生化樣品的制備與分析試驗(yàn)前準(zhǔn)備

《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)》實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備： 2005年5月一、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容、試劑和器材（ 160人，80組）(一)實(shí)驗(yàn)一、淀粉的提取 實(shí)驗(yàn)二、總糖和還原糖的測(cè)定1．試劑：（1） (白色250ml)銅試劑（4000ml）：（A）26g

(定性)硫酸銅加水至于

2000ml48g酒石酸鉀鈉+80克無水碳酸鈉+100克碳酸氫鈉+72克草酸鉀+3.2克碘酸鉀制備溶液 B時(shí)，先用法 700ml熱水溶化前三種試劑，再加后兩種至于 2000ml，最后將（A）、B）等量混合。2）(不分裝)0.005N硫代硫酸鈉（20000ml）：24.8g硫代硫酸鈉+2g碳酸鈉+水配20000ml0.005N溶液。3）（白色滴瓶）1%淀粉（500ml）：5g可溶性淀粉溶于500ml飽和的NaCL溶液中煮沸。4）（棕色60ml）2%碘化鉀（2000ml）：40gKI+水至于2000ml。（定性）（5）（強(qiáng)酸）（白色60ml）2N硫酸（1500ml）：166.6ml母液溶于水至1500ml。（6）（白色60ml）標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖（1000ml0.5mg/ml）：0.5g葡萄糖+水至1000ml。7）地瓜或山芋3Kg,一組20克。8）（白色60ml）待測(cè)還原糖：400ml稀釋800ml。2．器材：（1）菜刀12支（2）菜板12塊（3）搗碎機(jī)12臺(tái)（4）恒溫水浴鍋12臺(tái)（5）滴定管48支（6）子鐵架臺(tái)+蝴蝶夾+鐵圈48套。（二）實(shí)驗(yàn)三、四、五、六淀粉酶性質(zhì)的測(cè)定1．試劑：1）（白色125ml）1%蔗糖（2500ml）：25g蔗糖+水至2500ml溶液。2）(白色250ml)本尼迪克試劑（3000ml）：混合（A）、（B）。（A）51.9g硫酸銅+水至450ml。B）519g檸檬酸鈉+300g碳酸鈉+水加熱溶解至2550ml，冷卻。3）(白色250ml)0.5%淀粉（6000ml）：30g淀粉+水至6000ml,煮沸。4）(白色250ml)含0.3%NaCL的0.5%淀粉（4000ml）：20g淀粉+12gNaCL+水至4000ml，煮沸。5）（白棕色60ml）1%NaCL(1000ml):10gNaCL+水至1000ml溶液。6）（白棕色60ml）0.1%CuSO4（1000ml）：15gCuSO4+H2O至1000ml溶液。7）（手易著色）(棕色60ml)碘—碘化鉀溶液（1000ml）：8）(棕色250ml)0.2M磷酸氫二鈉（8000ml）：573.2g+水至8000ml溶液。9）（白色60ml）(白色125ml)0.1M檸檬酸（2000ml）：42.0g+水至2000ml溶液。2．器材：（1）恒溫水浴鍋 12臺(tái)（2）pH計(jì)4臺(tái)(3)電子天平均數(shù)（ 4）電磁爐。（三）實(shí)驗(yàn)七 米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速度（堿性磷酸酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)測(cè)定） 。1． 試劑：1）(60ml棕色)10mMPNPP（300ml）：1.113g+H2O至300ml溶液。2）（白色60ml）20mMMgCL2（1000ml）：4.07g+水至1000ml溶液。（3）(白色250ml)0.1M碳酸鈉—碳酸氫鈉PH10.1緩沖液（1500ml,150人要3000ml）：0.1M碳酸鈉（21.2g碳酸鈉+水至2000ml）；0.1M碳酸氫鈉（8.4gNaHCO3+H2O至1000ml溶液）。1050mlNa2CO3+450mlNaHCO3至1500ml緩沖液。（4）（腐蝕性）(白色250ml)0.1MNaOH（3000ml）：50ml6MNaOH+H2O至3000ml溶液。（150人要4000ml）。（5）(不分裝)酶液(3mg堿性磷酸酶，舊的要12mg+水至500ml)。（缺貨）2． 器材：（1）恒溫水浴鍋 12臺(tái)（2）722分光光度計(jì) 25臺(tái)(四)實(shí)驗(yàn)十一、細(xì)胞色素 C的制備試劑：1．試劑：（1） 豬心：26組×50g=1300g/班，兩班共 2600g。每次（7-8斤）5斤（星期二、五上午）。2）（腐蝕性）(專用)10%NaOH（1000ml）：100gNaOH+H2O至1000ml溶液，分13瓶。（3） （腐蝕性）(白色125ml)20%TCA（500ml）：100g三氯醋酸+水至500ml溶液，分裝 6瓶。4）（腐蝕性）（白色250ml）0.145mol/lTCA（3000ml）：71.1g+H2O至3000ml溶液。5）硫酸銨：6瓶。2．器材：（1）藥匙48把（2）稱量紙 1袋（3）托盤天平 12架（4）搗碎機(jī) 12臺(tái)。（五）實(shí)驗(yàn)十二、凝膠層析法測(cè)定蛋白分子量1．試劑：1）(層析用)0.01mol/lTris-HCl緩沖液，PH7.5，含0.2mol/lNaCl（10000ml）：0.2mol/lTris（1000ml），24.23g+H2O至1000ml溶液；1NHCl（200ml），17.7ml濃HCl+H2O至200ml溶液；117gNaCl+500ml0.2mol/lTris+40.3ml1NHCl+H 2O至10000ml溶液。2．藥品：（1）分步收集儀

