醫(yī)學免疫學課件：免疫學檢測

免疫學檢測★★免疫學檢測抗原抗體結(jié)合特點及影響因素抗原抗體檢測免疫細胞功能檢測21.抗原抗體結(jié)合特點及影響因素特異性可逆性兩個階段：不可見（特異性結(jié)合）可見（易受影響）適宜的抗原抗體濃度和比例3電解質(zhì)：生理鹽水或含鹽緩沖液溫度：37℃酸堿度：PH6~84抗原(親水膠體)

抗體(親水膠體)抗原抗體復合物

(疏水膠體)電解質(zhì)可見反應(yīng)

+1.抗原抗體結(jié)合特點及影響因素抗原或抗體檢測檢測原理：抗原和抗體特異性結(jié)合抗原表位與HVR(CDR)結(jié)合非共價鍵結(jié)合，多種結(jié)合力52.抗原抗體檢測親和力(affinity)：指抗體分子上一個抗原結(jié)合位點與相應(yīng)抗原表位之間結(jié)合的強度，它是抗原抗體間固有的結(jié)合力親合力(avidity)：一個抗體分子與整個抗原之間結(jié)合的強度，與抗體結(jié)合價、抗原表位數(shù)目等相關(guān)62.抗原抗體檢測2.抗原抗體檢測已知抗原檢測抗體已知抗體檢測抗原大分子物質(zhì)凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)標記技術(shù)7a)凝集反應(yīng)(agglutinationreactions)顆粒性抗原(如細菌、紅細胞或表面帶有抗原的乳膠顆粒)與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下，出現(xiàn)肉眼可見的凝集物定性或半定量分類：直接凝集、間接凝集89玻片法：定性；已知抗體檢測抗原；菌種分型、ABO血型試管法：半定量；已知抗原檢測有無抗體及抗體含量；肥大試驗直接凝集反應(yīng)10間接凝集反應(yīng)將可溶性抗原吸附或耦聯(lián)在與免疫無關(guān)顆粒性載體表面(紅細胞、聚苯乙烯乳膠、活性炭)，再與抗體進行特異性結(jié)合。速率散射比濁法/免疫比濁法：定量單向瓊脂擴散：定量雙向瓊脂擴散：定性或半定量免疫電泳：抗原種類分析b)沉淀反應(yīng)(precipitationreactions)可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下，形成沉淀物的現(xiàn)象。1112速率散射比濁法/免疫比濁法一定量抗體中加入遞增量抗原數(shù)量不等免疫復合物-濁度濁度儀標準曲線定量分析Ag濁度131415c)免疫標記技術(shù)16用酶、熒光素、放射性核素、電子致密物質(zhì)或發(fā)光劑或作為示蹤劑標記抗體或抗原進行的抗原-抗體反應(yīng)高靈敏度特異性快速定性、定量、定位c)免疫標記技術(shù)酶免疫測定（酶）免疫熒光技術(shù)（熒光素）放射免疫測定法（放射性核素）化學發(fā)光免疫技術(shù)（發(fā)光物質(zhì)）免疫膠體金技術(shù)（膠體金顆粒）免疫印跡技術(shù)（Westernblotting）17酶免疫測定法抗原抗體反應(yīng)；酶對底物催化酶標儀測定光密度值(OD)，定量辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP)ELISA：可溶性抗原或抗體酶免疫組化：組織或細胞表面抗原18酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)19Enzymelinkedimmunosoborbentassay將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相載體表面進行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除，最后通過酶作用于底物后顯色來判斷結(jié)果。20酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)21免疫熒光技術(shù)2223放射免疫測定法：放射性核素131I,125I標記，敏感性，激素、藥物等微量物質(zhì)，污染化學發(fā)光免疫分析：有機分子吸收化學能后發(fā)生能級躍遷，產(chǎn)生中間體，回復基態(tài)，發(fā)光。自動發(fā)光分析儀。非放射性，高靈敏度，檢測范圍寬免疫金標技術(shù)：金顆粒高電子密度，金標蛋白黑褐色顆粒，肉眼紅色斑點。免疫層析法和快速免疫金滲濾法。HBsAg,HCG,抗dsDNA抗體蛋白印跡（Westernblotting）243.免疫細胞功能檢測免疫細胞的分離PBMC分離淋巴細胞亞群分離免疫細胞功能的測定25外周血單個核細胞(PBMC)分離葡聚糖--泛影葡胺密度梯度離心法：根據(jù)外周血中各種血細胞比重不同使不同密度的細胞呈梯度分布，從而分離出PBMC。離心PBMCs26淋巴細胞亞群分離免疫吸附分離法（抗體包被聚苯乙烯培養(yǎng)板）尼龍毛分離法E花環(huán)形成分離法磁珠分離法（磁珠，MACS）熒光激活細胞分選儀分離法（FACS）抗原肽-MHC分子四聚體技術(shù)（Tetramer）27E花環(huán)分離法28

TTBSRBCCD2磁珠分離法MACS29磁珠標記目的細胞未標記細胞先行流出移出磁場后收集目的細胞CD4+T細胞分離柱CD4-T細胞磁珠(microbead)流式細胞分選FAC30Tetramer技術(shù)分選31免疫細胞功能測定32細胞增殖試驗細胞毒試驗吞噬功能測定細胞因子檢測抗體形成細胞測定皮膚試驗體外實驗體內(nèi)實驗細胞增殖試驗33形態(tài)計數(shù)法：淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗3H-TdR或125I-UdR摻入法MTT比色法BrdU或EdU摻入結(jié)合FACS測增殖CFSE標記測細胞分裂MTT比色法34MTT，(四唑鹽，商品名為噻唑藍)可溶性鹽，摻入細胞細胞增殖，MTT形成紫褐顆粒異丙醇溶解為藍紫色測OD值簡便，無污染BrdU摻入結(jié)合FACS測增殖35BrdU(5’-溴脫氧尿苷)可在細胞合成DNA時替代胸腺嘧啶（T），后通過加入熒光標記的抗BrdU抗體，利用流式細胞儀檢測BrdU摻入率，從而反映細胞增殖水平CFSE標記測細胞分裂363day6day2-羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(CFSE或CFDA-SE)可穿過細胞膜、不可逆地與胞內(nèi)蛋白和膜表面蛋白結(jié)合的熒光染料。當細胞分裂時,

CFSE標記熒光可平均分配至2個子代細胞中，因此，CFSE含量減少的細胞代表增殖的子代細胞。細胞毒試驗3751Cr釋放法：γ計數(shù)儀乳酸脫氫酶（LDH）釋放法：光度計測定細胞染色法：臺盼藍染色凋亡細胞檢測法形態(tài)學瓊脂糖凝膠電泳法：梯狀DNA區(qū)帶圖譜FACS：亞二倍體峰；PI/Annexin-VTUNEL法：敏感，早期凋亡FACS：多種方式檢測凋亡38DNA分析-亞二倍體峰細胞膜分析-PS外翻酶學分析-Caspase-3細胞因子檢測39生物學檢測法免疫學檢測法分子生物學檢測法免疫學檢測法40ELISAELISPOTICS(Intracellularcytokinestaining)CBA(CytometricBeadArray,微量樣本多指標流式蛋白檢測技術(shù))41酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）ELISPOT42ICS43細