陰離子交換劑：2R+Cl-+Na2SO4=R2+SO42-+2NaCl

第六十三頁，共一百零七頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)等生物大分子與小分子化合物離子交換特性有很大差別：A、蛋白質(zhì)分子量大，樹脂孔道對其空間排阻作用大，不能與所有的離子交換活性中心接觸。B、離子交換吸附蛋白質(zhì)分子會妨礙其他蛋白質(zhì)與未吸附蛋白質(zhì)離子交換基團(tuán)發(fā)生作用。第六十四頁，共一百零七頁，2022年，8月28日C、蛋白質(zhì)是多價電荷，離子交換中可與多個離子交換基發(fā)生作用。因此蛋白質(zhì)的交換容量遠(yuǎn)低于無機(jī)離子的交換容量。第六十五頁，共一百零七頁，2022年，8月28日第四節(jié)離子交換層析第六十六頁，共一百零七頁，2022年，8月28日一、原理與操作原理利用離子交換劑為固定相，根據(jù)荷電溶質(zhì)與離子交換劑之間靜電相互作用力的差別進(jìn)行溶質(zhì)分離的洗脫層析法。荷電溶質(zhì)在離子交換劑上的分配系數(shù)為：其中：I為流動相的離子強(qiáng)度；A和B為常數(shù)；m∞為離子強(qiáng)度無限大時溶質(zhì)的分配系數(shù)。對于不同的溶質(zhì)，A與B不同，即在離子交換劑上的分配行為不同，在洗脫過程中彼此得到分離。第六十七頁，共一百零七頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)是多價的兩性高分子電解質(zhì)，具有等點pI，當(dāng)溶液pH偏離等電點，pH大于pI時，帶負(fù)電荷，可被陰離子吸附劑所吸附，pH小于pI時，帶正電荷，可被陽離子交換劑吸附。B值為蛋白質(zhì)的凈電荷數(shù)與反離子價數(shù)（離子交換基的離子價數(shù)）之比。由于蛋白質(zhì)凈電荷數(shù)常為兩位數(shù)以上，B值很大。因此離子強(qiáng)度的微小改變會引起分配系數(shù)很大改變。第六十八頁，共一百零七頁，2022年，8月28日由于離子交換過程中溶質(zhì)的分配系數(shù)隨離子強(qiáng)度增大而急劇降低，故離子交換操作需在低離子強(qiáng)度下進(jìn)行。第六十九頁，共一百零七頁，2022年，8月28日IEC操作（離子交換層析操作）很少采用恒定洗脫。因為：蛋白質(zhì)的分配系數(shù)對離子強(qiáng)度非常敏感，即離子強(qiáng)度的微小改變，引起分配系數(shù)的很大變化；不同蛋白質(zhì)的B值可能相差很大，即在同一離子強(qiáng)度下不同蛋白質(zhì)分配系數(shù)可能相差非常大。第七十頁，共一百零七頁，2022年，8月28日若采用離子強(qiáng)度不變的流動相進(jìn)行恒定洗脫，不同蛋白質(zhì)的洗脫體積相差很大，甚至分配系數(shù)大的蛋白質(zhì)很難洗脫，造成洗脫劑的大量消耗和洗脫時間的大幅度增加。第七十一頁，共一百零七頁，2022年，8月28日多采用梯度洗脫法線性梯度洗脫法流動相離子強(qiáng)度線性增大，溶質(zhì)的分配系數(shù)m連續(xù)降低，移動速度逐漸增大，使恒定洗脫條件下難于洗脫的溶質(zhì)在較小的流動相體積下洗脫。通過改變流動相離子強(qiáng)度的增大速度，可調(diào)整溶質(zhì)的洗脫體積，在改善分離度的同時縮短洗脫時間。第七十二頁，共一百零七頁，2022年，8月28日特點優(yōu)點：流動相離子強(qiáng)度連續(xù)增大，不出現(xiàn)干擾峰，操作范圍廣；缺點：需要特殊的調(diào)配濃度梯度的設(shè)備。第七十三頁，共一百零七頁，2022年，8月28日第七十四頁，共一百零七頁，2022年，8月28日逐次洗脫法流動相離子強(qiáng)度階躍增大，溶質(zhì)的分配系數(shù)的降低和移動速度的增大也是階段式的。是介于恒定洗脫和線性梯度洗脫之間的一種洗脫法。特點優(yōu)點：不需特殊的調(diào)配濃度梯度設(shè)備，操作簡便；缺點：容易出現(xiàn)干擾峰；此外，容易出現(xiàn)多組分洗脫峰重疊的現(xiàn)象。洗脫操作參數(shù)的設(shè)計較困難。第七十五頁，共一百零七頁，2022年，8月28日梯度洗脫的濃縮作用IEC柱內(nèi)溶質(zhì)區(qū)帶后部的離子強(qiáng)度高于前部，因此后部的移動速度高于前部，溶質(zhì)在洗脫過程中得到濃縮。第七十六頁，共一百零七頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)離子交換分離的基本步驟平衡上樣吸附洗脫再生第七十七頁，共一百零七頁，2022年，8月28日++++++-------anionexchangebeadEquilibration第七十八頁，共一百零七頁，2022年，8月28日Sampleapplicationandwash-----------++++++----第七十九頁，共一百零七頁，2022年，8月28日Elution----------------------------------++++++++++++--第八十頁，共一百零七頁，2022年，8月28日Regeneration-----------------------++++++第八十一頁，共一百零七頁，2022年，8月28日SampleapplicationandwashElutionEquilibrationRegeneration--------------------------------------------------------------------++++++++++++++++++++++++++++++-----------第八十二頁，共一百零七頁，2022年，8月28日二、應(yīng)用及特點應(yīng)用由于IEC基于離子交換的原理分離純化生物產(chǎn)物，通用性和選擇性均遠(yuǎn)高于GFC，所以是蛋白質(zhì)、多肽和核酸等生物產(chǎn)物的主要純化手段。思考題：為什么離子交換層析操作中很少采用恒定洗脫法？第八十三頁，共一百零七頁，2022年，8月28日