12臺(tái)（2）層析柱

12支（3）核酸蛋白質(zhì)檢測(cè)儀

12臺(tái)（4）離心機(jī)

12架（5）透析玻璃紙1整張（

6）記錄儀 12臺(tái)。（六）實(shí)驗(yàn)十五、凝膠等電聚焦法測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn) (盤狀電泳槽)1．試劑：（1） 凝膠貯備液（200ml）：56g丙烯酰胺+1.6g亞甲基雙丙烯酰胺 +水至200ml溶液。（缺貨）2）10%四甲基乙二胺（100ml）：10ml四甲基乙二胺+水至100ml溶液。3）10%過硫酸銨（5ml）：0.5g過硫酸銨+水至5ml溶液（當(dāng)天配制）。4）兩性電解質(zhì)載體pH3-10（上海試劑二廠）。（缺貨）5）電極溶液：A）、5%H3PO4（10000ml）：588ml85%H3PO4+H2O至10000ml溶液。B）、2%NaOH（10000ml）：200gNaOH+H2O至10000ml溶液。6）40%蔗糖（100ml）：40g蔗糖+水至100ml溶液。7）考馬斯亮蘭R250（500ml）：0.25gR250+50mlHac+450mlH2O至500ml溶液。8）脫色液7%醋酸（1000ml）：200mlHAc+H2O至1000ml溶液。9）10%TCA（1000ml）：100g三氯乙酸+H2O至1000ml溶液。（可能不配）2．器材：1）12個(gè)電泳槽（2）12臺(tái)電泳儀（3）12長針頭（4）200ul加樣器48把（5）刀片12片6）PH試紙（3—10）12套（7）細(xì)銅絲180條。（七）實(shí)驗(yàn)十六、 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定蛋白分子量（垂直電泳槽）實(shí)驗(yàn)十七、聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定蛋白分子量（垂直電泳槽）

（PAGE，把

SDS

換水，無巰基乙醇）1．試劑：（1）10%SDS(200ml)：20g十二烷基硫酸鈉+水至200ml溶液。（2）（神經(jīng)毒劑）（50ml棕色）凝膠貯液（400ml）：115.2g+86.4g丙烯酰胺+3.2g+2.4g甲叉酰丙烯酰胺+水至400+150ml溶液。（3）（10ml離心管）分離膠緩沖液（100ml）：1NHCl63ml+Tris54.9g+H2O至150ml溶液，調(diào)PH8.9。（4）（10ml離心管）濃縮膠緩沖液（100ml）：1NHCl72ml+Tris8.97g+H2O至150ml溶液，調(diào)PH6.7。5）（統(tǒng)分老師）10%過硫酸銨（5ml）：0.8g過硫酸銨+H2O至8ml溶液（當(dāng)天配制）。6）（1.5ml離心管）10%TEMED（100ml）：10mlTEMED+H2O至100ml溶液。（7）（邊配）電極緩沖液pH8.3（7500ml）：Tris45g+Gly210g+10%SDS75ml+H2O至7500ml溶液。（8）樣品液（10ml）：濃縮膠緩沖液0.2ml+10%SDS1ml+巰基乙醇0.1ml+蔗糖4g+溴酚藍(lán)2mg+H2O至10ml溶液。（9）（邊配）染色液（500ml）：0.4g考馬斯亮蘭R250+100ml冰乙酸+甲醇450ml+水450ml至1000ml溶液。（10）（邊配統(tǒng)分）1.8%瓊脂（500ml）：7.5g瓊脂加水溶解至500ml溶液。2．器材：（1） 12個(gè)電泳槽（2）12臺(tái)穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（3）12支長針頭（4）200ul加樣器12把（5）刀片12片（6）pH試紙（3—10）12套（7）細(xì)銅絲180條。（八）實(shí)驗(yàn)十三、考馬斯亮蘭測(cè)定蛋白濃度1．試劑：(1)(白色60ml)標(biāo)準(zhǔn)蛋白液1mg/ml（400ml）：0.4g牛血清蛋白+H2O400ml溶解。(2)（手易著色）考馬斯亮蘭試劑（10000ml）：1.0gG250+500ml95%乙醇+1000ml85%H3PO4溶解+H2O。(白色60ml)待測(cè)蛋白液：0.24g牛血清蛋白+H2O400ml溶解。2．器材：（1）722分光光度計(jì) 25臺(tái)(2)記號(hào)筆12支。附：雙縮脲法：蛋白質(zhì)的定量分析1．試劑：10）雙縮脲試劑：500ml：0.75gCuSO4·5H2O+3.0g酒石酸鉀鈉+H2O(溶解)+150ml10%NaOH+0.5gKI+H2O至500ml。（11）生理鹽水（0.9%NaCl）：1000ml。（12）標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（2mg/ml，BSA，150ml）：0.3gBSA+150ml0生理鹽水（4C保存）。（13）待測(cè)蛋白液：1ml卵清+100ml生理鹽水（4000rpm離心2分鐘），吸上清+生理鹽水100ml，（40C保存）。2．儀器：（1）722分光光度計(jì)10臺(tái)（2）水浴鍋3臺(tái)（九）實(shí)驗(yàn)二十二、氨基酸的紙上層析法與酪蛋白氨基酸成分的研究1．試劑：（1）（手易著色）0.5%茚三酮（2000ml）：10g茚三酮+95%乙醇至2000ml溶液。2）（強(qiáng)酸）0.01NHCl（500ml）：5ml1NHCl+H2O495ml。3）(10ml離心管)標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液：Lys、Ser、Pro、Val、Leu、五種混合物各0.1g+50ml0.01NHCl。（4） 正丁醇8瓶，95%乙醇3瓶，88%甲酸2瓶。2．器材：1）19×21cm濾紙48張（2）層析缸48個(gè)（3）噴霧器2個(gè)（4）電吹風(fēng)48把（5）毛細(xì)管100支(6)針數(shù)支。（十）實(shí)驗(yàn)十九、酪蛋白的制備1．試劑：（1）(白色60ml)牛乳（6000ml）：600g牛奶加水至6000ml溶液。（2）（白色125ml）醋酸鈉緩沖液壓0.2MpH4.6（4000ml）：980mlNaAc+1020mlHAc0.2MNaAc：41gNaAc+H2O至2500ml溶液。0.2MHac：30mlHAc+H2O至2500ml溶液。（3）0.15MNaCl（200ml）：1.755g+H2O至200ml溶液。溶）.15MNaCl（00ml）.755g+H2O至00ml4）乙醇：6瓶。5）乙醚：5瓶。2．器材：（1）恒溫水浴鍋12臺(tái)（2）722分光光度計(jì)25臺(tái)3）細(xì)布20cm×20cm×26塊（4）布氏漏斗+3）細(xì)布20cm×20cm×26塊（4）布氏漏斗+抽濾瓶4套（5）PH試紙3.8—5.412本（6）酸度計(jì)4臺(tái)（7）臺(tái)式離心機(jī)12臺(tái)（8）鐵架臺(tái)+鐵圈抽濾瓶4套（6）酸度計(jì)4臺(tái)。（十一）實(shí)驗(yàn)十、血清膽固醇的定量測(cè)定1．試劑：1）PSFe試劑（500ml）：0.75g三氯化鐵+7.5ml磷酸+492.5ml硫酸。（2） 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液（ 0.08mg/ml）：0.02g膽固醇+250ml無水乙醇溶解。（3） 無水乙醇：2瓶。2．器材：（1）722分光光度計(jì) 25臺(tái)（2）臺(tái)式離心機(jī) 12臺(tái)。（十二）實(shí)驗(yàn)二十六、維生素