IEC特點優(yōu)點處理量大，具濃縮作用，可在較高流速下操作；應(yīng)用范圍廣泛，優(yōu)化操作條件可大幅度提高分離的選擇性，所需柱長較短；產(chǎn)品回收率高；商品化的離子交換劑種類多，選擇余地大，價格也較低。第八十四頁，共一百零七頁，2022年，8月28日缺點操作參數(shù)多，影響分離特性的因素非常復(fù)雜，過程設(shè)計和規(guī)模放大困難。第八十五頁，共一百零七頁，2022年，8月28日第八十六頁，共一百零七頁，2022年，8月28日例題用SephadexG-100柱（排阻層析柱）及強(qiáng)酸性陽離子交換柱（離子交換柱）來分離核糖核酸酶①（分子量14000，pI7.8）胃蛋白酶②（分子量36000，pI1.5）及胰島素③（分子量5700，pI5.3）指出以上物質(zhì)通過兩個柱洗脫順序，并簡要說明分離原理。第八十七頁，共一百零七頁，2022年，8月28日答：SephadexG-100②①③pH-pI

大，帶電荷多。陽離子交換柱。pH<pI帶正電荷，帶正荷①>③>②

吸附性強(qiáng)，m大①>③>②洗脫順序：②>③>①

第八十八頁，共一百零七頁，2022年，8月28日答：SephadexG-100凝膠過濾中，分子量大的物質(zhì)先被洗脫下來，凝膠過濾中的洗脫順序為：胃蛋白酶、核糖核酸酶、胰島素。（5分）離子交換拄中，