C的測(cè)定1．試劑：1）0.02M的I2-KI溶液10000ml。(白色60ml)5mg/ml的維生素C500ml：2.5g+H2O至500ml。（白色滴瓶）2%淀粉500ml：10g+H2O至500ml。彌猴桃3斤。2．器材：（1）鐵架臺(tái)+蝴蝶夾48套（2）滴定管 48支（3）搗碎機(jī)12臺(tái)（4）小刀數(shù)把。（十三）實(shí)驗(yàn)九、粗脂肪的測(cè)定1、試劑：（1）乙醚。 （2）奶粉。2、器材：（1）脂肪測(cè)定儀 4臺(tái)。（十四）實(shí)驗(yàn)十八、血清蛋白質(zhì)醋酸纖維薄膜電泳1、試劑：（1）新鮮血清。（2） 巴比妥-巴比妥鈉buffer（pH8.6，0.07M，離子強(qiáng)度0.075）：1.66g巴比妥+12.76g巴比妥鈉+H2O至1000ml。3）（貝塞試劑瓶）染色液：0.5g氨基黑10B+40mlH2O+50ml甲醇+10ml冰醋酸，混勻。4）透明液：25ml冰醋酸+75ml95%乙醇。5）漂洗液：45ml乙醇+5ml冰醋酸+50mlH2O。2、器材：（1）平板電泳槽 4臺(tái)（2）濾紙12cm1盒（3）刀片12片。（十五）分光光度法 -高錳酸鉀吸收曲線的繪制1、試劑：（1）0.0125%KmnO4 (100ml) ：0.0125gKmnO4加水至100ml。2、器材：（1）722分光光度計(jì) 25臺(tái)。樣 品 液50ml）

（十六）實(shí)驗(yàn)二十五、核酸的含量測(cè)定二苯胺顯色法測(cè)定 DNA的含量和地衣酚顯色法測(cè)定 RNA的含量（測(cè)試）1．試劑：（1）DNA標(biāo)準(zhǔn)液（1000ml，200μg/ml）：取DNA鈉鹽0.2g以0.01NNaOH溶解至1000ml溶液。2）樣品液：用0.01NNaOH沖稀或用0.05gDNA溶解至500ml溶液。3）二苯胺試劑（4000ml，分2瓶）：40g二苯胺+4000ml冰乙酸+400ml高氯酸；先配100ml1.6%乙醛(1.6ml原液加水至 100ml)，臨用前 2000ml加20ml。4）RNA標(biāo)準(zhǔn)液（1000ml）：取0.1g加水至1000ml。5）RNA樣品液（500ml）：取0.03g加水至500ml。（6）地衣酚試劑（ 2000ml，分2瓶）：2g三氯化鐵加濃鹽酸至 2000ml溶液。臨用前1000ml加1g地衣酚。2．器材：（1）恒溫水浴鍋12臺(tái)（2）722分光光度計(jì)25臺(tái)（3）座標(biāo)紙48張。紫外吸收法測(cè)定核酸含量（RNA）(考試)1．試劑：1）0.1NNaOH100ml。2）0.05NNaOH100ml。（3）（白色250ml）RNA空白液：0.1NNaOH2ml+0.05NNaOH4ml+H2O至3000ml。（4）（白色250ml）標(biāo)準(zhǔn)RNA液50ug/ml：0.15g+0.1NNaOH2ml+0.05NNaOH4ml+H2O至3000ml。（5）（白色60ml試劑瓶）待測(cè)液20種RNA。12345678910111213141516171819202122232425標(biāo) 準(zhǔn) 液 35 34 33 32 31 30 29 28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 35 34 33 32 31ml）空 白 液 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 15 16 17 18 19ml）非考試版1、待測(cè)液：5mgRNA用0.1NNaOH2ml使之溶解，再加0.05NNaOH4ml，然后用蒸餾水定容250ml，分裝6瓶（待測(cè)RNA）,(RNA50ug/ml)2、空白對(duì)照液：0.1NNaOH2ml+0.05NNaOH4ml+H 2O至250ml，分裝 6瓶。2．器材（1）752分光光度計(jì) 24臺(tái)。十二、考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度2．1試劑(1)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（500ml）OD1cm1%結(jié)晶牛血清白蛋白，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定