pH與pI差值大的物質(zhì)帶電荷多。帶電荷多的吸附性強(qiáng)。陽離子交換柱中，pH<pI帶正電荷，帶正電荷多少的順序為：核糖核酸酶、胰島素、胃蛋白酶。所以洗脫順序為：胃蛋白酶、胰島素、核糖核酸酶。（5分）第八十九頁，共一百零七頁，2022年，8月28日例題簡述離子交換層析的分離原理。為什么離子交換層析常用梯度洗脫法？該法有何優(yōu)點。用增加鹽離子強(qiáng)度的方法，從指定的離子交換柱上洗脫下列蛋白質(zhì)，指出它們被洗脫下來的先后順序，并說明理由。已知細(xì)胞色素C的pI=10.6，溶菌酶pI=11.0，卵清蛋白pI=4.6，肌紅蛋白pI=7.0，胃蛋白酶pI=1.0，脲酶pI=5.0，血紅蛋白pI=6.8。（1）細(xì)胞色素C，溶菌酶，卵清蛋白，肌紅蛋白（陰離子交換柱）；（2）細(xì)胞色素C，胃蛋白酶，脲酶，血紅蛋白（陽離子交換柱）。（15分）第九十頁，共一百零七頁，2022年，8月28日第五節(jié)疏水性相互作用層析第九十一頁，共一百零七頁，2022年，8月28日一、原理與操作原理：HIC利用表面偶聯(lián)弱疏水性基因的疏水性吸附劑為固定相，根據(jù)蛋白質(zhì)與疏水性吸附劑之間的弱疏水性相互作用的差別進(jìn)行蛋白質(zhì)類生物大分子分離純化的洗脫層析法。親水性蛋白質(zhì)表面均含有一定量的疏水性基團(tuán)，可與親水性固定相表面偶聯(lián)的短鏈烷基、苯基等弱疏水基發(fā)生疏水性相互作用，被固定相（疏水性吸附劑）所吸附。第九十二頁，共一百零七頁，2022年，8月28日疏水作用層析

(HydrophobicInteractionChromatography）Hydrophobicinteractionchromatographyisaliquidchromatographytechniquethatseparatesbiomoleculesaccordingtotheirhydrophobicity第九十三頁，共一百零七頁，2022年，8月28日操作：與IEC不同，蛋白質(zhì)的吸附在高濃度鹽溶液中進(jìn)行，洗脫則主要采用降低流動相離子強(qiáng)度的線性梯度洗脫法或逐次洗脫法。原因：根據(jù)蛋白質(zhì)鹽析沉淀原理，在離子強(qiáng)度較高的鹽溶液中，疏水性相互作用增大。所以，蛋白質(zhì)在疏水性吸附劑上的分配系數(shù)隨流動相鹽濃度（離子強(qiáng)度）的提高而增大。第九十四頁，共一百零七頁，2022年，8月28日二、疏水性吸附劑各種凝膠過濾介質(zhì)經(jīng)偶聯(lián)疏水性配基后均可用作疏水性吸附劑。常用的疏水性配基主要有：苯基、短鏈烷基（C3~C8）、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。因疏水性吸附作用與配基的疏水性（疏水鏈長度）和配基密度成正比，故配基修飾密度應(yīng)根據(jù)配基的疏水性而異，一般為10~40mol/cm3，過小則疏水性吸附作用不足，過大則洗脫困難。

第九十五頁，共一百零七頁，2022年，8月28日強(qiáng)烈的洗脫條件，會使被洗脫的蛋白質(zhì)變性?？筛鶕?jù)系列柱實驗來判斷蛋白質(zhì)表面的疏水性質(zhì)。從而決定分辨和純化蛋白質(zhì)的方案。第九十六頁，共一百零七頁，2022年，8月28日MechanismofHIC第九十七頁，共一百零七頁，2022年，8月28日疏水性配基與親水性固定相粒子之間的偶聯(lián)主要利用氨基的結(jié)合或醚鍵結(jié)合。－NH－R－NH2－NH－R－O－CH2CHCH2OR∣OH其中：R＝－(CH2)nCH3，n=2~7；或R＝R表示疏水性配基。第九十八頁，共一百零七頁，2022年，8月28日三、應(yīng)用及特點應(yīng)用HIC基于疏水性吸附分離純化蛋白質(zhì)類生物大分子，與IEC的離子交換作用完全不同，可與IEC互補(bǔ)短長，分離純化利用IEC難于分離的蛋白質(zhì)。第九十九頁，共一百零七頁，2022年，8月28日特點優(yōu)點由于在高濃度鹽溶液中疏水性吸附作用較大，因此HIC可直接分離鹽析后的蛋白質(zhì)溶液；通過改變疏水配基鏈長和密度可調(diào)節(jié)吸附力，